TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

TRAWIENIE WEKTORA, ENZYMY RESTRYKCYJNE

1. enzymy restrykcyje (jak działają, czego potrzebują do swojej aktywności, definicja jednostki aktywności, warunki przechowywania i ich konsekwencje, aktywność gwiezdna, jak zatrzymać reakcje trawienia)*

2. metylacja DNA i jej konsekwencje

3. izoschozomery

4. neoschizomery

5. izokaudamery

6. palindrom

7. cechy dobrych wektorów ekspresyjnych (przypomnieć sobie dyskusje na temat zadania 8 z listy 2 z BM)

8.końce lepkie, tępe, kohezyjne, komplementarne, kompatybilne

9. fosfatazy

10. superskręcony DNA

Enzymy restrykcyjne do swojej aktywności wymagają:
-kationu dwuwartościowego

-buforu (TrisxCl) dla utrzymania optymalnego pH

-odczynniki tiolowe mogą być użyteczne dla stabilizacji enzymu a także potencjalnych zanieczyszczeń
-niektóre er są bardzo wrażliwe na stężenie jonów sodowych lub potasowych (siła jonowa-im wyższa, tym słabsze oddziaływania elektrostatyczne)

Zatrzymywanie reakcji trawienia:

-dodanie EDTA, który chelatuje jony Mg2+

-ekstrakcja (fenol/chloroform) - inaktywacja białek w próbce, DNA zostaje w fazie wodnej, na granicy faz= zdenaturowane białko. nieodwracalne metody inaktywacji enzymu oraz usuwanie
-wytrącanie w etanolu wszystkich cz. er

-inaktywacja pod wpływem temperatury-inkubacja w 65C przez 20 min. (żeby nie dopuścić do wzrostu bakterii)-niektóre pozostaję aktywne w 65C ale tracą swoją zdolność do cięcia w wyższej temperaturze, enzymy termofilne, których optimum zawiera się w 50-55C mogą być inaktywowane-80C przez 20 min.
Bufor do ER:

- MgCl (Mg 2+ potrzebne do aktywności enzymu) , NaCl/KCl

- TrisxCl - optymalne pH dla funkcjonowania enzymu

- 2-merkaptoetanol (2-ME) lub DTT ditiotreitol - uzyteczne przy stabilizacji niektórych ER lub mogą stabilizować potencjalne zanieczyszczenia

- BSA - używane jako nośnik i stabilizator białka w trawieniu enzymem restrykcyjnym; odmiareczkowuje zanieczyszczenia i imituje “warunki naturalne” - bo białko lubi towarzystwo innych białek, dodatkowo BSA jest białkiem inertnym tzn. jest w układzie, ale nie oddziałuje z nim.

Obniżoną wydajność reakcji powiązaną z zanieczyszczonymi próbkami DNA możemy znieść przez:

-zwiększnie ilości jednostek enzymu dodanego do mieszaniny reakcyjnej

-zwiększenie objętości mieszaniny reakcyjnej w celu rozpuszczenia potencjalnych inhibitorów

-zwiększenie czasu inkubacji

Niektóre próbki DNA (często miniprepy) mogą być zanieczyszczone DNazami, które wymagają jonów Mg2+ do swojej aktywności. Takie próbki przechowuje się w buforze zawierającym EDTA.

Trawienie genomowego DNA może być ułatwione poprzez dodanie polikationu spermidyny, która wiąże ujemnie naładowane zanieczyszczenia.

Aktywność gwiezdna

Obniżenie lub zanik specyficzności działania enzymów restrykcyjnych objawiajęce się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne; nazwa pochodzi od oznaczenia alternatywnej aktywności znakiem *, np. EcoRI*

Czynniki wpływające na pojawienie się aktywności gwiezdnej:

- wysokie stężenie glicerolu - zmienia stałą dielektryczną środowiska

- nadmiar enzymu w stosunku do DNA

- wydłużony czas inkubacji

- niska siła jonowa - im wyższa siła jonowa tym mniejszy wpływ oddziaływań elektrostatycznych (niespecyficznych)

- obecność odczynników organicznych, np. DMSO, etanol, glikol

- zastąpienie jonów Mg2+ innymi dwuwartościowymi, np. Mn2+

- wysokie pH (>8)

W przypadku aktywności gwiezdnej dodatkowe prążki DNA w żelu będą znajdowały się poniżej oczekiwanego prążka, nie powinno być żadnych dodatkowych prążków powyżej największego spodziewanego prążka.

Jednostka aktywności-jedna jednostka endonukleazy restrykcyjnej to ilość wymagana do całkowitej hydrolizy 1 ug testowego DNA w ciągu 60 min w całkowitej maksymalnej objętości reakcyjnej-50 ul w warunkach optymalnych podanych przez producenta.

