BIOCHEMIA ENZYMY

BIOCHEMIA ENZYMY + KOENZYMY

  1. WYJAŚNIJ POJĘCIA

  1. Centrum allosteryczne-zdolne do przyłączenia specyficznego efektora; jest to miejsce w apoenzymie, do którego przyłączają się efektory (drobnocząsteczkowe związki wpływające na aktywność enzymu). Enzymy, których aktywność jest regulowana w ten sposób, nazywamy enzymami allosterycznymi.

  2. Aktywność właściwa- aktywność enzymu wyrażona w stosunku do 1mg białka.

  3. Zymogen- np. trypsynogen chymotrypsynogen pepsynogen; czyli formy nieaktywne trawiennych enzymów proteolitycznych, katalizujących rozkład wiązań peptydowych w białkach.

  4. FAD- dinukleotyd flawinoadeninowy, koenzym przenoszący protony i elektrony. Razem z FMN[mononukleotyd flawinowy] są spokrewnione z witaminą B2, współdziałają z kilkoma typami oksydoreduktaz. Współdziałają z reduktazami lub w niektórych przypadkach bezpośrednio z zubstratu czyli z dehydrogenazami. Grupą czynna przy przenoszeniu protonów i elektronów jest układ izoalloksazyny, który odracalnie może je przyłączyć do atomów azotu w pozycjach 1 i 5.

  5. Krzywa progresji- zależność ilości rozłożonego substratu [µmole rozłożonego H2O2]od czasu.z wykresu wyznacza się szybkość reakcji dla czasu zerowego[ v0].

  6. Enzym immobilizowany- preparaty wytworzone przez połączenie biokatalizatora z nośnikiem nierozpuszczalnym w środowisku reakcji, a także nierozpuszczalne agregaty cząsteczek lub kryształów białka oraz enzymy zamknięte w strukturze żelu lub oddzielone od środowiska reakcji półprzepuszczalnymi membranami.

  7. Kataliza heterogeniczna- np. gdy katalizator jest stały a reagujące substancje są gazami

Jeśli katalizator stanowi odrębną fazę w układzie reagującym to katalizowana reakcja przebiega na granicy faz i wówczas mamy do czynienia z katalizą niejednorodną (heterogeniczną, wielofazową). Najczęściej katalizator jest wtedy ciałem stałym, reakcja zaś przebiega pomiędzy substancjami gazowymi. Np. katalityczne syntezy prowadzone są przeważnie z udziałem katalizatora stałego (metalu lub tlenku metalu).

  1. NAD- dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy, i jego fosforan NADP+ współdziałają jedynie z dehydrogenazami, a wiele reakcji z ich udziałem ma charakter odwracalny. Są zwykle specyficzne w stosunku do jednego z tych koenzymów, a często nawet do ich formy utlenionej lub zredukowanej, co świadczy o preferowaniu kierunku utleniania bądź redukcji substratu.

  2. Izomeraza- przenoszenie grup w obrębie cząsteczki.

– reakcja chemiczna, polegająca na przekształceniu się jednego izomeru w drugi, np. izomeryzacja kwasu (−)mlekowego w kwas (+)mlekowy w wyniku inwersji Waldena. Izomeryzacja może stanowić zarówno samodzielną reakcję chemiczną, jak i być ubocznym, często niepożądanym efektem innej reakcji chemicznej.

  1. Wyprowadź równanie michaelisa menten

Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu jest zgodna z równaniem michaelisa menten: v=V[S]/Km+[S]

Gdy szybkość reakcji jest równa połowie szybkości maksymalnej, tzn v=V/2 , to równanie reakcji można przekształcić w następujący sposób: V/2=V[S]/Km+[S] ; Km+[S]=2[S] Km=[S]

Postać równania Km = [S] jest matematycznym zapisem definicji stałej Michaelisa Menten: Km jest to stężenie substratu [w mol/dm3], rzy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie jej szybkości maksymalnej [granicznej].

  1. Podaj sposoby odwrócenia inhibicji kompetycyjnej i niekompetycyjnej

Inhibicja kompetycyjna- hamowanie współzawodniczące może być częściowo zniesione przez zwiększenie stężenia substratu oraz od stosunku powinowactwa enzymu do inhibitora i substratu.

Inhibicja niekompetycyjna- w przeciwieństwie do hamowania przez współzawodnictwo , inhibicji niewspółzawodniczącej nie można cofnąć przez zwiększenie stężenia substratu; zniesienie inhibicji może nastąpić jedynie przez związanie inhibitora ze związkiem o większym powinowactwie do niego wg reakcji: EI+X= E +XI lub ESI+X= ES+XI

Czasem jednak powinowactwo enzymu do inhibitora jest tak duże że reakcja nie jest możliwa do odwrócenia, mówi się wtedy o inhibicji nieodwracalnej. Np. w przypadku działania insektycydów fosforoorganicznych nie niektóre grupy OH w centrum aktywnym np. esterazę acetylocholinową, funkcjonującą w systemie nerwowym zwierząt

  1. Co to jest szybkość początkowa i do czego służy

To właściwa miara aktywności katalitycznej enzymu, szybkość reakcji w chwili t=0; ilość mikromoli powstałego substratu w ciągu 1min w optymalnych warunkach.

