Mikrobiologia Ćw. 12
Badanie serologiczne
Badanie odporności komórkowej
Badanie serologiczne
Odczyn immunofluorescencji IF
Do badanej surowicy dodajemy antygen diagnostyczny znakowany fluorochromem płuczemy w celu usunięcia antygenu niezwiązanego z przeciwciałem i oglądamy w mikroskopie fluorescencyjnym. Koniugat związany z przeciwciałem świeci zwykle zielonkawym lub żółtoczerwonym światłem.
Odczyn immunoenzymatyczny IE (np. immunoperoksydazowy IP)
Oparty na tej samej zasadzie co odczyn IF, z tą różnicą, że antygen znakowany jest enzymem (np.. peroksydazą chrzanową, alkaliczną fosfatazą). Powstały kompleks antygen-przeciwciało wykrywa się za pomocą substratu dla enzymu (chromogenu np. odczynnik benzydynowy, którego utlenione złogi są widoczne w preparacie w postaci niebieskobrunatnych plam).
Odczyn ten pozwala na wykrycie przeciwciał przy użyciu zwykłego mikroskopu lub „gołym” okiem.
Odczyn ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Odczyn zaliczany do odczynów immunoenzymatycznych różni się od testu peroksydazowego tym, że antygen jest trwale zaadsorbowany na odpowiednim nośniku (polistyrenie, polichlorku winylu itp.)
Metoda wysoce czuła, łatwa w wykonaniu, znajduje coraz szersze zastosowanie w mikrobiologii a zwłaszcza w badaniach wirusologicznych i immunologicznych.
Odczyn opsono-fagocytarny
Służy do wykazywania obecności przeciwciał w badanej surowicy i opiera się na stwierdzeniu, że wzmagają one fagocytozę (zdolność wychwytywania, wchłaniania i wewnątrzkomórkowego zabijania drobnoustrojów przez fagocyty).
Fagocytoza = leukocyty + antygen wzorcowy (Staphylococcus aureus 209P)
Opsonofagocytoza = leukocyty + surowica (od tego samego zwierzęcia, od którego pochodzą leuocyty) + antygen wzorcowy (który ma być fagocytowany)
Pozyskujemy frakcję białokrwinkową od pacjenta i dodajemy do niej zawiesinę żywych drobnoustrojów o gęstości odpowiadającej 4 skali McFarlanda oraz badaną surowicę od pacjenta.
Po wymieszaniu składników w probówce, wstawiamy ją do łaźni wodnej (37 ̊C przez 45 minut).
Po inkubacji z mieszaniny sporządzamy na szkiełku podstawowym rozmaz i barwimy go metodą Pappenheima – jądra leukocytów obojętnochłonnych barwią się na ciemnoniebiesko, cytoplazma na różowoniebiesko, bakterie są niebieskofioletowe.
Fagocytozę można określić ilościowo, wyrażając ją w postaci indeksu fagocytarnego – średnia liczba bakterii pochłoniętych przez jeden leukocyt. Indeks fagocytarny powyżej 10. świadczy o obecności swoistych przeciwciał w surowicy – opsonin – wzmagających proces fagocytozy.
Współczynnik opsonofagocytarrny – stosunek indeksu fagocytarnego próby z surowicą do indeksu fagocytarnego próby bez surowicy.
Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)
Dopełniacz – komplement, euglobulina surowicy, około 30 białek (konwertaza C3, konwertaza C5, składnik C3, składnik C5, MAC, białko B itp.), które ulegają stopniowej aktywacji przez proteolizę = kaskadowo).
Istota odczynu – wykazanie wiązania dopełniacza lub braku takiego wiązania przez kompleks przeciwciało badanej surowicy – antygen diagnostyczny. Wiązanie świadczy o obecności przeciwciał w badanej surowicy (dopełniacz może być aktywowany przez kompleks swoistego przeciwciała i antygenu).
Składniki odczynu OWD (kolejność dodawania):
Badana surowica
Antygen diagnostyczny
Dopełniacz (zwykle surowica świnki morskiej – zawiera najwięcej dopełniacza)
Amboceptor (dwuchwytnik) hemolityczny – przeciwciała hemolityczne, które mają zdolność hemolizowania krwinek czerwonych barana, ale tylko w obecności dopełniacza
Krwinki czerwone barana
I układ bakteriolityczny – składniki 1,2,3
II układ hemolityczny (wskaźnikowy) – składniki 3,4,5
Dopełniacz (3) może się wiązać z I lub II układem.
Miareczkowanie dopełniacza – najważniejszy moment OWD, decydujące o uzyskaniu miarodajnych wyników – ustalanie odpowiedniej dawki dopełniacza tzn. może go być tylko tyle, by wystarczył do wiązania ALBO w I fazie ALBO tylko w II fazie odczynu (przy nadmiarze dopełniacza wszystkie próby dadzą wynik ujemny - hemolizę).
Do OWD używa się tą ilość dopełniacza, która podczas miareczkowania spowodowała hemolizę (pierwsza probówka z hemolizą w szeregu).
Obecność swoistych przeciwciał dla antygenu diagnostycznego w badanej surowicy – powstaje kompleks antygen-przeciwciało, który wiąże dopełniacz i po dodaniu układu komórek wskaźnikowych (krwinki czerwone barana i amboceptor hemolityczny) – krwinki nie ulegają hemolizie (brak wolnego dopełniacza). Próba mętna, brak hemolizy, wynik dodatni, obecne przeciwciała.
