Molekularne analizy rytmu okołodobowego ssaków.

Streszczenie:

U ssaków główny (centralny) zegar okołodobowy znajduje się w jądrach nadskrzyżowaniowych (SCN) ulokowanych w przedniej części podwzgórza. Zegar SCN jest skonstruowany z wielu pojedynczych oscylatorów jakimi są komórki, które kiedy są zsynchronizowane, generują skoordynowane sygnały wyjściowe rytmu okołodobowego. Zostało sklonowanych osiem genów zegarowych, które są zaangażowane w interakcje transkrypcyjno/translacyjne sprzężeń zwrotnych składających się na mechanizm zegarowy. Codzienny cykl światła i ciemności ostatecznie jest koordynowany przy udziale dwóch genów., które są zdolne do zerowania (rozpoczynania od nowa) centralnego mechanizmu zegarowego w SCN. Kontrolowane przez zegar geny są także generowane przez centralny mechanizm zegarowy, ale ich białkowe produkty ulegają przeniesieniu do dalszych działań. Obwodowe oscylatory są kontrolowane przez SCN i zapewniają lokalną kontrolę ujawniającej się zewnętrznie ekspresji rytmu. Lepsze zrozumienie mechanizmów komórkowych i molekularnych mechanizmu zegarowego SCN może umożliwić manipulacje farmakologiczne synchronizacją okołodobową w przyszłości.

WPROWADZENIE:

Badania, które analizują zegar okołodobowy są prowadzone dniem i nocą, aby odkryć mechanizmy, które składają się na działanie naszego zegara biologicznego. Ostanie odkrycia są godne uwagi. Przez ostatnie cztery lata zostało sklonowanych osiem genów, które są gruntownie zaangażowane w działanie zegara okołodobowego. Teraz mamy twarde podstawy w postaci molekularnego szkieletu zegara okołodobowego, dzięki któremu funkcje genów zegarowych i ich produktów białkowych mogą zostać umiejscowione – nad tym właśnie skupia się ten przegląd.

Czyli czym w istocie są rytmy okołodobowe?

Są one wewnętrznym wyrażeniem wewnętrznego mechanizmu czasowego, który odmierza upływający czas dnia. Zegary okołodobowe są naturalnie ustawione albo nastawiany stosowne przez cykliczne sygnały ze środowiska, na czele z okresowymi cyklami światło-ciemność, będącymi najsilniej odbieranymi bodźcami u ssaków. Wykazywany rytm zegara okołodobowego potwierdza, że rytmy okołodobowe uwidocznione w fizjologii i zachowaniu ssaków są skoordynowane do 24 h dnia.

Jądra nadskrzyżowaniowe (SCN) stanowią miejsce centralnego zegara okołodobowego w mózgu ssaków, który generuje rytmy okołodobowe. SCN są małymi sparowanymi strukturami w przedniej części podwzgórza zaraz nad chiazmami optycznymi. Każde jądro zawiera około 10.000 neuronów. Jądra są strategicznie położone dla odbierania wejściowych wizualnych bodźców sygnałów światła i ciemności, oddziałując zarówno bezpośrednio jak i pośrednio szlakami siatkówka-SCN.

Większego zrozumienia molekularnej kontroli mechanizmów zegara okołodobowego zwierząt tkankowych, zostały wykonane u muszki owocowej, Drosophila melanogaster, molekularne analizy zegara Drosophila, które zostały zrewidowane dogłębniej przez Wilians’a i Sehgal’a w tym tomie. Istnieje duże podobieństwo między mechanizmami jądra zegara u Drosophili i u myszy, w obu zegarach występują zazębiające się dodatnie i ujemne (pozytywne i negatywne) transkrypcyjno/translacyjne sprzężenia zwrotne. Występują również różnice, chociaż tylko w molekularnych szczegółach tego jak sprzężenia działają pomiędzy tymi dwoma rodzajami. Te różnice są wyszczególnione w opisanym poniżej systemie ssaków.

Posługując się analizami mutacji, ekranami interakcji białek i analizą homologii, homologi wielu genów, zaangażowanych w mechanizm zegarowy, zostały sklonowane u ssaków (tabela 1). Jednakże w toku ewolucji zaszły istotne zmiany przeznaczenia określonych funkcji miedzy kilkoma strukturalnie homologicznymi elementami zegara okołodobowego muszki owocowej i myszy.

TABELA 1: Wykaz istotnych genów zegara

a – mutacja powodująca zmiany rytmu fenotypu (zaburzające rytm)

b – brak ortologu zidentyfikowanego u ssaków

c – mutacja null (zerowa) – embrionalnie śmiertelna

d – możliwość funkcji zegarowej, ale jeszcze nie wykazana

Powielenie genów doprowadziło także do większej złożoności genów zegarowych wśród ssaków, u Drosophili większość genów zegarowych jest reprezentowana przez dwa lub więcej homologów u ssaków.

Mechanizm zegarowy jądra nadskrzyżowaniowego jest komórkowo autonomiczny.

Poszczególna oscylacyjna machineria jest zawarta w pojedynczym neuronie SCN i jest możliwe, że wszystkie 20 tys. komórek, które tworzą zegar SCN są komórkami zegara. Komórkowo0autonomiczna natura zegara SCN została odkryta przez Welsch’a i wsp., przy użyciu systemu hodowli rozproszonej na macierzy mikroelektrodowej, w której samoistne zmiany potencjałów pojedynczych nerwów mogą być rejestrowane z przez tygodnie. Badania przy użyciu tego systemu nad chomikami mutantami tau i myszami mutantami Clock wykazały, ze zmiany genetyczne dobowego okresu (długości cyklu) uwidaczniają się już w pojedynczej komórce zegara. Najnowsze badania wykazały, że dzienne wahania w reagowaniu SCN na czynniki zmieniające fazę (dawcy czasu) przejawiają się w neuronach zegara. Tak więc istnieją dwie cechy charakterystyczne rytmu zegarowego: długość okresu i rytmiczna wrażliwość na bodźce zerowania (resetujące), są właściwościami pojedynczej komórki zegara. Komórkowo-autonomiczne natura mechanizmu zegarowego SCN skupia uwagę na wewnątrzkomórkowych sprzężeniach i molekularnych składnikach, które ją tworzą (na międzykomórkowych również).

Przegląd molekularnego mechanizmu zegarowego.

