Ogólny sposób wpisywania programu termogramatora:
nazwanie programu: klikamy przycisk enter → wpisujemy nazwę naszego programu → klikamy przycisk enter
wybór temperatury: wybieramy „Block” i klikamy enter → wybieramy „Segment 1” → wybieramy „Hold” → wpisujemy temperaturę i czas potwierdzając enterem → klikamy przycisk enter → wybieramy „Cycle” → klikamy przycisk eneter → „3 step” → klikamy przycisk enter → wpisujemy temperaturę i czas potwierdzając enterem → klikamy przycisk enter → option? Wybieramy „NO” → wpisujemy temperatury i czasy potwierdzając enterami → krok 3 → w „Cycle” wpisujemy ilość cykli → klikamy przycisk enter → wybieramy „Hold” → wpisujemy temperaturę i czas potwierdzając enterem → segment 5. : wybieramy „END” → Save? Wybieramy „Yes”
Warunki na których uczyliśmy się obsługi termocyklera:
1. Wstępna denaturacja: 4 minuty 95⁰C
2. Denaturacja: 40 sekund 96⁰C
3. Dołączenie primerów: 40 sekund 50⁰C 34 cykle
4. Elongacja: 1 minuta 71⁰C
5. Wydłużanie końcowe: 2,5 minuty 71⁰C
Właściwe warunki w jakich było przeprowadzone ćwiczenie:
1. Wstępna denaturacja: 2 minuty 96⁰C
2. Denaturacja: 30 sekund 96⁰C
3. Dołączenie primerów: 30 sekund 55⁰C 40 cykli
4. Elongacja: 30 sekund 72⁰C
5. Wydłużanie końcowe: 2 minuty 72⁰C
6. ∞ 4⁰C
Wpisywanie programu termocyklera użytego w ćwiczeniu:
nazwanie programu: klikamy przycisk enter → wpisujemy nazwę naszego programu → klikamy przycisk enter
wybór temperatury: wybieramy „Block” i klikamy enter → wybieramy „Segment 1” → wybieramy „Hold” → wpisujemy temperaturę (96⁰C ) i czas (2 minuty) potwierdzając enterem → klikamy przycisk enter → wybieramy „Cycle” → klikamy przycisk eneter → „3 step” → klikamy przycisk enter → wpisujemy temperaturę i czas potwierdzając enterem → klikamy przycisk enter → option? Wybieramy „NO” → wpisujemy temperaturę i czas potwierdzając enterami → krok 3 → w „Cycle” wpisujemy ilość cykli → klikamy przycisk enter → wybieramy „Hold” → wpisujemy temperaturę i czas potwierdzając enterem → segment 5. : wybieramy „END” → Save? Wybieramy „Yes”
Amplifikacja DNA metodą PCR:
-umożliwia specyficzną amplifikację in vitro wybranych odcinków DNA i RNA przepisanych na cDNA
dzięki wykorzystaniu dwóch starterów komplementarnych co do sekwencji docelowej
- niezbędna jest znajomość sekwencji nukleotydowej
- czułość reakcji pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów (fragmentów DNA) ponad 1 milion
razy mimo obecności innych sekwencji
Co jest potrzebne do przeprowadzenia amplifikacji DNA metodą PCR i do czego?:
1. Jednoniciowe DNA/cDNA – matryca
2. Dwa startery komplementarne do matrycy – ograniczają długość syntetyzowanego łańcucha
3. dNTP – substraty reakcji dostarczają energii do jej przebiegu
4. Termostabilna polimeraza DNA Taq lub Hypernova – enzym katalizujący reakcję
5. Kationy Mg2+ - wpływają na prawidłowy przebieg procesu hybrydyzacji oraz na aktywność enzymu
polimerazy, mają pozytywny wpływ na ilość i jakość uzyskanego produktu
6. Bufor reakcyjny – uzupełnienia niezbędne do aktywności enzymu jony metali (Mg lub K)
Reakcja amplifikacji DNA składa się z powtarzających się cykli a każdy z nich z trzech etapów:
1. Denaturacja dwuniciowego DNA – rozplecenie podwójnej helisy DNA matrycowego w 92-96⁰C
2. Przyłączenie starterów do komplementarnych sekwencji zdenaturyzowanej matrycy DNA w 32-
37⁰C
3. Wydłużenie starterów – polega na dołączeniu począwszy od wolnego końca 3’ – OH startera,
nukleotydów komplementarnych względem amplifikowanej nici DNA w 72⁰C