Przechowywanie
Wszystkie enzymy przechowujemy w -20C oprócz Hin1 II, który jest bardziej stabilny w -70C

Izoschizomery-endonukleazy rozpoznające tę samą sekwencję. Mogą lub nie ciąć DNA identycznie produkując te same końce. Mogą produkować końce kompatybilne:
BamHI
5’-G|GATCC-3’

3-CCTAG|G-5’

BglII

5’-A|GATCT-3’

3’-TCTAG|A-5’

Neoschizomery-er rozpoznające tą samę sekwencę, ale mającą różną specyficzność cięcia, tną te rozpoznawane rejony w różnych miejscach.

Izokaudamery-er rozpoznające różne sześcionukleotydowe sekwencje, ale tworzące identyczne wystające końce (BamHI,BglIII

końce kompatybilne-identyczne końce DNA powstałe przez cięcie endonukleaz restrykcyjnych rozpoznających identyczne lub różne sekwencje (BamHI,BglII)

końce kohezyjne-końce lepkie, końce produktów trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi o niesparowanych odcinkach jednoniciowych; końce lepkie mogą ulegać hybrydyzacji z innym fragmentem restrykcyjnym o komplementarnym końcu.

Metylacja DNA-organizmy produkujące enzymy restrykcyjne chronią swoje własne DNA dzięki metylacji nukleotydów w miejscach rozpoznawanych przez endonukleazy. Specyficzna metylaza kowalencyjnie łączy grupy metylowe (kofaktor: S-adenozylometionina) z nukleotydami adeninowymi i cytozynowymi czyniąc je odpornymi na cięcia enzymów restrykcyjnych. Metylacja może nie wpływać, redukować lub całkowicie blokować skuteczność cięcia specyficznych sekwencji przez ER.

Metylazy u E.coli: dam - metyluje A w GATC; dcm - metyluje C w CC(A/T)GC

ssacze DNA - metylacja G i C

Aby rozciąć superkolisty plazmid lub wirusowe DNA potrzeba wiele jednostek ER.

Na działanie enzymów restrykcyjnych ma wpływ:

-zanieczyszczenia DNA (białka, fenole, chloroform, etanol, EDTA, SDS, wysokie stężenie soli). Najczęściej obecne zanieczyszczenia występują na etapie próbek przygotowanych podczas procedury miniprep.

Cechy dobrych wektorów ekspresyjnych:

- autonomiczna replikacja - własne miejsce ori - żeby mieć dużo kopii

- unikalne miejsca cięcia - umożliwiają wbudowanie insertu w dokładnie jedno określone miejsce

- polilinker

- geny kodujące oporność na antybiotyk - łatwiejsza selekcja

- system kontroli transkrypcji

- znaczniki umożliwiające wydzielenie bialka

State whether each of the following is or is not a desired characteristic of vectors and explain

why or why not.

(a) autonomous replication (d) small size

(b) unique restriction sites (e) circularity

(c) genes that confer antibiotic resistance

Answers a, b, c, and d are desired characteristics. Autonomous replication allows amplification

of the vector in the absence of extensive host cell growth. Unique restriction

sites allow the cutting of vectors at single, specific sites for the insertion of the foreign

DNA. Antibiotic resistance allows for the selection of those bacteria that carry the vector

or for insertional inactivation. Small size allows the insertion of long pieces of foreign

DNA without interfering with the introduction of the recombinant molecule into

the host bacterium. Answer e is not an essential characteristic because vectors do not

have to be circular to function effectively (e.g., bacteriophage l).

skręcenie toroidalne (w lewo, ujemne)-na histonach

skręcenie plektonomiczne (w prawo, ujemne) -bakteryjne

Glicerol zmienia stałą dielektryczną ośrodka, zapewnia środowisko reakcji, pomaga zachować

enzym w postaci stabilnej.

Superskręcony DNA porusza się szybciej w elektroforezie.

1. zagadnienia z poprzednich zajęć (+ materiały - będziemy kończyć omawianie roztworów i zagadnień związanych z restryktazami)

2. ruchliwość DNA w żelu

3. rola składników zawartych w 6xSB

4. różnica w długości fali podczas obserwowania żeli analitycznych i preparatynych

Ruchliwość DNA w żelu:

Czynnik	dsDNA liniowy	dsDNA superskręcony
Długość	Im dłuższy tym mniejsza ruchliwość	Im dłuższy tym mniejsza ruchliwość
Stężenie agarozy	Im wyższe tym mniejsza ruchliwość	IELEKTROFOREZA PREPARATYWNA W ŻELU AGAROZOWYM m wyższe tym mniejsza ruchliwość
Napięcie	Im wyższe tym większa ruchliwość*	Im wyższe tym większa ruchliwość*
Bromek etydyny	Im wyższe stężenie bromku tym mniejsza ruchliwość	**
Stopień superskręcenia	-	Im większy, tym większa ruchliwość

*przy zbyt wysokim napięciu wydziela się dużo ciepła, struktura żelu może ulec zniszczeniu

** u bakterii DNA jest skręcone ujemnie, w prawo (plektonemicznie), a bromek etydyny dodaje dodatnie skręty. Superskręcone DNA wędruje w żelu szybciej niż liniowe, więc do pewnego momentu ruchliwość będzie spadać wraz ze wzrostem stężenia bromku (rozwijanie skrętów ujemnych do liniowego DNA) a potem wraz ze wzrostem stężenia bromku zacznie wzrastać ruchliwość (bo gdy już będzie liniowe DNA zaczną być wprowadzane dodatnie superskręty) – „uśmiechnięty” wykres zależności ruchliwości od stężenia bromku, ale „smutny” żel.