Krótki przegląd molekularnych mechanizmów zegarowych myszy jest umieszczany jako pierwszy, po którym następują analizy szczegółów.

Jak już wspomniano, wewnątrzkomórkowe mechanizmy zegarowe SCN polegają na interakcji dodatnich i ujemnych sprzężeń zwrotnych na poziomie transkrypcji i translacji (rys.1)

Ujemne sprzężenia zwrotne polegają na dynamicznej regulacji przez trzy geny Period (periodu) (u myszy mPer 1-3) i dwa geny Cryptochrome (krytpochromowe) (u myszy mCry1 i mCry2). Rytmiczna transkrypcja genów mPer i mCry jest prowadzona przez podstawową helisę-skręt-helisę (basic helix-loop-helix – bHLH) – PER-ARNT-SIM (PAS), zawierające białko czynne transkrypcyjnie CLOCK i BMAL1 [PAS jest skrótem od pierwszych trzech odkrytych białek zawierających tą ważną czynnościowo domenę dimeryczną białka: u Drosophila PER, u człowieka receptor węglowodorów arylowy jądrowego translokatora (ARNT) i u Drosophili „białko zdeterminowane” single-minded protein (SIM)].

Białka zawierające domeny PAS stanowią różne rodziny i domeny białek, PAS są także współną cechą związanych zegarowo białek u różnych organizmów (rośliny, grzyby, owady i ssaki).

Jak tylko białka mPER i mCRY ulegają translacji, tworząc multimetryczne kompleksy, które są przenoszone do jądra. W jądrze, białka mCRY działają jako ujemne regulatory przez bezpośrednią interakcję z CLOCK i/lub BMAL1 hamując transkrypcję.

W tym samym czasie mPER2 przyczynia się do rytmicznej transkrypcji Bmal1, który wykazuje fazę odwrotną do tej mPer/mCry, tworząc dodatnie sprzężenia zwrotne. Zwiększenie dostępności BMAL1 przypuszczalnie promuje heterodimeryzację CLOCK:BMAL1 niezbędną do ponownego uruchomienia cyklu transkrypcyjnego mPer/mCry. Dodatnie sprzężenia zwrotne w wyniku wzrostu regulacji negatywnych pętli zapętlają cykl zegara.

Roboczy model mechanizmu zegarowego SCN jest oparty na interakcjach dodatnich i ujemnych w sprzężeniach zwrotnych zegara – proponuje on, żeby za początek cyklu okołodobowego (CT 0) przyjąć czas, w których transkrypcja mPer i mCry jest prowadzona przez stopniową akumulację heterodimerów CLOCK:BMAL1 (rys.2).

Dobowe wahania poziomów RNA mPer i mCry w SCN wykazują podobne jak dotąd wyraźne profile czasowe, z rytmem RNA mPer1 uwydatnianym od CT4 do CT6, mPer3 od CT4 do CT8, mPer2 w CT8 i mCry1 w CT10. W środku cyklu okołodobowego (CT12), białka mPER i mCRY ulegają synchronicznej ekspresji w jądrze, gdzie białka mCRY wyłączają transkrypcję napędzaną przez CLOCK:BMAL1.

W tym samym czasie, mPer2 również przenosi transkrypcyjny aktywator do jądra albo ko aktywatory kompleksu transkrypcyjnego w celu zwiększenia poziomu transkrypcji Bmal1, prowadząc do uzyskania maksymalnego poziomu RNA Bmal1 od CT15 do CT18 (rys. 2). Sądzi się, że rytm RNA Bmal1 przewodzi rytmowi białka BMAL1, z tym że rytm białka jest opóźniony o 4-6 h w stosunku do rytmu RNA. Odnowienie poziomu BMAL1 pod koniec fazy cyklu prawdopodobnie zwiększa poziom heterodimerów CLOCK:BMAL1 w odpowiednim czasie okołodobowym prowadząc do transkrypcji mPer/mCry, przez którą następuje zerowanie (ponowne uruchomienie) cyklu (rys. 2). Wydaje się, że dostępność BMAL1 jest ograniczeniem dla formowania heterodimeru i ma decydujące znaczenie dla ponownego uruchomienia pętli zegara na początku fazy cyklu okołodobowego (CT0).

KOTROLA TRANSKRYPCJI PRZEZ CLOCK:BMAL1

Clock był pierwszym genem zegarowym sklonowanym u ssaków. Mutacja genu Clock wyizolowana na ekranie chemicznym mutagenezy (chemical mutagenesis screen), jest kodominującą, autosomalną mutacją, która powoduje nienormalnie długą fazę cyklu rytmu okołodobowego przejawiającą się także w zachowaniu, homozygoty myszy-mutanta trzymanych w stałej ciemności (DD) w końcu stają się arytmiczne. Klonowanie pozycyjne i technika functional rescue pokazują, że Clock koduje czynnik transkrypcyjny bHLH-PAS. CLOCK heterodimeryzuje z BMAL, aby zwiększyć poziom transkrypcji poprzez elementy E-box. Negatywnie dominujący fenotyp mutacji Clock jest spowodowany przez delecję 51 aminokwasów z domeny prawdopodobnie aktywującej transkrypcję zmodyfikowanego białka. Zmienione białko CLOCK może w dalszym ciągu tworzyć heterodimery z BMAL1 i wiązać się w tej postaci do DNA, ale heterodimery utraciły aktywność transkrypcyjną. CLOCK jest zatem decydujący dla aktywności transaktywacji kompleksu CLOCK:BMAL1:E-box. Natura mutacji Clock zapowiada, że rytmiczna ekspresja komponentów ujemnego sprzężenia zwrotnego powinna być regulowana w dół u myszy mutantów Clock/Clock. Faktycznie wartości szczytowe rytmów mPer1-3 i mCry1 jest znacząco redukowana w SCN homozygotycznych myszy mutantów Clock. W dodatku, poziomy RNA mCry2, które wykazuje słaby rytm okołodobowy jest znacząco obniżony u myszy Clock/Clock. W każdym wypadku regulacja w dół poziomów RNA jest niejasna, również, czy wzmocnienie transkrypcji napędzanej przez CLOCK jest bezpośrednie (poprzez interakcje z elementami DNA każdego genu) czy pośrednia (w rezultacie bezpośredniej akcji na inne geny). Badania in vitro sugerują, że heterodimery CLOCK:BMAL1 są wysoko selektywne w swojej preferencji do Eboxów z sekwencją nukleotydową CACGTG. Ważność sekwencji flankujących do aktywacji transkrypci nie została dokładnie przebadana. Eboxy CACTG zostały znalezione w regionach flankujących 5’-mPer1 i mCry1 i w regionach intronowych mPer2 i mPer3. Znaczenie tych Eboxów dla regulacji transkrypcji In vivo nie zostało jeszcze poznane.

