Anna Olejnik

Ogrodnictwo

KTZ

Sprawozdanie

Biologia molekularna

1. Izolacja DNA z materiału roślinnego

Materiałem roślinnym wykorzystanym do badań było żyto. Otrzymaliśmy wstępne przygotowany materiał biologiczny. Przygotowanie polegało na oczyszczeniu z różnych zanieczyszczeń zewnętrznych, pożywki i pozostałości innych komórek. Następnie materiał rozdrobniono i poddano homogenizacji(wytworzenie jednolitej masy). Roztarcie komórek roślinnych spowodowało destrukcję błon zewnętrznych, i uwolnienie DNA. Tak przygotowany preparat poddano izolacji DNA.

Poszczególne etapy izolacji:

-dodanie roztworu soli NaCl+Tris+EDTA

- unieczynnienie nukleaz enzymami proteolitycznymi: proteinaza K

-dodanie soli sodowej siarczanu dodecylu(SDS)

-ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi(fenol, chloroform, alkohol izoamylowy) i odwirowanie substancji

-zagęszczenie preparatu alkoholem- wytworzenie nitkowatego osadu, odwirowanie i przemycie 70% etanolem

-zawieszenie wyizolowanego DNA w małej objętości buforu o niskiej sile jonowej (Bufor TE)

- umieszczenie materiału w szafie chłodniczej.

2. Ocena ilości i jakości wyizolowanego DNA

Ocena ilości i jakości DNA została przeprowadzona metodą spektrofotometryczną oraz rozdział elektroforetyczny.

Pomiar spektrofotometryczny

Pomiary próbek:

Po wykonaniu kalibracji spektrofotometru do kuwety dodano rozcieńczony roztwór DNA, a następnie zmierzono absorbancję próbki.

Do zmierzenia pobierano 40µl wody i 10µl DNA. Odczytano następujące wartości:

Ilość DNA 21,0µg/µl x 5=105µg/µl

A 260/280=2,01

A 260/230=1,99

A 320=0,021

Elektroforeza w żelu agarozowym

Elektroforeza – ruch naładowanych cząstek w zewnętrznym polu elektrycznym.

Ocena DNA na żelu pozwala na określenie stopnia jego degradacji i zanieczyszczeń przez RNA.

Elektroforezę w żelu agarozowym prowadzono w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział elektroforetyczny prowadzono w buforze TBE. Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie w środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza się w kierunku anody. Do 10µl roztworu DNA dodano 4µl obciążnika, wymieszano i umieszczono w żelu. Następnie podłączono urządzenie do zasilania na ok. 45min. Natężenie wynosiło 5V/cm.

Wnioski: Wyizolowane DNA jest dobrej jakości, co można stwierdzić po odczycie elektroforezy. Zaobserwowano wysokocząsteczkowe DNA (wielkości powyżej 50kb) widoczne w postaci dobrze wyodrębnionego prążka.

Odczyt pomiaru spektrofotometrycznego również wykazał, iż uzyskany materiał był jakościowo dobry. Zanieczyszczenie białkami jest niskie ( stosunek oczyszczonego DNA do zanieczyszczeń- A₂₆₀/A₂₈₀). Wynik mówiący o zanieczyszczeniu fenolami, węglowodorami czy komponentami aromatycznymi również jest zbliżony do wartości charakterystycznej dla próbek czystych (A₂₆₀/A₂₃₀ = 2,2).

3. Reakcja PCR-reakcja łańcuchowa polimerazy

Początkowym etapem było sporządzonie Mix V=25µl w skład, którego wchodziły następujące substancje:

DNA o stężeniu 25µg/µl obj. 2µl

Bufor 10x obj. 2,5 µl

MgCl₂ 25mM obj.2,5 µl

dNTP 10mM obj. 0,5 µl

BSA obj. 0,5µl

starter F 10mM obj. 0,5 µl

starter R 10mM obj. 0,5 µl

polimeraza 5mM obj. 0,3 µl

H₂O obj.16,5 µl

Tak przygotowane próbki umieściliśmy w termocyklerze i uruchomiliśmy wprowadzony program

	TEMPERATURA	CZAS
Wstępna denaturacja	95°	5 min
Denaturacja	95°	30 sek
Przyłączanie	63°	30 sek
Wydłużanie	72°	45 sek
Liczba cykli	40
Wydłużanie końcowe	72°	7 min
Przechowywanie	4°	∞

4. Rozdział produktów reakcji PCR-elektroforeza

Po wykonanej reakcji PCR przeprowadzono elektroforezę w żelu agarozowym w celu wykrycia obecności powielonego DNA. Wykonano ją w identyczny sposób jak w czasie elektroforezy do określania ilości DNA w ćw.2. Ostatecznie elektroforeza nie wyszła prawidłowo(nic nie wykazała). Wnioski: Przyczyną braku wyniku przeprowadzonej reakcji mógł być najprawdopodobniej błąd popełniony na etapie przygotowywania Mixu.

5. Reakcja PCR dla DNA łubinu

Problemem badawczym było sprawdzenie obecności genu, który odpowiada za tendencję do pękania strąków łubinu. Do gotowego DNA ponownie sporządzono Mix, analogicznie do ćw3:

6. Elektroforeza DNA łubinu

Do powielonego DNA dodano 5µl obciążnika, wymieszano i umieszczono na żelu agarozowym i podłączono urządzenie tak samo jak w ćw.2.

Po zakończeniu elektroforezy pod kamerą zaobserwowano wyniki w postaci prążka wyższego. Wnioski: Oznacza to, że występuje gen odpowiedzialny za nie pękanie strąków.