6xSB

- błękit bromofenolowy

- ksylenocyjanol

- ficoll

Funkcje:

- zwiększenie gęstości próbki

- nadanie koloru probce

- zawiera barwniki, które poruszają się w kierunku anody z przewidywalnymi szybkościami: błękit bromofenolowy migruje w żelu agarozowym (0,5-1,4%) w ~ z tą samą szybkością, co liniowy dsDNA o długości 300 pz, a ksylenocyjanol ~ liniowy dsDNA o długości 4000 pz

Żele preparatywne oglądamy przy długości fali 365 nm, ze względu na to, że będziemy dalej używać zawartego w żelu DNA i nie chcemy, żeby zmutowało(powstawanie par T-T itp.) pod wpływem UV. Fala o długości 365 nm ma mniejszą energię niż 254 nm i ponad to jest adsorbowana bezpośrednio przez bromek etydyny, w przeciwieństwie do 254 nm, która jest przekazywana na bromek przez DNA. Żele analityczne oglądamy przy 254 nm, bo nie będziemy wykorzystywać dalej zawartego w żelu DNA więc jest nam wszystko jedno czy zmutuje, a przy 254 nm jest większa czułość niż przy 365 nm.

Agaroza jest liniowym polimerem składającym się z naprzemiennych reszt D oraz L-galaktozy połączonych alfa-(1->3) i beta-(1->4) wiązaniami glikozydowymi.

Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym:

-wielkość DNA-duże cząsteczki migrują wolniej niż małe z racji większych oporów tarcia oraz występowania w żelu porów

-stężenie agarozy

-konformacja DNA-mobilność poszczególnych form DNA zależy od: stężenia i rodzaju agarozy, przyłożonego napięcia, siły jonowej buforu, gęstości skręceń w formie superskręconej

-obecność bromku etydyny-interkalacja bromku etydyny w DNA powoduje spadek ujemnego ładunku i wzrost sztywności

-przyłożone napięcie (powinno być 5-8 V/cm)

-rodzaj agarozy

-bufor do elektroforezy-przy braku jonów przewodnictwo jest małe i DNA migruje wolno, gdy siła jonowa jest duża przewodnictwo jest dobre i generuje to znaczną ilość ciepła-żel i DNA mogą się zdenaturować

Bufory do elektroforezy

-TAE: Tris-acetate (octan), EDTA (pH 8.0; TAE)-nazywany również buforem E, najmniejsza pojemność buforowa, jeżeli elektroforeza jest prowadzona długo anodowa porcja żelu staje się kwasowata i bromofenol zmienia swoje zabarwienie z niebieskawo-filoetowego na żółte, dsDNA migruje w nim 10% szybciej niż w TBE czy TPE, zdolność rozdzielcza jest lepsza dla dużych cząsteczek DNA i gorsza dla małych

-TBE: Tris-borate (boran)

-TPE: Tris-phosphate (fosforan) (pH 7.5-7.8)

Gel-loading buffers

-zwiększają gęstość próbki zapewniając, że DNA wpadnie do studzienki

-dodają kolor ułatwiając proces nanoszenie na żel

-zawierają barwniki, które migrują w żelu: bromofenol jak 300 pz, ksylenocyjanol jak 4000 pz

Bromek etydyny

Zawiera 3 grupy pierścieniowe, które interkalują w DNA, jedna cząsteczka bromku etydyny interkaluje na 2,5 pz. Po wniknięciu leży prostopadle do osi i tworzy wiązania van der Waalsa z parami zasad leżacymi ponad oraz poniżej. Promieniowanie UV przy długości 254 nm jest absorbowane przez DNA i przekazywane do barwnika, 366 nm jest absorbowane bezpośrednio przez barwnik. Służy do wykrywanie jedno i dwuniciowych cząsteczek DNA i RNA, powinowactwo do jednoniciowych jest słabe dlatego fluorescencja jest słaba. Nie używamy go przy żelach poliakrylamidowych, ponieważ jest inhibitorem polimeryzacji akrylamidu. W obecności bromku etydyny prążki są mniej wyraźne.

Bromek wędruje w żelu w przeciwną stronę do DNA. DNA jest ujemnie naładowany więc wędruje do anody (elektrody dodatniej).

W przypadku naszego ćwiczenia elektroforeza preparatywna służyła wyizolowaniu tylko zlinearyzowanego wektora. Wyeliminowano zanieczyszczenia, EDTA i wszelkie aktywności enzymatyczne (BamHI, fosfatazę).

Bufor do elektroforezy preparatywnej musi być świeży, a żel agarozowy idelanie czysty.