Do dzisiejszego dnia najlepszym dowodem, że motyw CACGTG jest naprawę niezbędny dla uzyskania transkrypcji cyklu okołodobowego pochodzi z analizy reporterowych transgenu przy użyciu promotora mPer1. Białko zielonej fluorescencji transgenu reporterowego sterowany przez region flankujący 5’ genu mPer1 o długości 2,1kb (który zawiera trzy Eboxy CACGTG) wykazuje bezpośrednią ekspresję do SCN u myszy i jest to rytmicznie regulowane jak gen rodzimy. Podobnie badania za pomocą trans genu z wykorzystaniem lub nie elementów zmodyfikowanych genetycznie powinny zostać zastosowane do mPer1 i innych genów o przypuszczalnej funkcji zegarowej dla zmapowania In vivo regionów regulatorowych, w kombinacji ze zidentyfikowanym DNAzami I-hypersensitive sites (DNAzami I-hiperczułych sekwencji). Dla niektórych genów regulacja w dół genów u myszy mutantów Clock/Clock jest możliwe, ze CLOCK heterodimeryzuje z innymi partnerami w/lub aktywuje transkrypcj poprzez bardziej niespecyficzne wzmacniacze Ebox (CANNTG) albo przez jeszcze bliżej niezidentyfikowane elementy wiążące DNA.

Rzeczywiści, drugi gen Bmal1 został ostatnio zidentyfikowany u zebrafish (ryby pręgowanej) i myszy (MOP9), który może zostać dodany do kompleksu wzmacniaczy transkrypcji napędzanej przez CLOCK. Opóźnienie fazy rytmu mPer2 i mCry1 w stosunku do fazy rytmu mPer1 i mPer3 może sugerować istnienie innej kaskady aktywacji transkrypcji. Z drugiej strony te niewielkie różnice fazy mogą jedynie odzwierciedlać różnice w kinetyce transkrypcji genów i rotacji RNA wśród tych genów, a nawet transkrypcja każdego może być prowadzona przez heterodimery CLOCK:BMAL1 działające poprzez wzmacniacze CACGTG Eboxu. Kilka innych czynników transkrypcyjnych zawierających bHLH-PAS ulega ekspresji w mysim SCN, i ich funkcje czekają na przetestowanie. MOP4 jest czynnikiem transkrypcyjnym zawierającym bHLH-PAS blisko spokrewnionym z CLOCK, ma również możliwość heterodieryzować z BMAL1 i aktywować transkrypcję od CACGTG Eboxów in vitro, ale nie ulega on ekspresji na poziomach oznaczalnych w SCN normalnych myszy i myszy mutantów Clock/Clock.

CRYPTOCHROMY SĄ REGULATORAMI UJEMNYMI

Zarówno badania in vivo jaki in vitro potwierdzają, że białka CRY są ważnymi regulatorami negatywnych pętli sprzężeń zwrotnych w mechanizmie zegarowym SCN. Odkrycie tej funkcji było zupełnym zaskoczeniem, ponieważ u roślin i u Drosophila cryptochromy funkcjonują jako fotoreceptory niebieskiego zakresu światła na rzecz systemu okołodobowej regulacji. Cryptochromy są białkami zawierającymi pteiny/flawiny, które są homologami strukturalnymi enzymu reperującego DNA – fotolizy DNA, ale aktywność naprawcza DNA u nich zanikła. Cryptochromy ssaków zostały sklonowane przez ich homologię do fotolizy Drosophila i cryptochromów roślinnych.

Mysie geny Cryptochromowe wykazują ekspresję w SCN. Pierwszym poważnym potwierdzeniem, że mCRY mogą być zaangażowane w centralny mechanizm zegarowy było stwierdzenie, że kierowana delecja mCry2 wydłuża cykl okołodobowy. Z drugiej strony celowe usunięcie mCry1, skraca długość fazy rytmu. Zdumiewające wnioski nasunęły się jednak, kiedy badane było zachowanie myszy z ukierunkowaną delecją zarówno mCry1 i mCry2. Te pozbawione mCry zwierzęta wykazywały całkowitą utratę rytmiczności okołodobowej, z wykazywaniem zachowania „wheelrunning”, stale krążącym rytmem zachowań natychmiastowo po umieszczeniu w warunkach stałej ciemności (DD).

U myszy pozbawionych mCry ilości RNA mPer1 i Per2 są arytmiczne i wykazują średnie i wysokie wartości w SCN. Jest to zgodne z badaniami in vitro ukazującymi, że białka w mCry są silnymi inhibitorami transkrypcji kierowanej przez CLOCK:BMAL1.

W dalszej części analizy in vitro wykazały, że mCRY hamowanie transkrypcji kierowanej przez CLOCK:BMAL1 odbywa się poprzez bezpośrednie oddziaływania białko-białko, niezależnie od białek mPER i TIM i niezależnie od efektów świetlnych. Ponadto mCRY1 i mCRY2 wykazują synchroniczne oscylacje lokalizacji jądrowej w SCN w odpowiednim czasie rytmu okołodobowego dla negatywnej regulacji ich własnej transkrypcji i transkrypcji genów mPer. Szczyt oscylacji mCRY1 poprzedza szczyt rytmu RNA mCry1 o 2-3h. Dla mCRY2 znaczącym oscylacjom białka nie towarzyszą podobnie duże oscylacje rytmu w poziomach RNA. Zatem wydaje się, że posttranskrypcyjne mechanizmy są przede wszystkim przeprowadzane w rytmie mCRY2.