Brak swoistych przeciwciał dla antygenu diagnostycznego w badanej surowicy – brak kompleksu antygen-przeciwciało, brak aktywacji dopełniacza (wolny) przez I układ bakteriolityczny, dopełniacz wchodzi w II układ – hemolityczny, następuje hemoliza krwinek – wynik ujemny, brak przeciwciał.
Pozyskiwanie amboceptora – przeciwciała hemolityczne dla krwinek czerwonych barana otrzymujemy przez uodpornienie królika krwinkami czerwonymi barana. Surowica królika z przeciwciałami hemolitycznymi przed użyciem jest inaktywowana.
Badana surowica – przed użyciem inaktywujemy w temp. 56 ̊C przez 30 min. w łaźni wodnej w celu zniszczenia dopełniacza obecnego w każdej surowicy i usunięcia jej ewentualnych właściwości antykomplementarnych.
Dopełniacz – gotowy preparat handlowy (liofilizowana surowica świnki morskiej).
Krwinki czerwone barana – pobierane zawsze od jednego dawcy i mieszane w równych objętościach z płynem konserwującym Alsevera (okres przydatności 4-5 tygodni.
Właściwości antykomplementarne – pewne surowice ludzi i zwierząt (koni, bydła, zwłaszcza psów) mogą, mimo przeprowadzania inaktywacji, wiązać dopełniacz w sposób nieswoisty (pomimo baku kompleksu antygen-przeciwciało – aktywatora dopełniacza). Dla wykazania tych właściwości wykonuje się kontrolę badanej surowicy.
W przypadku właściwości antykomplementarnych badanej surowicy – w probówce nie zachodzi hemoliza (wynik dodatni).
Prawidłowa surowica (bez właściwości antykomplementarnych) powinna wyglądać jak odczyn ujemny (hemoliza).
Jednym ze sposobów pozbywania się tych właściwości jest przetrzymywanie surowicy prze 3 i więcej dni po pobraniu w temperaturze 4 ̊C.
Właściwości prokomplementarne – niektóre surowice np. świń wykazują właściwości hemolityczne w stosunku do krwinek czerwonych barana i silniej aktywują dopełniacz, co powoduje, że jego dawka użyta w odczynie staje się za duża, powstaje fałszywie ujemny wynik (w przeciwieństwie do świnki morskiej, w surowicy świń jest dużo 3 frakcji dopełniacza: w związku z tym OWD u świń znalazło małe zastosowanie.
W laboratorium wykonujemy kontrolę badanej surowicy tzn. sprawdzamy czy surowica aktywuje dopełniacz.
Badanie odporności komórkowej
Odporność komórkową wykrywa się in vivo próbami alergicznymi np. tuberkulinową, maleinową i in vitro za pomocą wielu odczynów np. hamowanie migracji komórek i transformacji blastycznej.
In vitro interesuje nas frakcja z limfocytami, które są odpowiedzialne za odporność komórkową. Sprawdzamy, czy komórki te zetknęły się już wcześniej z danym antygenem.
Jeśli tak, ulegają transformacji blastycznej i wydzielają limfokiny.
Jeśli nie – komórki dopiero uczulają się na ten antygen.
Odczyn hamowania migracji komórek
Istota polega na hamowaniu makrofagów pod wpływem limfokiny MIF (Migration Inhibition Factor) oraz leukocytów przez czynnik LMI (Leukocyte Migration Inhibition)
Metoda klasyczna – jest, ale nie ważne, nie jest wykonywana, nie mamy się o niej uczyć
Metoda w agarozie – wykonanie odczynu w żelu agarowym na płytkach Petriego wycinamy baseniki, do których wprowadzamy leukocyty (limfocyty, makrofagi) badanego osobnika eksponowane na antygen. Po odpowiednim czasie inkubacji mierzymy strefę migracji wokół baseniku. W kontroli komórki nie mają kontaktu z antygenem. W obu metodach wynik badania podaje się jako tzw. indeks migracji (IM) – obliczany według wzoru:
IM = średnie pole migracji w hodowli z antygenem / średnie pole migracji w hodowli bez antygenu
Wartości niższe niż 0,8 uważa się za wynik dodatni odczynu przemawiający za istnieniem pobudzonej odporności komórkowej.
Test transformacji blastycznej limfocytów
Polega na przemianie – transformacji limfocytów w limfoblasty pod wpływem antygenu, które są większe od komórek macierzystych i wykazują zmiany mitotyczne. Transformację można wykazać mikroskopowo lub przez pomiar syntezy DNA.
Ocena mikroskopowa
Mieszamy frakcję białokrwinkową z antygenem. Inkubujemy i liczymy blasty (formy blastyczne limfocytów – limfoblasty) w rozmazie.
Ocena biologiczna
Mieszamy limfocyty z antygenem i dodajemy tymidynę H3 (znakowaną trytem) i mierzymy liczbę impulsów tzw. cpm po inkubacji mieszaniny. Dodatkowo wykonujemy próbę kontrolną – bez antygenu (płyn hodowlany + limfocyty + tymidynę H3).
Obliczamy:
IS(RI) = cpm próby z antygenem / cpm próby kontrolnej