Służy do określenia ile nadmanganian potasu utlenia H2O2 w metodzie oznaczania aktywności enzymu: miareczkowaniu.

  1. Wymień koenzymy transferaz, podaj ich skróty, całe nazwy oraz jakie cząsteczki przenoszą

Koenzym A [ CoA-SH] i kwas pantotenowy- przenośnik grup acylowych

Koenzym F , kwas tetrahydrofoliowy [THF] –pośrednik przy przenoszeniu grup C1[oprócz CO2] np. metylowej, hydroksylowej i formylowej.

Biotyna – witamina H- przenosi grupy karboksylowe,

Difosforan tiaminy [DPT] i witamina B 1- przeniesienie grupy ketolowej

Fosforan pirydoksalu [PLP] i witamina B6, czyli pirydoksyna- przenosi grupy aminowe

  1. Jak wykryć amylazy i katalazy

Katalazy: - Do dwóch probówek wlać po 2 ml wyciągu ziemniaczanego do kolejnych dwóch po 2 ml wyciągu z kapusty. Jedną probówkę z każdej pary ogrzać do wrzenia i ostudzić. Do wszystkich probówek dodać po 2 ml 3% H2O2. Obserwować zmiany [Inhibitory katalazy są charakterystyczne dla większości metaloenzymów. Są nimi cyjanki, fluorki, siarczki, azydki, kwasy i zasady, a także substrat czyli H2O2(!).

- oznaczanie katalazy metodą Eulera Josephsona- Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru na wodę i tlen. Ilość nierozłożonego H2O2oznacza się manganometrycznie w próbkach z czynnym i nieczynnym enzymem. Z różnicy wylicza się ilość rozłożonego nadtlenku wodoru.

2 H2O2→2 H2O + O2

5 H2O2 + 2 KMnO4 + 4 H2SO4 → 5 O2+ 2 KHSO4 + 2 MnSO4 + 8 H2O

Amylazy: - Wszystkie amylazy należą do klasy hydrolaz i podklasy glikozydaz. Amylaza trzustkowa wykazuje wyższą aktywność od amylazy ślinowej. Enzym ten działa jeszcze w rozcieńczeniu 1: 100 000 000, a w ciągu 30 min 1 mg amylazy trawi 20 g skrobi. Do tej aktywności niezbędne są niektóre jony nieorganiczne, szczególnie chlorki. Amylaza trzustkowa, w odróżnieniu od ślinowej, hydrolizuje skrobię niegotowaną.

Wykonanie:

Do 3 ml 1% roztworu skrobi dodać kroplę 0,2% roztworu jodu w KI, parę kropli 1% roztworu

NaCl i skrawek utartej trzustki. Wstawić do łaźni wodnej o temp. 40st C. Obserwować odbarwienie się zawartości probówki i wyciągnąć wnioski.

  1. W czym bierze udział FAD i difosforan tiaminy

FAD dinukleotyd flawinoadeninowy bierze udział w przenoszeniu protonów i elektronów

Difosforan tiaminy DPT, przenosi grupy współdziałające z transferazami, grupy ketolowe.

  1. Od czego zależy inhibicja niekompetycyjna[stopień zahamowania reakcji]

Zależy od stężenia i powinowactwa enzymu do inhibitora

[Inhibicja niewspółzawodnicząca może polegać zarówno na tworzeniu kompleksu enzymu z inhibitorem według reakcji: E+I=EI któóa jednak w tym przypadku nie jest łatwo odwracalna lub na połączeniu inhibitora do kompleksu ES w reakcji ES+I=ESI]

  1. Reakcja brunatnienia opisać

Jest to szereg złożonych reakcji chemicznych, jakim podlegają różne produkty pochodzenia

roślinnego i zwierzęcego, prowadzących do wytworzenia się ciemnego zabarwienia produktu. Różne aldehydy i ketony, w tym cukry redukujące kondensują łatwo z aminokwasami, aminami, peptydami, czy też z białkami, tworząc tzw. zasady Schiffa.