Defosforylacja nie przebiega w 100%

Żeby sprawdzić jaki mamy stosunek transformantów do rekombinantów robimy 2 posiewy:

Aby zapobiec religacji wektora używamy 2 enzymów restrykcjnych, które tworzą inne końce. Mimo wszystko należy się zdefosforylować nawet przy takim trawieniu kierunkowym (bo kilka cząsteczek wektora może zostać strawione tylko przez 1 enzym i wtedy już są komplementarne końce).

pythonemPCR

1. czym jest PCR (etapy PCR i ich kolejność, czym kierować się podczas wybierania temperatur i czasów dla każdego z etapów)

2. co to insert

3. przypomnieć sobie dyskusje na temat zadania 9 z listy 2 z BM

4. cDNA

5. składy roztworów czyli co po co :) wymagania stężeniowe poszczególnych składników mieszaniny

6. polimerazy i ich aktywności

7. projektowanie starterów, na co zwrócić uwagę, czego unikaćz

8. potrzebna będzie mapa wektora pGEX-2T z pierwszych zajęć

9. wiedzieć co to jest ORF

1. PCR - Polymerase Chain Reaction, Reakcja Łańcuchowa Polimerazy. Metoda służąca do powielania łańcuchów DNA, polega na wielokrotnym podgrzewaniu i oziębianiu próbki.

Etapy:

1. Denaturacja wstępna-kluczowe jest, aby matryca DNA była całkowicie zdenaturowana na początku reakcji, żeby mieć pewność, że od pierwszego cyklu następuje PCR.

2. Denaturacja - rozplecenie podwójnej helisy matrycy DNA. Temperatura ok. 95C, 15 s (pękają wiązania wodorowe, podwójna helisa rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy).

3. Annealing- hybrydyzacja starterów z nićmi DNA. Gwałtowne chłodzenie do 50-60C. Starter tylny (wsteczny) hybrydyzuje z nicią kodującą, ale zawiera sekwencję nici matrycowej. Starter przedni hybrydyzuje z nicią matrycową, ale posiada sekwencję nici kodującej. Jeżeli powstają niespecyficzne produkty, temperatura hybrydyzacji powinna być zoptymalizowane (stopniowe (1-2C) podwyższanie). Jeżeli temperatura jest za wysoka startery słabo parują z matrycą i wydajność PCR jest słaba. Jeżeli temperatura jest zbyt niska startery parują niespecyficznie i otrzymujemy niechciane fragmenty DNA.

4. Synteza DNA (elongacja) - ogrzewanie do 72C (temperatura optymalna dla polimerazy DNA Taq). Polimeraza wydłuża sekwencje od starterów w kierunku sekwencji docelowej, ponieważ synteza DNA przebiega w kierunku 5’->3’.

5. Dokończenie polimeryzacji-żeby polimeraza mogła dokończyć wszystkie niedokończone produkty.

2. Insert - fragment kwasu nukleinowego wstawiony do genu lub chromosomu.

3. Zadanie 9. z listy drugiej-seminarium biologia molekularna

You have been supplied with the linker oligonucleotide d(GGAATTCC) and an isolated and purified DNA restriction fragment that has been excised from longer DNA molecule with a restriction endonuclease that produces blunt ends. Which of the following reagents would you need to tailor the ends of the fragments so it could be inserted into an expression vector at unique EcoRI cloning site?

(a) DNA polymerase (d) ATP

(b) All four dNTPs (e) DNA ligase

(c) EcoRI restriction endonuclease (f) Polynucleotide kinase

What would happen if the restriction fragment had an internal EcoRI site?

c, d, e, f.

The oligonucleotide must have a 5„-phosphate group to serve as a substrate for DNA ligase. Therefore, ATP and polynucleotide kinase would be used, as would bacteriophage T4 DNA ligase and ATP, to join the duplex form of the palindromic (self-complementary) oligonucleotide to the blunt-end fragment. Finally, the fragment with the linker covalently joined to it would be cut with EcoRI endonuclease to produce cohesive ends that match those of the cut vector. It is assumed that the fragment itself lacks EcoRI sites because, if one or more internal EcoRI sites were present, the fragment would be cut when it is treated with the enzyme to generate the cohesive ends. Such fragmentation of the DNA would complicate the joining reaction by forming product with various combinations of EcoRI-joined ends.

4. cDNA (komplementarny DNA, ang. complementary DNA) – DNA uzyskany poprzez odwrotną transkrypcję na matrycy mRNA uzyskanego z komórki. Nazwę tę nosi zarówno pojedyncza cząsteczka, jak i cała biblioteka genowa uzyskana w ten sposób. Ze względu na to, że mRNA pochodzi tylko od aktywnych transkrypcyjnie genów, cDNA reprezentuje w pewnym sensie zestaw informacji genetycznej, wykorzystywanej w komórce, tkance lub narządzie (zależnie od źródła komórek). Cechą charakterystyczną jest brak intronów, co jest wynikiem potranskrypcyjnej obróbki mRNA. W związku z tym na podstawie cDNA i znajomości kodu genetycznego można przedstawić profil syntetyzowanych w komórce białek oraz wykryć nowe, jeszcze nie zidentyfikowane cząsteczki białkowe.

