INSEMINACJA

• Inaczej sztuczne unasienienie = zapładnianie zwierząt hodowlanych poprzez wprowadzenie uprzednio pobranego nasienia samca do dróg rodnych samicy.

• Pozwala wykorzystać na dużą skalę spermę najwartościowszych samców.

• Proces sztucznego unasieniania składa się z następujących etapów:

  1. Pobieranie nasienia.

  2. Badanie nasienia.

  3. Rozrzedzanie i konfekcjonowanie nasienia.

  4. Przechowywanie nasienia.

  5. Rozprowadzanie nasienia po punktach inseminacyjnych.

  6. Unasienianie samic.

ZALETY SZTUCZNEGO UNASIENIANIA

• Możliwość unasieniania nasieniem pobranym od samca znacznie większej liczby samic.

• Większa liczba uzyskiwanego nasienia.

• Dokładniejsza ocena wartości hodowlanej ojców.

• Możliwość wykorzystania nasienia samca po jego śmierci.

• Unikanie chorób związanych z naturalnym kryciem.

• Możliwość transportu nasienia na duże odległości.

• Niższe koszty zakupu nasienia niż zakupu i utrzymania samca.

• Unasienianie samicy nasieniem samca, który nie chce wykonać skoku na daną samicę.

• Szybkie i łatwe uzyskanie postępu hodowlanego, nie tylko w oborach elitarnych, ale także w pogłowiu masowym, dzięki temu, że od jednego samca przygotowuje się kilkadziesiąt tysięcy dawek nasienia w roku i tyle też samic można nimi unasienić.

• Możliwość korzystania z nasienia samców o najwyższym potencjale genetycznym i produkcyjnym, bez względu na to w jakim kraju lub kontynencie się znajduje.

• Możliwość realizowania przez hodowcę różnych koncepcji hodowlanych lub produkcyjnych np. podnoszenie ilości i jakości mleka i poprawianie jego składu, produkcja określonego typu materiału rzeźnego poprzez dobór buhajów o odpowiednich parametrach wyceny.

• Pewność, że nasienie użyte do inseminacji pochodzi od samców zdrowych, pozostających pod stałym nadzorem weterynaryjno-lekarskim, a zabieg unasieniania jest wykonywany w sposób perfekcyjny, nie zagrażający zainfekowaniem samicy.

• Oszczędność sił i czasu hodowcy-właściciela samicy, ze względna na to, że inseminator dojeżdża do jego zagrody i na miejscu, w oborze, wykonuje zabieg unasieniania.

PODSTAWA SKUTECZNOŚCI UNASIENIANIA

1. Ginekologicznie zdrowa samica.

2. Nasienie odpowiedniej wartości biologicznej.

3. Odpowiedni moment wprowadzenia nasienia do dróg rodnych.

INSEMINACJA BYDŁA

• Inseminacja bydła ma w Polsce ponad 50–letnia tradycję i dziś trudno sobie wyobrazić, by któryś z hodowców zrezygnował z tej metody.

• Zasięg i znaczenie inseminacji szczególnie wzrosły z chwilą wprowadzenia do praktyki metody przechowywania nasienia w temperaturze -196 stopni. Czas i odległość dzielące kojarzonych ze sobą partnerów przestała mieć jakiekolwiek znaczenie.

• Inseminator dysponuje nasieniem różnych buhajów ras mlecznych praz mięsnych zapewniając możliwość doboru buhajów do indywidualnych skojarzeń.

• Polskie firmy inseminacyjne proponują do wyboru wysokiej jakości nasienie buhajów oferowane w katalogu buhajów, które są wydawane dwa razy do roku po każdej wycenie szacowanej wartości hodowlanej buhajów.

Wybór optymalnego czasu inseminacji:

• Ruja u krowy trwa 6-36 h, średnio 24 h, owulacja bez względu na czas trwania rui około 30h od początkowych objawów rui, z tego względu owulacja raz będzie pod koniec cyklu, innym razem kilka godzin po zakończeniu zewnętrznych objawów rui.

• Unasienianie wykonujemy na 15-18 h od początkowych objawów rui, praktycznie unasienia się samice wieczorem, jeśli pierwsze objawy rui pojawiły się rano lub następnego dnia rano, jeśli pojawiły się wieczorem. Reinseminacja (ponownie unasienienie) powinna odbywac się 12 h od inseminacji.

• Okres okołorujowy trwa około 2,5 doby.