Nie wiadomo w jaki sposób białka mCRY negatywnie regulują transkrypcję prowadzoną przez CLOCK:BMAL1. Każde białko mCRY może bezpośrednio powodować odłączanie się heterodimeru CLOCK:BMAL1 z Eboxa pozostawiając heterodimer w stanie nienaruszonym (jak zaobserwowano pojawienie się PER i TIM inhibuje transkrypcję prowadzoną przez CLOCK:CYC u muszki owocowej) lub mCRY mogłoby zakłócić heterodimer. Ponieważ białka mCRY posiadają miejsce wiążące dla transferujących elektrony flawin, jest możliwe, że ich oddziaływania z czynnikami transkrypcyjnymi powoduje zapoczątkowanie reakcji redoks. W rzeczywistości, redoks zmienia regulację aktywności wiązania DNA innego czynnika transkrypcyjnego bHLH-PAS - receptora węglowodorów arylowych.

Możliwe jest również, ze inne białka zaangażowane są w mechanizm inhibujący. mCRY2 wykazuje zdolność heterodimeryzacji poprzez motywy tetratrikopeptydowe białkowej serynowo-treoninowej fosfatazy i tetratrikopeptydowych powtórzeń białka 1. Fosfataza białkowa serynowo-treoninowa wiąże także białko szoku cieplnego 90, w tej postaci może wchodzić w interakcje z czynnikami transkrypcyjnymi zawierającymi bHLH-PAS (w tym BMAL1), aby- potencjalnie- regulować transkrypcję. Zatem białka zawierające tetratrikopeptyd mogą być ważne dla pośredniczenia i/lub modulacji wpływu białek mCRY na aktywność CLOCK:BMAL1, tak samo jak modyfikują aktywność innych partnerów dimeryzacji białek mCRY, na przykład białka mPER. Dalsze prace badawcze są niezbędne do identyfikacji oddziaływań białko-białko, które są istotne dla zegara.

Szczury Brattleboro, które charakteryzują się brakiem peptydu wazopresyny spowodowanym mutacją w genie AVP nadal wykazują rytm okołodobowy z tą różnicą, że amplituda jest nieco zmniejszona. Wobec tego wazopresyna nie jest niezbędna do funkcjonowania zegara biologicznego.

Czynnik transkrypcyjny DBP może reulować liczebność kanałów istotnych przy regulacji potencjałów błonowych. Zatem produkty genu są regulowane bezpośrednio przez główny układ sprzeżeń, które mogą pełnić także rolę jako regulatory procesów bardziej oddalonych od głównych mechanizmów zegara.

Identyfikacja mechanizmów poprzez które geny zegara lub CCGi reulują pobudliwość wymaga scharakteryzowania właściwości membran neuronów SCN w znanych fazach cyklu okołodobowego, z pomocą mogą przyjść tutaj identyfikacje indywidualnych oscylujących neuronów SCN in vitro z użyciem technologii genów reporterowych.

Rysunek 4.

Bezpośrednia regulacja genów sygnałów wyjściowych przez komórki zegara SCN

1. rytmiczna regulacja genu wazopresyny preproprezofizyny (AVP). Wzmocnienie transkrypcji okołodobowej pojawia się poprzez element Ebox w regionie promotorowym. Rytmiczna transkrypcja jest kontrolowana poprzez te same pozytywne i negatywne czynniki, które kontrolują sprzężenia zegara głównego (duży owal), w końcu generacja rytmicznych zmian w aktywności funkcjonalnej heterodimerów CLOCK (C):BMAL1 (B). Neuropeptyd reguluje aktywności tych receptorów oddolnie.

2. Rytmiczna regulacja genu białka wiążącego czynnik D (DBP). Wzmocnienie rytmów okołodobowych następuje poprzez czynniki Eboxu w regionach intronowych. DBP jest czynnikiem transkrypcyjnym, który kontroluje rytm transkrypcji genów, które nie są związane z centralnym zegarem okołodobowym. Homodimery DBP (D-) są zdolne do wiązania wzmacniaczy cząsteczek D w regionie promotorowym odpowiadających im genów. DBP może również zwrotnie modulować główny mechanizm zegarowy.

SYNCHRONIZACJA MIĘDZY KOMÓRKAMI ZEGARA

Aby SCN mogło funkconować prawidłowo, pojedyncze komórki zegara muszą być odpowiednio zsynchronizowane, aby generowany przez nie sygnał wyjściowy był skoordynowany wedle jednej fazy. Do możliwych mechanizmyów synchronizacji możemy zaliczyć komunikację synapsami elektrycznymi, opartą na interakcjach neurotransmiterów oraz opartą na interakcjach synaptycznych.

W oparciu o mikroskopię elektronową zaobserwowano, że synapsy elektryczne występują bardzo rzadko pomiędzy neuronami SCN osób dorosłych. Jednakże wnioskując z ostatnich badań, prawdopodobna jest obecność i dynamiczna regulacja funkcjonalnych synaps elektrycznych w SCN. Shinohara i in. Dowodzą o transferze Lucifer Yellow pomiędzy neuronami SCN dorosłego szczura i inhibicji tego transferu przez GABA receptorowego agonistę muscinolu.

Synaptyczna komunikacja nie jest konieczna dla zachowania funkcji zegara biologicznego w komórkach SCN, jednakże, ponieważ międzykomórkowa iniekcja neurobiotyny zaburza przepływ barwnika między neuronami SCN w hodowli komórek rozproszonych, jednakże rozległe połączenia synaptyczne znaleziono pomiędzy astrocytami. Podsumowując, rezultaty potwierdzają, że synapsy elektryczne, chociaż nie są konieczne dla wewnątrzkomórkowego mechanizmu zegara biologicznego, mają wspierać koordynację podzespołów neuronów SCN i wzmacniać ich wspólny sygnał wyjściowy.

GABA jest nadrzędnym transmiterem neuronów SCN. Aczkolwiek aktywność GABA jest zwykle hamowana. Wager i in. Stwierdzili, że GABA pobudza neurony SCN podczas dnia, podczas gdy w nocy GABA hamuje aktywność elektryczną SCN. Ten dualizm GABA może być źródłem przekładania się rytmicznej koncentracji jonów (np. międzykomórkowych chlorków) na rytmiczną pobudliwość pojedynczych neuronów zegara, ale może to również zapewniać mechanizm wzrostu amplitudy oscylacji w populacji neuronów SCN.