Wykonanie: 10 ml roztworu GG w buforze fosforanowym wlać do zlewki na 25 ml (zlewkę opisać). Doprowadzić pH roztworu do wartości 8,0 za pomocą 2 M i 0,2 M NaOH. Po ustaleniu pH, roztwór przelać do cylindra na 25 ml ze szlifem i dopełnić wodą destylowaną do 20 ml. Przelać do zlewki na 25 ml i przeczytać pH otrzymanego roztworu, następnie pobrać 10 ml do opisanej probówki.Kolejne 10 ml wyjściowego roztworu GG przelać do zlewki na 25 ml. Doprowadzić pH do wartości 5,0 za pomocą 2 M i 0,5 M HCl. Pozostałe czynności powtórzyć tak jak poprzednio.

Przygotowane probówki z wszystkimi roztworami cukrów (po dwie z każdej grupy) wstawić

jednocześnie do wrzącej łaźni wodnej na 20 minut. Po tym czasie probówki wyjąć z łaźni i

schłodzić. Czytać absorbancję każdego roztworu na spektrofotometrze przy długości fali 430 nm wobec wody destylowanej. Bardzo ciemne roztwory należy uprzednio rozcieńczyć wodą

destylowaną, aby odczyt mieścił się w zakresie 0,1-0,8. W takich przypadkach odczytaną

absorbancję należy pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.

  1. Na wykresie Lineweavera - Burka przedstaw reakcję niehamowaną i hamowaną współzawodnicząca. Krótko omów

Aktywność katalityczna enzymów może zostać zmniejszona poprzez przyłączenie

swoiście działających cząsteczek inhibitora. Typ inhibicji można określić przeprowadzając

reakcje enzymatyczne przy różnych stężeniach substratu oraz inhibitora i wyznaczając

wartość Km i Vmax, a następnie przedstawiając graficznie wyniki analiz.

  1. Podział amylaz i ich specyficzność do wiązań

rozróżniamy 2 rodzaje amylaz: α-amylazę oraz β-amylazę. W świecie organizmów żywych α-amylaza jest szeroko rozpowszechniona. Jest produkowana przez człowieka oraz inne ssaki w śliniankach oraz wydzielana przez trzustkę do jelita cienkiego. Natomiast β-amylaza jest obecna u drożdży, bakterii oraz roślin, szczególnie w nasionach. Amylazy wymagają do pełnej aktywności obecności jonu Ca2+, który poprawia stabilność enzymu oraz bierze udział w reakcji katalitycznej. Enzymy z tej grupy są aktywowane w obecności jonów chlorkowych lub innych anionów.

α-Amylaza hydrolizuje wiązanie α-(1-4)glikozydowe amylozy dając cząsteczki maltozy (disacharydy α-glukozy).

β - Enzym rozkładający skrobię. Odszczepia on z łańcucha skrobiowego maltozę, przy okazji powstaje także glukoza i maltotrioza.

  1. Na czym polega mechanizm negatywnego sprzężenia zwrotnego

Mechanizm negatywnego sprzężenia zwrotnego wykorzystuje efekt allosteryczny. Regulowany enzym jest białkiem allosterycznym, a więc zawiera dodatkowe centrum allosteryczne. Końcowy produkt przemiany [np. CMP] jest natomiast efektorem allosterycznym, który łączy się z białkiem enzymu i powoduje jego modyfikację, a tym samym zahamowanie aktywności.

[Przykładem negatywnego sprzężenia zwrotnego jest regulacja biosyntezy cytydynomonofosforanu [ CMP] lub syntezy izoleucyny przebiegającej w komórkach escherichia coli. Synteza CMP rozpoczyna się od kondensacji Asp z karbamoilifosforanem[CP], katalizowanej przez enzym karbamoilotransferazę asparaginianową. Po kilku przemianach pośrednich wytwarza się CMP, który bierze udział w licznych przemianach metabolicznych. Gdy jednak stężenie CMP wzrośnie ponad wartość krytyczną, związek ten zaczyna hamować enzym katalizujący pierwszą reakcję, czyli sam hamuje swoje wytwarzanie. Gdy stężenie CMP ponownie się zmniejszy wskutek użytkowania w reakcjach metabolicznych, enzym zostaje odblokowany i ciąg reakcyjny zaczyna funkcjonować ponownie.]

  1. Cechy dobrego katalizatora

- powinien zwiększać prawdopodobieństwo zdarzeń

- zmniejszać barierę energetyczną

- ukierunkowywać cząsteczki substratów względem siebie

  1. Opisać doświadczenie jak wykryć oksydazy w ziemniaku

W ziemniakach podobnie jak w innych tkankach roślinnych występują licznie tzw. oksydazy

fenolowe. Posiadają one zdolność utleniania jednofenoli (oksydazy jednofenolowe), dwu - i

trójfenoli (oksydazy wielofenolowe) do chinonów, które kondensując często tworzą barwne

pochodne. Elektrony z tych substratów są przenoszone przez oksydazy na tlen atmosferyczny.