5.Składy roztworów używane w PCR:

- matryca - zazwyczaj używa się od 5-30 ng. Duża ilość matrycy objawia się powstawaniem niespecyficznych produktów PCR.

- startery - starter przedni oraz wsteczny - w ilości zazwyczaj 50 pmoli. Są czynnikiem limitującym, muszą posiadać wolne końce 3’. Zbyt wysokie stężenie spowoduje powstawanie niespecyficznych produktów PCR. Procentowa zawartość par GC powinna się mieścić w przedziale 40-60%.

Mam jeszcze zapisane: dla ssDNA - max 100pmoli

dla dsDNA - max 50pmoli

Z każdą reakcją ubywa starterów, bo są wbudowywane do protduktu. W analityce zużywamy dużo mniej starterów - nawet rzędu fmoli.

- dNTP - w stężeniu końcowym = 200 uM. Nie może być ich zbyt dużo, ponieważ odmiareczkowują jony magnezu. Jeżeli jest dużo dNTP - reakcja przebiega w kierunku polimeryzacji. Stężenie wszystkich 4 muszą być równe. Powinny być rozpipetowane na małe partie(termodynamicznie niestabilne-częste rozmrażanie). Jeśli jest ich za mało, to też źle, ponieważ reakcja może się cofać (jeśli polimeraza ma aktywność odcinającą)

- dwuwartościowe jony Mg - występują przeważnie w buforze, jony Mg2+ wiążą się do dNTPów, starterów i matryc, jeżeli próbka DNA zawiera EDTA stężenie powinno być podwyższone-1cz. EDTA wiąże 1 jon Mg2+. Jeżeli siężenie będzie za wysokie powstaną niespecyficzne produkty PCR, jeśli za niskie wydajność PCR będzie słaba. Ich stężenie dobiera się w zależności od warunków.

- polimeraza (1-1,5u) - w zależności od polimerazy - dodawana do mieszaniny, lub podczas PCR w tzw. hot start. Zbyt wysokie stężenie polimerazy prowadzi do powstawania niespecyficznych produktów PCR. Jeżeli w mieszaninie obecne są inhibitory (np. zanieczyszczona matryca) stężenie polimerazy powinno zostać podwyższone (2-3u)

- bufor dla polimerazy-pH 8,3-8,8 w temp 25C, kiedy inkubujemy w 72 C pH mieszaniny reakcyjnej spada do ok. 7,2. Drugim rodzajem buforów stosowanych w do PCR są bufory fosforanowe, ale później zjadają ten bufor bakterie.

- jony jednowartościowe-siła jonowa, pH

- woda

Kolejność dodawania roztworów:

1. woda

2. bufor dla polimerazy

3. dNTP

4. startery

5. matryca

6. Mg2+

Redukcja niespecyficznego parowania i wzrost wydajności amplifikacji: formamid, dimetylosulfotlenek, glicerol

Inhibotory PCR: proteinaza K, jonowe detergenty, heparyna, hemoglobina, bromofenol, ksylenocyjanol, zanieczyszczenia

W PCR preparatywnym i analitycznym objętość próbki - 50 ul - aby powstające DNA miało się gdzie rozchodzić.

W PCR diagnostycznym - 10-20 ul

6. Polimerazy- enzymy mające zdolność syntezy nici komplementarnej na matrycy pojedynczej nici kwasu nukleinowego. W zależności od syntetyzowanej nici wyróżnia się polimerazy DNA syntetyzujące nić DNA (np. w procesie replikacji DNA) oraz polimerazy RNA syntetyzujące nić RNA (np. w procesie transkrypcji). W zależności od wykorzystywanej przez polimerazę matrycy mówi się o polimerazach zależnych od DNA, jeśli matrycą jest DNA, i polimerazach zależnych od RNA, jeśli matrycą jest RNA. Polimerazy są powszechnie używane w biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Przykładowo polimeraza Taq (polimeraza DNA zależna od DNA pochodząca z bakterii Thermus aquaticus) jest używana w reakcji PCR.

Aktywności:

a) nukleazowa - umożliwia naprawianie błędów w DNA przez eliminację nukleotydów niedopasowanych do matrycy (3’->5’ egzonukleazowa), inaczej korygująca (jest wymagana w PCR).

b) polimerazowa - synteza w kierunku 5’->3’.

c) 5’->3’ egzonukleazowa - odpowiada za usuwanie starterów (nie jest konieczna w PCR).

Polimeraza Aktywność

DNA I 3’->5’ , 5’->3’

fragment Klenowa 3’->5’

DNA II 3’->5’

DNA III 5’->3’

Inaktywacja: jonowe detergenty-SDS, ekstrakcja w układzie fenol/chloroform

Nazwa	Funkcja
Polimerazy prokariotyczne
Polimeraza DNA I	Usuwa starter I wypełnia powstałe po jego usunięciu luki w nici opóźnionej
Polimeraza DNA II	Naprawa DNA
Polimeraza DNA III	Główny enzym syntezujący DNA
Polimerazy eukariotyczne
Polimeraza DNA α	Polimeraza inicjatorowi
Podjednostka o aktywności prymazy	Syntetyzuje starter RNA
Podjednostka syntezująca DNA	Dodaje około 20 nukleotydów do startera
Polimeraza DNA β	Naprawa DNA
Polimeraza DNA δ	Główny enzym syntetyzujący DNA

7. Projektowanie starterów

- startery powinny składać się z 15-30 nukleotydów, najlepsza długość to 18 nukleotydów.