  • Faza przedrujowa (narastanie aktywności seksualnej).

  • Faza właściwa (najwyższa aktywność płciowa).

  • Faza porujowa (wygasanie aktywności płciowej).

WYKRYWANIE RUI

Najbardziej dogodna metoda – obserwowanie zwierzęcia cztery razy w ciągu doby.

Pedometr. Urządzenie rejestrujące zwiększoną ruchliwość krowy charakterystyczną dla rui. Skuteczność około 80%

KAMAR. Urządzenie znaczące umieszczone na grzbiecie zwierzęcia. W przypadku obskakiwania takiej krowy kapsułka z farbą ulega przerwaniu i zostawia czerwony znak na grzbiecie. Skuteczność 90%.

Użycie próbnika – buhaja z operacyjnie przemieszczonym prąciem bądź krowy jałówki poddanej hormonalnej terapii testosteronem lub estrogenem. Może to być krowa z cystowatością jajników. W ten sposób zauważamy krowy z odruchem tolerancji.

Pomiar oporności śluzu pochwowego. U zwierzęcia znajdującego się poza rują poziom oporności śluzu jest wysoki, w miarę zbliżania się rui poziom oporności spada, by w szczytowej fazie rui wynosić 200 jednostek i mniej. Należy uchwycić minimum, a następnie moment gwałtownego wzrostu. Wzrost oznacz, że owulacja powinna nastąpić w czasie od kilku do kilkunastu godzin – najlepszy czas na unasienianie.

Test arboryzacji ze śluzem szyjkowym – za podstawę tej metody przyjęto zwiększanie ilości NaCl i mikroproteidów w śluzie szyjkowym. W okresie działania estrogenów NaCl wykrystalizowuje w rozmazie w postaci liści paproci.

Tresowane psy – uczą się rozpoznawać i sygnalizować zapach charakterystyczny dla feromonów rujowych (skuteczność 80-87%).

PRZYGOTOWANIE NASIENIA DO UNASIENIANIA BYDŁA

Nasienie mrożone w kulkach – po uprzednim upewnieniu się, że krowę można unasieniać, do termostatu wkładamy do ampułki z płynem fizjologicznym o objętości 1ml (szeroka szyjka ampułki) i następnie wyjmujemy 1 lub 2 kulki nasienia i umieszczamy w otwartej fiolce z płynem fizjologicznym , utrzymujemy w termostacie o temperaturze 37-39 stopni przez 30 min. W tym czasie kulki ulegają ogrzaniu i rozpuszczeniu do wyżej wymienionej temperatury. Tak przygotowane nasienie nabieramy do pipety inseminacyjnej i wprowadzamy do szyjki macicy, po uprzednim sprawdzeniu jej drożności.

Trzeba mieć wprawę, aby prawidłowo zaaspirować nasienie do pipety. Nie może być pęcherzyków powietrza, a słupek nasienia powinien znajdować się około 1 cm od końca pipety.

Nasienie mrożone w słomkach – rozmrażamy nasienie w łaźni wodnej w temperaturze 37-38 stopni przez 15-30 minut. Wyjmujemy z łaźni, osuszamy ligniną, obcinamy zatopiony koniec słomki, a następnie umieszczamy ją w tzw. Pistolecie inseminacyjnym. Dalsze postępowanie jest analogiczne, jak przy nasieniu w kulkach.

SPOSOBY UNASIENIANIA

Metoda oburęczna duńska – środkiem dezynfekującym np. nadmanganianem potasu obmywamy zewnętrzne narządy płciowe. Lewą ręką w rękawicy do badania rektalnego wprowadzamy do prostownicy i chwytamy za szyjkę macicy. Prawą ręką wprowadzamy do pochwy pistolet inseminacyjny i dochodzimy do szyjki macicy. Następnie odpowiednio manipulując prawą ręką podciągamy szyjkę macicy ku przodowi. Ręką lewą wprowadzamy przyrząd inseminacyjny do kanału szyjki macicy i deponujemy nasienie. Przy pewnej wprawie i częściowo otwartej szyjce macicy wejście do kanału szyjki nie nastręcza większych problemów.

UNASIENIANIE KLACZY

Wybór optymalnego czasu inseminacji – trzeba uwzględnić dwa warianty:

• Nie musimy się liczyć z ilością nasienia.

• Mamy tylko jedną lub dwie porcje wybitnego nasienia od ogiera.