Jak na razie te hipotezy, chociaz wydają się bardzo prawdopodobne, dane z doświadczeń nie są na tyle powtarzalne, aby je potwierdzić; przy użyciu trzech niezależnych metod: Gribkoff i in. ujawnili tylko hamowanie odpowiedzi na GABA w SCN podczas subiektywnego dnia.

race a\nad elektryczną aktywnością rytmu komórek zegara SCN w kulturach in vitro wykazują, że GABA jest ważnym przekaźnikiem dla synchronizacji neuronów SCN. Aplikacjia GABA prowadzi do zmiany fazy rytmu i przestawiania wskazówek zegarów komórek w kulturze. Szczególnie wszystkie ostre odpowiedzi na GABA zostały hamowane w hodowli komórek zegara, ale trzeba zaznaczyć, że samo hamowanie neuronowe było niewystarczającą przyczyną do zmiany fazy rytmu. Jednakże dane komórek zegara wspierają ważną rolę GABA w synchronizacji wspólnej SCN in vivo, inne substancje zdolne do przenikania przez błony, takie jak neuropeptydy (np. AVP), mogą także być w to wplątane.

Bardzo wysoka neuronalna gęstość w SCN i rozległe przystawienie błon wśród neuronów SCN sugeruje, że zmiany w mikrośrodowisku służą jako mechanizm do koordynacji. Formowanie NCAM (neuronal cell adhesion molecule), który jest bogaty w kwas polisialowy (PSA-NCAM) jest włączony w regulację plastyczności neuronalnych oddziaływań na inne systemy i ujawnia posiadanie swej roli na rytm okołodobowy. Mysz pozbawiona PSA-NCAM wykazuje skórcony cykl okołodobowy, staje się arytmiczna po kilku tygodniach przebywania w stałych warunkach, a z enzymatycznie usuniętą połową PSA z endogennego NCAM wykazuje podobnie skrócony cykl okołodobowy. Fenotyp myszy pozbawionej PSA-NCAM ze stopniową utratą rytmiczności w stałych warunkach sugeruje, że rolą PSA-NCAM jest wspieranie oddziaływań pomiędzy neuronami SCN, które są niezbędne do spójnego działania zegara okołodobowego. Glej poprzez izolujące i/lub biochemiczne znaczenie, mają także wspierać zespolenie SCN.

Zestawienie cyklu elektrycznej aktywności rytmów w pojedyczej komórxe zegara z cyklem lokomotorycznej aktywności rytmów u chomików mutantów tau, myczy mutantów Clock i normalnych szczurów, pokazuje, że cykl dobowy u wszystkich zwierząt jest determinowany przez wypadkową znacznie rozproszonych cyklów pojedynczych komórek zegara w SCN.

Cykl komórek zegara można rejestrować przez multielektrody platynowe rejestrujące zmienność potencjałów wewnątrz populacji komórek zegara, ale to ukazuje również możliwość, ze te komórki oddziałowują w celu wytwarzania wspólnego kompromisu cyklu in vivo przez mechanizmy wyżej opisane. Został zaproponowany oficjalny model SCN jako oscylującego układu, który przewiduje, że wzrost siły sprzężenia idzie w parze ze wzrostem ilości komórek zegara będących zsynhronizowanych z główną frekwencją rytmu. Dlatego całkowicie zsynchronizowany układ będzie oscylował z frekwencją bliską do przeważającej frekwencji w populacji. Ten model oscylującego układu będzie prawdopodobnie potrzenym udoskonaleniem jako molekularny dowód dla istnienia funkcjonalnie odmiennych populacji komórek zegara.

Biologiczne zalety sprzężenia systemu składającego się z wielu oscylatorów jest elastyczność dostosowania się zegara okołodobowego do środowiska. Zatem kiedy część oscylującego układu zostaje przesunięta w fazie, cały układ rezynchronizuje do nowej fazy. Tą drog, tylko subpopulacja komórek zegara potrzebuje odpowiedzieć na specyficzny aktywny bodziec, aby doprowadzić do generacji przesunięcia fazy cyklu w całym układzie.

Rzeczywiście, światło najpierw indukuje ekspresję genów mPer1 w brzuszno-bocznym SCN, z indukcją na działanie całego jądra w późniejszym czasie.

Stała faza zegara SCN utrzymywana w warunkach światło-ciemność jest prawdopodobnie bilansem pomiędzy wewnętrzną synchronizacją zegara (np. przez GABA) a przesunięciem w fazie związanym z odpowiedzią na światło (np. glutaminian). W istocie funkcja SCN wymaga precyzyjnej koordynacji pomiędzy międzykomórkową synchronizacją procesów a wewnątrzkomórkowymi powiązaniami molekularnymi.

SZLAKI WYJŚCIOWE

Mechanizmy i szlaki odprowadzające przez które zsynchronizowane SCN reguluje ujawniającą się rytmikę w docelowych tkankach nie jest całkowicie scharakteryzowane dla żadnego z wyjściowych szlaków rytmu. AVP i GABA pochodzace z SCN są włączane w wiele szlaków wyjściowych. AVP powstające w SCN może być związane z rytmicznym sterowaniem osią podwzgórzowo-przysadkowo-nadnerczową, aktywnym u szczurów, ostatecznie regulującym uwalnianie kortykosterowu z nadnerczy. Podobnie AVP może pełnić rolę w aktywacji osi podwzgórzowo-przysadkowo-gonadowej. Zatem można wywnioskować powiązania pomiędzy molekularną oscylacją w komórkach stymulatora, kontrolowaną przez zegar produkcją AVP i ujawniającą się rytmiką. Uwolnienie GABA w SCN z zakończeń w regionie jądra przykomorowego zdaje się regulować syntezę melatoniny z szyszynki przez wyłączanie sygnału stymulującego wywodzącego się z jądra przykomorowego. Jednakże połączenie pomiedzy zegarem okołodobowym a mechanizmami regulującymi uwalnianie GABA z SCN nie jest jasne i wyglada na to, że zwiększenie elektrycznej aktywności SCN prowadzi do zwiększenia uwalniania GABA. Dodając, do neuronalnych szlaków wyjściowych SCN może przekazywać informacje wewnątrz mózgu drogami humoralnymi. Silver i wsp.zaobserwowali, że przenikająca substancja z transplantowanych tkanek płodowego SCN może przywrócić słaby rytm okołodobowy w aktywności ruchowej u chomików z uszkodzonym SCN. Chociaż wazopresyna jest rytmicznie wydzielana do płynu mózgowo-rdzeniowego z SCN, niezidentyfikowana przenikająca substancja nie zdaje się być wazopresyną.