- temperatura topnienia starterów nie powinna być większa niż 70 stopni (tutaj mam coś o optymalnej temperaturze dla polimerazy) i mniejsza niż 54 stopnie.

- wzór na obliczanie temperatury topnienia: Tm=4*(G+C) + 2*(A+T)

- starter nie powinien kończyć się na a ani na t

- jeżeli startery przedni i wsteczny różnią się temperaturą topnienia, wtedy do obliczenia całkowitej temperatury topnienia bierzemy wartość niższą i odejmujemy od niej 2 stopnie.

Podnosząc temperaturę zwiększamy specyficzność; obniżając temperaturę - zwiększamy prawdopodobieństwo hybrydyzacji, ale hybrydyzacja ta traci na specyficzności, startery niekompletnie parują do matrycy.

- do projektowanych starterów trzeba wrzucić wąsy, na które składa się miejsce restrykcyjne danego enzymu.

- ostatecznie startery trzeba jeszcze zaopatrzyć w reszty bogate w G i C (zazwyczaj jest to GCCCGG), chyba, że wąsy posiadają dużo tych reszt, więc dokładamy parę A i T. Starter zaopatruje się w te reszty, ponieważ enzymy restrykcyjne, których używamy są to endonukleazy, czyli tną wewnątrz. Bez tych reszt musielibyśmy użyć egzonukleazy.

- pamiętać trzeba o ramce odczytu dla enzymów, czasami pożądane jest aby wprowadzić kodon Stopu. (UAA, UAG, UGA)

-startery przedni i wsteczny nie powinny ze sobą parować

-starter nie powinien tworzyć struktury spinki do włosów

-brak traktów polipurynowych oraz polipirymidynowych oraz dwunukleotydowych powtórzeń

8.

9.Otwarta ramka odczytu lub ORF (z ang. Open Reading Frame) jest każdą sekwencją DNA lub RNA, która potencjalnie może ulec translacji na białko. W genie ORF mieści się pomiędzy kodonem'START' (lub sekwencją START), a kodonem 'STOP'. ORF-y odnajduje się zwykle podczas przeczesywania sekwencji DNA przy poszukiwaniu potencjalnych genów. Dla różnych organizmów, z powodu różnorodności sekwencji 'START' istnieją zatem różne ORF-y. Typowy algorytm poszukiwania ORF uwzględni zatem kod genetyczny danego organizmu (łącznie z możliwymi jego odmianami) i wyszuka wszelkie możliwe ORF (z czego nie wszystkie muszą być prawidłowe).

W rzeczywistości, obecność ORF, szczególnie długiego, jest zazwyczaj dowodem na obecność genu, gdzieś w okolicznej sekwencji. W takim wypadku ORF jest częścią sekwencji kodującej, podlegającej translacji przez rybosomy. Jednak można spotkać także ORF-y nie będące częścią genu - zazwyczaj są one krótkie i kończą się zaledwie po kilku kodonach.

Po sekwencjonowaniu genu jest bardzo ważne, żeby wyznaczyć jego ORF. Dla organizmów z dwuniciowym DNA jego sekwencja może być odczytana na sześć różnych sposobów - trzy na nici wiodącej i trzy na nici opóźnionej. Zazwyczaj najdłuższa sekwencja, nie przerwana kodonem 'STOP' w obrębie genu jest jego ORF-em. Jakkolwiek sprawdza się to dla prokariota, u eukariota sprawa komplikuje się, gdyż ich geny zawierają długie sekwencje niekodujące - introny. ORF dla takich genów odnajduje się badając zazwyczaj mRNA będące ich produktem.

KOMÓRKI KOMPETENTNE

1. projektowanie starterów, na co zwrócić uwagę, czego unikać

2. potrzebna będzie mapa wektora pGEX-2T z pierwszych zajęć!!!

3. wiedzieć co to jest ORF + przyda się mała powtórka translacji, tj, START/STOP

4. sposoby ukompetentniania komóre i wprowadzania DNA do komórek (można znaleźć z Stryerze, lub w Gene cloning...)