Klacze unasieniamy świeżym rozrzedzonym lub mrożonym nasieniem. Ruja u klaczy trwa 3 do 12 dni. Idealnie by było trafić z inseminacja na 12 godzin przed owulacją. Owulacja u klaczy występuje zazwyczaj na 24-28 godzin przed końcem rui, stąd inseminację u klaczy, które mają krótkie ruje przeprowadza się już w pierwszym dniu trwającej rui. Lepiej unasienić cztery dni za wcześnie, niż jeden dzień po owulacji.

KONTROLA OWULACJI

Kliniczna ocena wielkości i napięcia ścian pęcherzyka jajnikowego F0-F4. Ocena wielkości pęcherzyka przez USG.

Inseminacja nasieniem mrożonym jest najbardziej skuteczna na sześć godzin przed owulacją. W przypadku inseminacji po owulacji wrasta odsetek zamierających zarodków nawet do 34% (prawidłowo wynosi 14%). Najpóźniej do zapłodnienia (nie mylić z zaplemnieniem) powinno dochodzić do 30 h po owulacji. Późniejsze zapłodnienie to wysoki wzrost śmiertelności zarodków. Jeżeli do owulacji dojdzie dopiero po upływie 12-18 h od chwili inseminacji – kontrola USG, powinno się powtórzyć inseminację. Optymalny wynik zaźrebień uzyskujemy jeśli unasieniamy 12 h przed i 6 h po owulacji.

Nasienie mrożonej jest zazwyczaj konfekcjonowane w aluminiowych pojemnikach (20-50 ml oraz minimalnie 300 mln plemników w dawce inseminacyjnej) lub słomkach (słomki duże 4,5 ml, 120-150 mln plemników/1ml) stosując małe słomki należy użyć nawet około 8 słomek do jednorazowego unasieniania. Rozmrażanie w temperaturze 37 stopni przez 30 min (słomki małe) lub 40 stopni przez 1 min (słomki duże). Należy wspomnieć, że nasienie tylko około 25% ogierów nadaje się do mrożenia i późniejszej inseminacji.

Wyróżniamy dwie metody unasieniania klaczy:

• Metoda ręczna.

• Metoda z użyciem wziernika.

Po odpowiednim przygotowaniu nasienia wlewamy nasienie ze słomek na podgrzaną płytkę Petriego i nabieramy do pipety inseminacyjnej przy pomocy strzykawki. Po naciągnięciu wprowadzamy ejakulat do kanału szyjki macicy jedną z wyżej wymienionych metod. Podczas wykonywania zabiegu należy zwrócić szczególną uwagę na aseptykę, ze względu na możliwość wtórnego zakażenia macicy.

Inseminacja klaczy w porównaniu z kryciem naturalnym umożliwia unasienianie grzejącej się samicy w różnych miejscach o różnym czasie, bez konieczności doprowadzania do ogiera ora zapobiega infekcjom, takimi chorobami, jak zaraza stadnicza, otręt, zakaźne zapalenie macicy i inne zakażenia niespecyficzne.

Przy użyciu nasienia mrożonego zaleca się unasieniać loszki 16-20 h od rozpoczęcia rui, natomiast lochy 22-26 godzin. Reinseminacja po 12 godzinach.

Jedna dawka do unasieniania nasieniem mrożonym powinna zawierać około 2-3 miliardów plemników ruchliwych, ponieważ do 40% plemników traci ruch po zamrożeniu. Wyniki unasienienia nasieniem mrożonym są niższe o około 20-30%. W Polsce używamy nasienia w stanie płynnym, schłodzone do 10-16 stopni w ilości 100ml, dawka zawiera około 3x10⁹ plemników.

UNASIENIANIE TRZODY CHLEWNEJ

Wykrywanie rui – najpewniejsza metoda to obserwacja zachowania lochy w obecności knura. Próba dosiadania wraz z obserwacją sromu (świnia pozostaje w bezruchu oraz występuje obrzęk i zaczerwienienie sromu). Metody pomocnicze to głos knura nagrany na taśmie magnetofonowej lub pomiar oporności śluzu.

Ruja u świń zazwyczaj trwa 48-72 godziny. Owulacja w normalnych warunkach występuje w 43 godzinie od początku rui (36-55 godzina). Podczas owulacji dochodzi do pękania wielu pęcherzyków jajnikowych. Czas, w którym pękają wszystkie pęcherzyki od pierwszego do ostatniego wynosi 1,8 godziny i nie jest uzależniony od ilości pęcherzyków.