MECHANIZM ZMIANY FAZY

Metaboliczna i elektryczna aktywność rytmów SCN jest wyższa podczas dnia zarówno u gatunków aktywnych w dzień jak i u tych aktywnych w nocy. Podobnie, poziomy AVP w płynie mózgowo-rdzeniowym są wyższe podczas dnia niż w nocy, bez względu czy gatunek jest aktywny za dnia, czy też w nocy. Melatonina jest produkowana w nocy u wszystkich gatunków. Inne rytmy, włączając w to rytm aktywności, temperatury ciała i aktywności osi podwzgórzowo-przysadkowo-nadnerczowej są bardziej zmienne. Możemy więc wnioskować, że oznaki zewnętrznego sygnałowania z SCN mogą być odwracane oddolnie. Jak to jest przeprowadzane, nie wiadomo.

Yamazaki i in. zaproponowali, ze różnice faz pomiędzy rytmami w tkankach obwodowych występują ponieważ różna jest odpowiedź tkanek obwodowych na wspólny sygnał wyjściowy. Jest to rozsądne wyjaśnienie różnic pomiędzy tkankami, jednak nie jest w stanie wyjaśnić różnic pomiędzy dziennymi i nocnymi gatunkami zwierząt. Zdecydowanie lepszym jest stwierdzenie, że znaki sygnału są już zmieniane przez czas odbwodowych oscylatorów otrzymujących sygnał bazowy z SCN. Skupia to uwagę na identyfikacji miejsc wzdłuż szlaków wyjściowych, gdzie objawy rytmiki mogłyby być odwracane.

OBWODOWE OSCYLATORY

Przed sklonowaniem genów zegara, siatkówka była uważana za jedyną strukturę zawierającą prawdziwy zegar okołodobowy ssaków. Siatkówka chomika wykazuje rytmiczną okołodobową ekspresję produkcji melatoniny in vitro, co może być bezpośrednio spowodowane przez światło. Ponadto, badania nad chomikami mutantami tau pokazują, że zmiany cyklu w kierowanych przez SCN rytmach zachowań są także obecne w rytmach rejestrowanych z siatkówki in vitro. Poprzez klonowanie ssaczych genów Per, znalezione zostały trzy geny mPerwykazujące okołodobowe wzorce ekspresji w oku myszy. Osobliwe jest, że faza rytmów oka jest opóźniona o 3-6 h w stosunku do oscylacji SCN. Ponieważ oscylacje w siatkówce są rozważnie samopodtrzymujące się i funkcjonują niezależnie od SCN, biologiczne znaczenie różnicy w fazie ekspresji genów zegara pomiędzy siatkówką a SCN jest niejasna. Ważnym może być określenie jak molekularna machineria, która uruchamia zegarsiatkówkowy ma się do tej opisywanej dla SCN. Bardzo interesującym jest zdefiniowanie, które geny zegara i/lub białka odpowiadają na światło w siatkówce, dając zdeformowaną relację retmów RNA siatkówkowego mPer1 i mPer2 z cyklem światło-ciemność porównując z odpowiadającymi rytmami w SCN.

Gdy rodzina genów Per została sklonowana u ssaków, stało się także jasne, które z tych genów wykazują swą ekspresję powszechnie. W rzeczywistości, geny mPer są aktywne transkrypcynie w całym mózgu i wielu tkankach obwodowych. Wkilku tkankach obwodowych (jak wątroba i mięśnie szkieletowe) rytmy okołodobowe w znacznej ilości RNA są widoczne dla każdego z genów mPer. W tych tkankach, faza oscylacji RNA każdego genu mPer jest opóźniona o 3-9 h względem oscylacji w SCN, sugerując, że oscylacje obwodowe są również prowadzone albo synchronizowane przez SCN.

Badania nad szczurami z uszkodzonym SCN sugerują, że te odbwodowe oscylacje RNA faktycznie są kontrolowane przez SCN. Dzienno-nocne oscylacje Per2 są znoszone w tkankach obwodowych po całkowitym uszkodzeniu SCN. Problem tych badań – tylko dwa punkty w czasie były weryfikowane. Ponadto, niemożliwą jest do dostrzeżenia różnica pomiędzy utratą rytmiczności w obwodowych oscylatorach i kontynuowaniem rytmiczności wewnątrz niezsynchronizowanej populacji pojedynczych komórkowych oscylatorów. Badania sugerują, jednakże, że SCN jest najmniej zaangażowany w utrzymywanie fazy obwodowych oscylatorów.

Badania na ssaczych komórkach w kulturach tkankowych ukazują, e obwodowe tkanki rzeczywiście zawierają okołodobowe oscylatory. Wstrząs osmotyczny (50% surowicy) linii komórkowej fibroblastu Rat-1 indukuje rytmy RNA kilku transkrypcyjnych czynników normalnie wykazujących ekspresję w tkankach obwodowych, tak samo jak Per1 i Per2.

Rytmy są okołodobowe w długości i widoczne dla trzech cykli w kulturze. Ale czy te oscylatory przedstawiają prawdziwe zegary? Ostatnie badania wykorzystujące transgeniczne szczury, w których lucyferaza jest podpięta pod kontrolę promotora mPer1 pokazują, że wątroba, płuca i mięśnie szkieletowe wykazują ekspresję okołodobowych rytmów in vitro, która ulega stłumieniu po 2-7 dniach, jak linia komórkowa fibroblastów Rat-1. Zdolność do indukcji dodatkowych cykli ekspresji genów przez szok osmotyczny, ujawnia, że utrata tkankowej żywotności nie jest przyczyną odpowiedzialną za utratę rytmicnzości. Co jest jeszcze nie poznane, jednakże, czy te oscylatory są naprawdę tłumione i niezdolne do podtrzymywania długotrwale rytmiczności albo czy tłumienie zachodzi wskutek desynchronizacji populacji samopodtrzymującej zegar komórkowy. Analiza za pomocą genu reporterowego pojedynczych komórek z tych obwodowych tkanek albo linii komórkowych powinna wkrótce rozwiązać tą kwestię. Bieżące dane sugerują, że obwodowe tkanki zawierają tłumione oscylatory, które wymagają przelotnego (okresowego) sygnału do podtrzymania oscylacji i że SCN jest zaangażowany w ten proces in vivo.