5. co to OD, dlaczego 600 i po co czekamy na określoną wartość OD

6. dlaczego będziemy stosować tetracyklinę

7. Porównać składy roztworów A, B i C i zastanowić się dlaczego akurat takie są

8. Analiza genotypu szczepu, z którym pracujemy znaczenie poszczególnych markerów

9. na e-portalu każda z grup ma możliwość pobrania dokumentu z analizą densytometryczną wektora (gr. 4 ze środy znajdzie swoje pasmo pod numerem 7 na żelu z grupy piątkowej), spróbujcie wykoncypować jak na podstawie posiadanych danych można oszacować stężenie Waszych próbek, oprócz wspomnianego pliku przydadzą się Wam dokładne dane na temat markera z jakim pracowaliśmy (w tym użytej jego objętości) a także znajomość objętości próbki DNA niesionej na żel) - bez paniki jeśli ktoś sobie nie poradzi, zrobimy to wspólnie podczas najbliższych zajęć (dlatego miejcie ze sobą wydruk oraz dane o markerze)

Transkrypcja:

Promotor prokariotyczny:

Start: kaseta TATAAT (Pribnowa) rejon -10, rejon -35

Stop: spinka bogata w G-C i ciąg poliU

Translacja:

Prokarioty: sekwencja Shine-Dalgarno w mRNA na końcu 5’ rozpoznawana przez podjednostkę 16S rybosomu (16S rRNA-sekwencja anty Shine-Dalgarno) - mRNA policistronowe

Eukarioty: - kap na końcu 5’, sekwencja Kozak - mRNA monocistronowe

Start:AUG

Stop:UAA, UAG, UGA

Kompetencja może być indukowana przez:

- warunki wpływające hamująco na wzrost, np. wysokie stężenie cAMP

- gęstość populacji bakteryjnej CZY KTOŚ MOŻE TO ROZWINĄĆ????

- transbłonowy transport wapnia

- warunki żywieniowe

Inkubujemy do odpowiedniego OD (ok. 0,4), bo w inoculum było dużo martwych i starych komórek, a my chcemy mieć hodowlę w fazie wzrostu logarytmicznego. Hodowlę nadal prowadzimy w podłożu z tetracykliną, bo chcemy, żeby komórki potomne też dostawały plazmid z genem oporności. Mierzymy przy długości 600nm-rozproszenie światła przez komórki w zawiesinie.

Ukompetentnianie:

Kationy dwuwartościowe opłaszczają komórkę zmieniając ładunek na błonie na dodatni (oddziałują z ujemnym ładunkiem fosfolipidów). Przechowywanie w -80 C sprawia, że błona staje się bardziej przepuszczalna. Po dodaniu DNA adsorbuje się na powierzchni komórki (oddziaływania elektrostatyczne). Po zwiększeniu temperatury do 37 C DNA zostaje wchłonięte do komórki.

ELEKTROPORACJA-metoda fizyczna

LIGACJA

1. LIGAZY - co jest substratem, która ligaza do jakich końców jest polecana, warunki reakjci ligacji

2. sposoby wprowadzania DNA do komórek

3. Analiza genotypu szczepu, z którym pracujemy, znaczenie poszczególnych markerów

4. uzupełnić tabelę zamieszczoną pod linkiem

https://docs.google.com/document/d/1w8Uiin21ZAnk-bNlXTcs-eD8a-PLFxawx5LB_kYXhaU/edit

Ligazy

- katalizują tworzenie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy 3’-OH a 5’-P

- substratami mogą być DNA lub RNA

- źródła energii:

*ATP - fagi i eukarioty

*NAD+ - bakterie

- w komórce są zaangażowane w łączenie fragmentów Okazaki (nić opóźniona, replikacja), rekombinację i naprawę DNA

- w przypadku ligowania cząsteczek o tępych końcach (np. ligazą z faga T4) konieczny jest dodatek glikolu polietylenowego (PEG) do buforu ligacyjnego, aby zwiększyć prawdopodobieństwo połączenia tępych końców ze sobą (molecular crowding), PEG zagęszcza próbkę i spowalnia cząsteczki w roztworze.

Powinowactwo:

nicki>>końce kohezyjne>>końce tępe
Km
końce tępe>>końce kohezyjne>>nicki

Wykres
Z jednej strony byłaby temperatura optymalna dla ligazy-37 C. Z drugiej strony proces, który ogranicza ligację -hybrydyzacja-4 C. Co z tego, że ligaza będzie działać w 100% kiedy nasze końce nie hybrydyzują. Nie liguje się na lodzie. Znajdjemy złoty środek, żeby dogodzić obydwu-20 C-wartość wyznaczono eksperymentalnie.

Aktywacja ATP:

ATP +ligaza → AMP-ligaza + PPi PPi → 2Pi (nieodwracalność reakcji)

AMP-ligaza + 5’P-DNA → 5’P-DNA-AMP-ligaza

5’P-DNA-AMP-ligaza + 3’OH-DNA → DNA-DNA + ligaza + AMP

Dlatego używając znakowanego izotopem ATP nie możemy zaznakować DNA.

LIGAZA	kohezyjne końce	tępe końce	hybrydy DNA-RNA	hybrydy RNA-RNA
E. coli	+	+ (średnio)	-	-
T4	+	+	+	+
bakteria termofilna	+	-	-	-

Wysokie stężenia jonów jednowartościowych takich jak Na+ czy K+ hamuje aktywność ligazy T4, w obecności 10% PEG jednowartościowe jony stymulują aktywność ligazy.