Metody unasieniania

• Gotowe nasienie w pojemniku plastikowym (różny kształt) podłączamy do kateteru inseminacyjnego umieszczonego uprzednio w drogach rodnych samicy (przez odpowiednie przekręcanie kateteru w lewą stronę).

UNASIENIANIE OWIEC I KÓZ

Ruja u owiec trwa 3-84 godzin (zwykle 24-36 godzin), natomiast u kóz 36 godzin (+/- 8,1 godziny). Owulacja natomiast występuje na 20-40 godzin u owiec (średnio 24-27 godzin) od początkowych objawów rui, u kóz 30-36 godzin od rozpoczęcia zewnętrznych objawów rui.

Wykrywanie rui – obserwacja samic, zauważenie zewnętrznych objawów, tzn. przekrwienie i nieznaczny obrzęk sromu (czasami niezauważalne). Bardziej charakterystyczne jest zachowanie maciorki w obecności tryka lub próbnika – odruch tolerancji, które rozpoznają bezbłędnie nawet samice bez widocznych objawów (cicha ruja) bardzo często występującej zarówno u owiec, jak i kóz.

Przygotowanie nasienia do inseminacji – W Polsce dostępne jest nasienie tryka przechowywane:

• W stanie płynnym, odpowiednio rozrzedzane i schłodzone do temperatury 0-5 stopni lub 10-15 stopni.

• W stanie zamrożenia w postaci kulek, słomek i ampułek podobnie jak u buhaja. Przed mrożeniem nasienie tryka rozrzedza się obecnie w 32 różnych rozrzedzalnikach, co zmniejsza zamieralność plemników podczas mrożenia.

• Przygotowanie nasienia do inseminacji podobnie jak u buhaja.

Metody unasieniania – optymalny czas inseminacji lub krycia maciorek to 12-24 godziny od pierwszych objawów rujowych.

Nasienie można deponować do rożnych części narządu rodnego, stąd wyróżniamy trzy metody unasieniania:

• Unasienianie doszyjkowe. Najczęściej stosowane; po unieruchomieniu maciorki w specjalnym stanowisku lub jej przytrzymaniu przez pomocnika wprowadzamy do pochwy rozwieracz, co przy użyciu źródła światła uwidacznia zewnętrzne ujście szyjki macicy. Następnie pipetę inseminacyjną wprowadzamy do kanału szyjki macicy na 0,5-1 cm i wstrzykujemy nasienie.

• Unasienianie dopochwowe. Stosuje się zazwyczaj u dziewiczych owiec, u których wprowadzenie wziernika jest utrudnione. Pipetę inseminacyjną wprowadzamy po górnym sklepieniu pochwy do oporu i wstrzykujemy nasienie.

• Unasienianie domaciczne. Rzadziej wykonywane ze względu na swoja inwazyjność. Możliwe jest wprowadzenie nasienia do macicy dwiema drogami: przez szyjkę macicy (używając wziernika i kleszczy do przytrzymania szyjki, wówczas długą igłą umieszczona na pipecie przechodzimy przez szyjkę i wprowadzamy nasienie do macicy) oraz bezpośrednio do macicy (rogu lub trzonu) po uprzedniej laparotomii lub przy zastosowaniu laparoskopii.

UNASIENIANIE PSÓW

Wybór optymalnego czasu krycia:

• Rozmazy pochwowe.

• Pomiar poziom hormonów” progesteronu (wzrost do 1-3 ng/ml, przypada na okres przedowulacyjnego wylewu LH) w czasie owulacji 2-8 ng/ml w czasie 10-30 dni po owulacji jest najwyższy poziom 15-80 ng/ml, natomiast w annostrus 0,2-0,5 ng/ml. Owulacja następuje 24-72h (36-50) po wylewie LH. Wartość tego hormonu w okresie szczytu przedowulacyjnego wynosi 8-50 ng/ml (średnio 20) i szczyt ten trwa 24-72 godziny.

• Obserwacja zachowania się suki – tolerancja na samca.

• Zmniejszanie się obrzęku sromu i brak krwawienia charakterystycznego dla okresu przedrukowego.

• Mierzenie oporności śluzu – aparat Dramińskiego.

• Test arboryzacji ze śluzem szyjkowym.