Opisane reakcje są przyczyną ciemnienia niektórych tkanek roślinnych pojawiającego się w

odpowiedzi na kontakt z tlenem powietrza.

Doświadczenie: ekstrat z ziemniaka, zawierający skrobię i enzymy zdekantować i przesączyć. Do 6 probówek wlać ekstrat, do pierwszych dwóch dodać r-r fenolu, do kolejnych 2 r-r pirokatechiny, do kolejnych 2 –r- pirogalolu; następnie do jednej probówki z każdej pary dodać r-r H2O2 . obserwować zmianę zabarwienia. W

probówkach zawierających obok związków fenolowych H

2O2

zmiana zabarwienia następuje o

wiele szybciej bowiem równocześnie działają oksydazy i peroksydazy.

Podobną reakcję obserwuje się nawet bez powyższych odczynników, np. na obranym

ziemniaku, który po pewnym czasie sinieje, ponieważ zawarte w nim związki typu o-dwufenoli ulegają utlenieniu. Z tego samego powodu obrane ze skórki jabłko brązowieje.

  1. Km- podane wartości Km dla danej inhibicji oraz V max które było sobie równe na tej podstawie stwierdzić jaki to rodzaj inhibicji i ją opisać[ współzawodnicza]

Inhibicja współzawodnicza polega na konkurencji pomiędzy inhibitorem I a substratem o centrum aktywne enzymu, co można przedstawić za pomocą reakcji: E+S ES => E+P

E+I EI

Zgodnie z 2 reakcją, inhibitor wiąże przejściowo część znajdujących się w roztworze cząsteczek enzymu, musi nastąpić zmniejszenie szybkości reakcji właściwej. Inhibitor ma w tym przypadku strukturę podobną do substratu, ale kompleks EI nie jest zdolny do dalszej przemiany w produkt. Typowym przykładem inhibicji współzawodniczącej jest hamowanie przemiany bursztynianu do fumaranu, katalizowanej przez dehydrogenezę bursztynianową.

  1. Scharakteryzować enzymy soku trawiennego

Trypsyna, chymotrypsyna, elastazy; te 3 enzymy należą do rodziny enzymów o nazwie proteazy serynowe- serynowe ponieważ mają w miejscu aktywnym resztę seryny, której udział w katalizie jest krytyczny a ‘proteazy’, ponieważ katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białku. Rozszczepiają wiązania peptydowe w białkowych substratach po karboksylowej stronie pewnych reszt aminokwasów.

Trypsyna rozszczepia po karboksylowej stronie dodatnio naładowanych reszt Lys lub Arg.

Chymotrypsyna – po karboksylowej stronie stronie dużych reszt aminokwasów aromatycznych i hydrofobowych

Elastaza – po karboksylowej stronie reszt o krótkich, nie naładowanych łańcuchach bocznych.

Różna specyficzność tych enzymów jest narzucona przez charakter grup aminokwasów w miejscach wiązania substratu na który działają. Trypsyna ma w swym miejscu wiązania substratu ujemnie naładowaną resztę Asp, która oddziałuje z dodatnimi ładunkami na bocznych łańcuchach Lys i Arg substratu. Chymotrypsyna ma w miejscu wiązania substratu reszty aminokwasów o krótkich łańcuchach bocznych takie jak Gly i Ser, co umożliwia wejście do tych miejsc dużych łańcuchów bocznych substratu. Elastaza ma względnie duże nie naładowane boczne łańcuchy aminokwasów Val i Thr, wystające do miejsca wiązania substratu, co pozwala na wejście do tego miejsca wyłącznie krótkich łańcuchów bocznych Gly i Ala substratu.

  1. Opisać wpływ pH na działanie enzymów

Wpływ pH na białka enzymów jest dwojakiego rodzaju; skrajne wartości pH wpływają na nie denaturująco i nieodwracalnie hamują ich działanie, natomiast niewielkie odchylenia od wartości optymalnej [przy której obserwuje się największą szybkość katalizowanej reakcji], mogą nieznacznie denaturować białko, a mimo to wpływają na zmniejszenie szybkości reakcji.zjawisko drugiego rodzaju wynika z wpływu stężenia jonów wodorowych na dysocjujące grupy[aminowe i karboksylowe] występujące w resztach aminokwasowych łańcucha peptydowego, a zwłaszcza w bezpośrednim sąsiedztwie centrum aktywnego enzymu. Zmiana stopnia dysocjacji tych grup pod wpływem zmiany pH roztworu powoduje zmianę układu ładunków, a tym samym struktury trzeciorzędowej białka, co może zmniejszyć aktywność enzymu. Ponieważ zmiany pH wpływają na stopień uprotonowania grup centrum aktywnego, muszą wpływać również na szybkość reakcji.


Wyszukiwarka