Spektrofotometria znajduje szerokie zastosowanie w chemii analitycznej, biologii, medycynie i badaniach materiałowych.
Wiele laboratoriów ma problem z izolacją RNA. Ten wstępny etap może zaważyć na powodzeniu lub klęsce całej serii badań, ponieważ RNA zanieczyszczone odczynnikami używanymi podczas ekstrakcji będzie nieefektywnie odwrotnie-transkrybowane. Dlatego niezwykle ważna jest kontrola wyizolowanego RNA przed jakąkolwiek obróbką enzymatyczną.
Podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych używa się rozpuszczalników organicznych (fenol, chloroform, alkohole) oraz soli (np. chlorek lub izotiocyjanian guanidyny), które mogą inhibować reakcje enzymatyczne takie jak PCR, RT-PCR, znakowanie rybonukleotydów i inne. RNA zanieczyszczone solami także szybciej degraduje (nawet przechowywany w -80 °C!). Dlatego tak ważna jest poprawna analiza jakościowa i ilościowa każdej próbki. Wygodną formą takiej analizy jest pomiar absorbancji przy długości fali 230, 260 i 280nm. Obecnie większość laboratoriów dysponuje systemami typu NanoDrop (Thermo Scientific), które mierzą te parametry w kropli <1,5ul i automatycznie przeliczają absorbancję na stężenie i czystość białkową oraz organiczną. Wyznaczają także wykres absorbancji, bardzo pomocny przy ustalaniu źródła zanieczyszczeń kwasów nukleinowych.
gdzie l – to długość drogi optycznej w kuwecie. Przyjmuje się, ze wartości współczynnika ekstynkcji
wynosi 6600 M-1cm-1.
Stężenie dwuniciowego DNA C(μg/ml)=(A260-A320)*50*rozcieńczenie
Stężenie jednoniciowego DNA C(μg/ml)=(A260-A320)*33*rozcieńczenie
Stężenie RNA C(μg/ml)=(A260-A320)*40*rozcieńczenie
Pomiar stężenia DNA w roztworze oznacza się poprze pomiar absorpcji przy długości fali λ = 260 nm,
określanej często jako OD – gęstość optyczna.
Pomiary wykonuje się najczęściej w kwarcowych kuwetach o drodze optycznej 10mm.
Idealny roztwór do pomiarów spektrofotometrycznych DNA to bufor o niskim stężeniu jonów, np. bufor TE. Bufor stosowany najczęściej do elucji i długotrwałego przechowywania kwasów nukleinowych. Optymalny zakres pH zapewnia stabilość kwasów nukleinowych w trakcie przechowywania. EDTA zawarty w buforze chelatuje jony dwuwartościowe będące kofaktorami nukleaz, chroniąc w ten sposób kwasy nukleinowe przed degradacją. TRIS zapewnia utrzymanie właściwego pH roztworu, które nie interferuje negatywnie w reakcjach następczych.
spektrofotometryczny pomiar ilości UV zaabsorbowanego przez zasady w DNA jest prosty i dokładny jeśli próbka jest czysta (bez znacznych ilości zanieczyszczeń białkowych, fenolowych czy agarozy)
Należy jednak pamiętać, że jest to wartość przybliżona, ponieważ wartość współczynnika ekstynkcji zależy od składu zasad azotowych w DNA.
Stosunek A260/A280 jest natomiast często stosowna miarą czystości roztworu DNA, a ściślej miarą zanieczyszczenia DNA białkami (maksimum absorpcji UV dla białek wynosi 280 nm).
Absorpcja mierzona przy długości fali 230 odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące od węglowodorów, białek lub fenolu.
Wyszukiwarka