W odróżnieniu od innych gatunków zwierząt, pęcherzyki jajnikowe w momencie owulacji są w stadium dalece zawansowanego procesu luteinizacją tak, że można je uznać za gwałtownie rozwijające się ciałka żółte. Oocyty podczas owulacji są niedojrzałe. Dojrzewanie zachodzi w ciągu 2 dni po owulacji, oocyty zdolne są do zapłodnienia po okresie około 60 godzin po owulacji i 80-180 godzin po piku Lh.

Owulacja następuje, gdy oocyt jest w stadium pęcherzyka zarodkowego przed wyrzuceniem pierwszego ciałka kierunkowego czyli przed ukończeniem pierwszego podziału mejotycznego, który następuje najczęściej dopiero po 48 godz. Drugi podział redukcyjny - po wniknięciu plemnika. Oocyt zachowuje zdolność do zapłodnienia przez ok. 5 dni (nawet do 10 dni). Plemniki po kopulacji są ruchliwe w jajowodach i macicy jeszcze przez ok. 11 dni (268 godz.), ale zdolność do zapłodnienia zachowują przez średnio 2-3 dni (do 6-7 dni). Dwukrotne krycie lub unasienianie od pierwszego dnia przed owulacyjnym wylewem LH (dzień 0) aż do 5 lub 6 dnia po piku LH zapewnia optymalne wyniki zapłodnień.

Przygotowanie nasienia do inseminacji

Nasienie psów może być użytkowane w trzech postaciach:

• Nasienie świeże rozrzedzone lub nierozrzedzone; używane jest najczęściej, gdy niemożliwe jest pokrycie suki (suka agresywna, pies niechętny do krycia itd.)l rozrzedzanie zapewnia lepsza płodność; rozrzedza się 1:3 lub 1:8 w zależności od koncentracji: dawka inseminacyjna 2-10 ml w tym 100-150 mln plemników na 1ml.

• Nasienie schłodzone w łaźni wodnej do 5-10 stopni może być użyte do inseminacji przez około 21 godzin lub schłodzone do 4 stopni może być użyte przez 4-5 dni.

• Nasienie mrożone – stosunkowo niska płodność w stosunku do nasienia płynnego; do konserwacji nasienia psa przez mrożenie używa się najczęściej rozcieńczalnika (tris-gruktozo-cytrynianowego z glicerolem i żółtkiem jaja kurzego).

Procedura zamrażania:

Rozrzedzone nasienie wyżej wymienionym rozcieńczalnikiem bez glicerolu w stosunku 1:2, 1:5 ochładza się z 32 stopni do 4 stopni w ciągu 30 minut. Następnie dodaje się glicerol obecny w drugiej części rozrzedzalnika i poddaje ekwilibracji w ciągu 2 godzin w 4 stopniach. Napełnia się słomki o pojemności 0,5 ml i zamraża w parach ciekłego azotu – 9 minut, a następnie przechowuje się w ciekłym azocie w temperaturze -196 stopni.

Mrożenie w kulkach – na płytkach suchego lodu, a następnie umieszcza się w ciekłym azocie.

Kriokonserwacja nasienia – konserwacja nasienia w stanie głębokiego zamrożenia.

Proces rozmrażania

Istnieją różne sposoby rozmrażania w zależności od zastosowanej metody zamrażania.

W przypadku konserwacji w kulkach najlepsze wyniki dalej szybkie rozmrażanie w 2,5 ml płynu fizjologicznego o temperaturze 37 stopni. Dobre wyniki daje również stosowanie kulek w ilości zapewniającej uzyskanie dawki inseminacyjnej w 10 ml płynu fizjologicznego o temperaturze 65 stopni.

W konserwacji za pomocą metody słomkowe z użyciem rozpuszczalnika opartego na buforze Tris stosowane są dwie metody:

• Gwałtowne ogrzewanie słomek w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni przez 6 sekund bez potrzeby dodatkowych rozcieńczeń.

• Ogrzewanie w łaźni wodnej o temperaturze 35 stopni przez 30-45 sekund.

Techniki unasieniania:

• Dopochwowe.

• Domaciczne. Możemy podzielić na dwie grupy:

  • Niechirurgiczne. Zaliczamy metodę wykorzystującą kateter norweski, metodę przy użyciu kateteru Foleya, metody endoskopowe.

  • Chirurgiczne. Zaliczamy inseminację chirurgiczną i metodę laparoskopową.