Jedną ze wspaniałych korzyści wynikających ze znalezienia transkryptów oscylująch w kulturach komórkowych jest możliwość przyśpieszenia biochemicznych i molekularnych analiz głównego mechanizmu zegarowego u ssaków. Wydaje się to być częściowo interesujące dla analiz transdukcji sygnału kaskadami indukowanej mediatorami, ponieważ szok osmotyczny wywołuje szybką indukcję ekspresji genów Per1 i Per2 w hodowanych komórkach, podobnie do efektu światła na ekspresję Per1 i Per2 w SCN. Przyjmując to podejście Akashi i Nishida wykazali, że kaskada kinaz MAP jest zaangażowana w indukcję okołodobowej ekspresji genowej w hodowanych komórkach. To wygląda analogicznie do sytuacji w SCN, którego stymulowanie kinazami MAP prowadzi do fosforylacji CREB. Nie jest do końca poznane, czy ekspresja genowa indukowana surowicą w hodowanych komórkach jest analogiczna do indukowanej światłem ekspresji mPer1 i mPer2 w SCN. Zdaje się, że w komórkach kultury indukcja genowa rozpoczyna oscylacje okołodobowe, natomiast w SCN indukcja genowa przez światło nastawia już chodzący zegar okołodobowy. Nasuwa to podstawowe pytanie: czy mechanizm centralny zegara jest taki sam w SCN i oscylatorach obwodowych? Dane sugerują, że istnieją istotne różnice. W dodatku do opóźnionych faz rytmu RNA mPer w tkankach obwodowych, w stosunku do tych w SCN, rytm RNA Bmal1 wykazuje zdecydowanie inną odpowiedź w SCN niż w tkankach obwodowych myszy mutanta Clock/Clock. Poziomy RNA Bmal1 są podwyższone so górnego zakresu normalnej oscylacji w tkankach obwodowych myszy mutanta Clock/Clock, podczas gdy te same zwierzęta mają rytm RNA mocno spłycony w SCN. Podwyższenie poziomu Bmal1 w tkankach obwodowych myszy mutanta Clock sugeruje, że heterodimery CLOCK:BMAL1 są normalnie represorami transkrypcji genu Bmal1 w obwodowych tkankach, analogicznie do tego została zaproponowana represja transkrypcji clock przez CLOCK:CY w zegarze biologicznym Drosophila. W SCN taka represja nie występuje. Wydaje się zatem, że istnieją znaczne różnice w regulacji genów zegara w tkankach obwodowych porównując z SCN. Dalsze badania mogą dostarczyć molekularnego wyjaśnienia dla różnic pomiędzy prawdziwymi zegarami a tłumionymi oscylatorami. Tymczasem, starania zrozumienia mechanizmów okołodobowych w SCN poprzez użycie rytmów tkanek obwodowych jest szybkim, ale i potencjalnie niosącym zagrożenia sposobem.

Jak obwodowe oscylatory u ssaków są utrzymywane przez zewnętrzne sygnały upływającego czasu dnia? W odróżnieniu od Drosophila, u których zegary obwodowe są bezpośrednio regulowane i nastawiane przez światło, dane pochądzące z analiz nad szczurami transgenicznymi i z uszkodzoną przysadką sugerują, że sygnały światła i ciemności są przekształcane przez SCN na sygnały wychodzące, które dostarczają czasu (znaczniki czasu, dawcy czasu). Natura sygnału zależnego od SCN do tkanek obwodowych nie jest jeszcze znana. Jest mało prawdopodobne, że jest w to zaangażowana melatonina, ponieważ myszy niezdolne do wytwarzania melatoniny (szczep C57BL/6) ciągle posiada okołodobowe oscylacje ekspresji genów mPer w tkankach obwodowych. Jest natomiast prawdopodobne, że dawcą czasu jest kompleks złożony z sygnałów nerwowych i humoralnych sterowanych przez SCN, podobnie do tego, co zostało zaproponowane dla sygnałów generowanych z macierzystego SCN, które nadaje płodowy zegar okołodobowy.

Zatem jaka jest funkcja obwodowych oscylatorów? Jedna z hipotez zakłada, że centralnie generowane sygnały w końcu wpływają na obwodowe oscylatory, wzbudzając je i koordynując ekspresję lokalnie kontrolowanych CCG-ów, które zmienianiają regulację biologicznych procesów. DBP jest prostym przykładem CCG w tkankach obwodowych, ponieważ jego ekspresja zachodzi rytmicznie w wielu obwodowych organach. Ponadto DBP reguluje transkrypcj kluczowych enzymów w hepatocytach bezpośrednio zaangażowanych w metabolizm cholesterolu, aminokwasów, ksenobiotyków i androgenów. Tak więc DBP może pełnić podwójną rolę, zdaje się być zaangażowane w regulację okołodobowego sygnału wyjściowego przez ekspresję zarówno w SCN jak i w wątrobie. Lokalnie kontrolowane CCGsy w organach obwodowych mogą zapewniać łatwość przystosowania się do kontroli rozległych sieci regulatorowych rytmów okołodobowych.

Każdy z ośmiu genów zaangażowanych w mechanizm zegarowy w SCN wykazuje szeroką ekspresję w całym organiźmie. To czyni analizy funkcji specyficznych genów trudnymi w hodowlach komórkowych, ze względu na zanieczyszczający wpływ efektów wewnętrznej ekspresji w ssaczych liniach komórkowych. Oprócz udziału genów zegarowych w tłumieniu okołodobowych oscylatorów okołodobowych, mogą one także pełnić funkcje w podwyższaniu częstotliwości oscylacji tych genów. Jako przykład, częstotliwość rytmu męskich zalotów Drosophila dotknięta przez mutacje PER wywiera podobny efekt na częstotliwość zegara okołodobowego.

Ostatnio wykryto nierytmiczne funkcje kilku genów zegarowych. U Drosophila kilka genów zegarowych jest niezbędnych w uczuleniu na kokainę, podczas gdy inne geny nie. Muszki posiadające mutacje per, clock, cyc i doubletime nie są uczulone, rezultatami wielu tych mutacji (np. mutacja - brak per) są niefunkcjonujące zegary okołodobowe. Intrygujące jest, że muszki pozbawione funkcjoalnego genu tim uczulone są normalnie, mimo że nie wykazują rytmu okołodobowego. Dlatego efekt genów zegarowych na uczulenie kokainowe jest różny od efektów na zachowania okołodobowe. Te badania błagają o proste analizy funkcji genów zegara u ssaków, ponieważ uczulenie kokainowe jest obserwowane również u ssaków włącznie z ludźmi i jest powiązane ze wzrostem głodu narkotykowego.

Mogą istnieć inne nierytmiczne biologiczne procesy u ssaków regulowane albo modulowane przez podstawowe geny mechanizmu zegarowego. Dlatego ważnym jest, aby myszy z genetycznymi manipulacjami genów były dogłębnie przebadane pod kątem szerokiego zakresu fenotypów. Jak zademonstrowano przy roli oreksyn (urokortyn) w regulacji snu, kierowane zakłócenie genu może wytworzyć szeroki zakres łatwo identyfikowalnych fenotypów.

PODSUMOWANIE

Rytmy okołodobowe są ważnym aspektem ludzkiej biologii. Czasowe zmiany w poziomach hormonów, farmakokinetyce i aspektach wykrywania chorób, wszechobecne oddziaływanie zegara okołodobowego na ludzką fizjologię i patofizjologię. Zaburzenia ludzkiego systemu okołodobowego obejmują: zmęczenie występujące po długotrwałej podróży (tzw. jet lag), lecz również bardziej chroniczne warunki jak zaburzenia snu bazujące na systemie okołodobowym i praca na zmiany.

Zrozumienie jak geny zegara i ich białka oddziałują na siebie, aby formować zegar molekularny dostarcza bezprecedensowych możliwości dla manipulacji famakologicznych mechanizmami zegara SCN. Badania te mogą przynieść wiele korzyści, takich jak rozwój farmakologicznych interwencji, które mogłyby szybko adaptować zegar biologiczny do nowych warunków czasowych. To może zrewolucjonizować terapie dolegliwości jak „jet lag”, zaburzeń snu i kilku neuropsychiatrycznych schorzeń.

Rysunek 1.

Model okołodobowego mechanizmu zegarowego wewnątrz pojedynczego neuronu jądra nadskrzyżowaniowego. Mechanizm zegarowy jest złożony z interakcji pozytywnych (zielone linie) i negatywnych (czerwone linie) w sprzężeniach zwrotnych. Produkty białkowe są zakodowane kolorowymi formami (mCRYs , złote karo; mPER1, niebieski owal; mPer2, czerwony prostokąt; mPER3, zielony sześciokąt,; hipotetyczny aktywator-koaktywator Bmal1 transkrypcji, małe szare koło). CLOCK (owal z C) i BMAL1 (owal z B) heterodimery aktywują (+) rytmiczną transkrypcję genów mCry i mPer. Białka mCRY i mPER formują kompleksy ważne w translokacji jądrowej białek mPER. Stan ufosforylowania (P) białek mPER może także regulować ich komórkową lokalizację i stabilność. mPER2 pozytywnie reguluje transkrypcję Bmal1 przez translokację aktywatora do jądra i/lub działanie jako koaktywator. Jądrowo zlokalizowane białka mCRY bezpośrednio oddziałowują z CLOCK i BMAL1, aby negatywnie regulować transkrypcję kierowaną przez CLOCK:BMAL1. Funcke jądrowych mPER1 i mPER3 nie są jeszcze dokłanie określone.

Rysunek 2.

Rytmy okołodobowe ekspresji genów zegarowych i poziomy białek w mysim SCN. Rytmiczna zawartość RNA: mPer1, mPer2, mPer3 i mCry1 (góra); białek mPER1, mPER2, mCRY1 i mCRY2 (środek); RNA Bmal! (linia pogrubiona); hipotetyczne dane (oczekiwane BMAL1) przedstawiające przewidywane rytmiczne zmiany białka BMAL1. Rytmiczna ekspresja RNA mPer1-3 i mCry1 jest prowadzona przez aktywację transkrypcji za pośrednictwem Ebox. Kiedy białka gromadzą się, transkrypcja tych RNA jest hamowana, podczas gdy transkrypcja Bmal1 jest stymulowana. Antyfazowy rytm RNA Bmal1 prawdopodobnie prowadzi do produkcji białka BMAL1 niezbędnego do zapoczątkowania nowego cyklu okołodobowego. Dane modyfikowane z 17, 31, 41, 45 i 55. Poziomy RNA zostały oszacowane przez hybrydyzację in situ na skrawku SCN. Wartości zostały zamienione z wartości gęstości optycznej filmu przez odjęcie minimalnych wartości od każdej próby z całkowitych wartości, następnie wyrażono inne wartości jako procent najwyższych wartości netto. Poziomy białek zostały oszacowane metodą immunocytochemiczną i zostały wyrażone jako procent maksymalny ilości immunoreaktywnych jąder na SCN. Szary pasek, subiektywny dień; czarny pasek, subiektywna noc.

Rysunek 3

Schematycznie ujęcie szlaku wejściowego dla zmian światło-ciemność do mechanizmu zegarowego. Podkreślone na czerwono są elementy uznane za ważne dla aktywacji świetlnej szlaków istotnych zachowań. Fotony są wyłapywane przez niezidentyfikowany receptor (?) w sitkówce (zielony łuk). Świtało powoduje uwolnienie glutaminianu z zakończeń drogi siatkówkowo-podwzgórzowej (RHT), która unerwia siatkówkowego odbiorcę SCN. Glutation, przez zarówno N-metylo-D-asparaginianowe jak i nie-N-metylo-D-asparaginianowe receptory, różnie aktywuje wapniozależne szlaki sygnałowew zachowaniu zależnym od pory dnia, substancja P (Sub P) i uwolnienie przysadkowego peptydu aktywującego cyklazę adenylanową (PACAP) z RHT moduluje działanie glutaminianu. Aktywowane kinazy fosforylują białko odpowiedzialne za wiązanie cAMP (CREB). Ufosforylowany CREB prawdopodobnie aktywuje transkrypcję mPer1 i mPer2 przez bezpośrednie oddziaływanie z wapniem/cAMP response elementem (CRE, blue) w regionie promotorowym każdego genu. Aktywacja świetlna występuje, kiedy heterodimery CLOCK (C) i BMAL1 (B) są nieaktywne (inaktywowane). CaMK kinazy zależne od wapnia/kalmoduliny; MAPK, kinaza MAP; PKA, protein kinase A – kinaza białkowa A; PKC, protein kinase C – kinaza białkowa C; PKG, protein kinase G – kinaza białkowa G.