Sposoby wprowadzania DNA do komórek:

1. użycie związków chemicznych zwiększających przepuszczalność błony (CaCl2, glikol polietylenowy)

2. metoda balistyczna - wstrzeliwanie DNA, kuleczki wolframowe opłaszczone cząsteczkami DNA są wstrzeliwane do docelowych komórek

3. lipofekcja - zamykanie DNA w liposomach

4. mikroiniekcja - wstrzykiwanie

5. elektroporacja - wspomaganie impulsem elektrycznym

Po wprowadzeniu naszego plazmidu do komórki bakteryjnej, nie ‘wrzucamy’ od razy komórek do karbenicyliny (rozważany przypadek naszego ćwiczenia), tylko dajemy jej trochę czasu na wyprodukowanie sobie odpowiednich białek nadających oporność, a zakodowanych na wprowadzonym plazmidzie. Innymi słowy, samo wprowadzenie plazmidu nie zapewnia od razu oporności, najpierw musi dojść do ekspresji genu kodującego białko nadające oporność.

Projektowanie mieszanin ligacyjnych

Warunki:

1. masa wektora: 10-100 ng

na pierwszą próbę najlepiej wybrać 50 ng a potem, jesli;

- wzrost murawowy - do kolejnej próby wziąć mniej wektora

- brak wzrostu - do kolejnej próby wziąć więcej wektora

2. stosunek molowy:

ninsert/nwektor w przedziale (1,5-3)

Jeśli użyje się za dużo insertu w stosunku do wektora, może dojśc do konkatameryzacji, czyli łączenia się insertów ze sobą, które też mogą być wstawione do wektora, a nie o to chodzi.

3. Temperatura ligacji:

Temperaturę trzeba tak dobrać, aby odpowiadała ligazie (Topt=37C), ale też umożliwiała hybrydyzację lepkich końców (im niżej tym lepiej ~ 4C). Wybiera się więc średnią temperaturę, czyli ~ 20C (tępe końce też ligujemy w temp ~ 20C, bo jeśli np kończą się ciągiem A lub T, to nie chcemy ich zdenaturować)

Stosowane warianty:

a) 20 C (RT), 1-4h - “na stole”

b) 14-16 C, 12 h - “przez noc”

c) 6-8 C, 24h - “całodobowa”

4. Objętość mieszaniny ligacyjnej: 20 ul - wystarczająco dużo, żeby parowanie nie odgrywało ważnej roli, ale też dostatecznie mało, co zwiększa szanse na spotkanie się wszystkich składników biorących udział w ligacji (wektor+insert+ligaza)

Przy ligacji tępych końców możemy podnieść stężenie wektora i insertu, żeby wszystko się ze sobą spotkało. Liguje się w temperaturze pokojowej tylko dajemy więcej czasu, można również dodać glikol polietynelowy.

JEDNOSTKA WEISS’A- to ilość enzymu która katalizuje wymianę 1nmol 32P zpirofosforanu w [γ,β~ 32P ] ATP w czasie 20min w temp. 20C 0,015 jednostki Waissa T4 Ligazy DNA liguje 50% fragmentów bakteriofaga po restrykcji endonukleazą Hind III.

ANALIZA GENOTYPU SZCZEPU

-ednA1-istotne, ponieważ gdyby gen był aktywny mógłby poszatkować nasze DNA

-hsdR17-ważne, jeśli będziemy propagować wektory w tym konkretnym typie komórek, to będzie to nasze DNA metylowane, to oznacza, że po oczyszczaniu pGEX’a możemy używać enzymów wrażliwych na metylacje, ponieważ nie przetnie naszego wektora, ponieważ ten szczep go metyluje

-lacIq-jest jeszcze na pGEX’ie, stanowi dodatkowe zabezpieczenie, żeby nie zachodziła translacja, dopóki nie będziemy chcieli

-lacZM15-nie, korzystalibyśmy z tego przy selekcji biało-niebieskiej

-proAB-nie istotna dla nas

-recA1-istotne, bakterie sama z siebie nie może rekombinować , gdyby mogła rekombinować mogłaby zmienić to, co jej dalismy a nam chodzi o to, żeby pracowała z DNA, które jej daliśmy, bakterie nie mogą się same naprawiać, trzeba je chronić przez światłem uV

-relA1-tzw. typ zrelaksowany, istotne-jeżeli bakterie będzie głodna zje wszystkie składniki odżywcze, które ma w pożywce wtedy w warunkach, gdzie istniałoby sprzężenie, to brak aminokwasu powodowałby, że transkrypcja byłaby zastopowana, rozprężenie powoduje, że nawet jeśli jest głód, to komórka tworzy transkrypty

supE44-nie jest dla nas istotny-bakterie posiada tRNA, który rozpoznaje kodon UAG

TcR-istotne,

ETAPY, KTÓRYCH NIE WYKONUJEMY -tutaj będzie rysunek

1. Trawienie restryktazą BamH1

2. Po transformacji wysiew na płytkę z karbenicyliną, po czym:

a) wybór 5 kolonii i namnożenie ich w pięciu odrębnych probówkach. (izolacja DNA w skali mini)

b) w każdej probówce zlanie z nad osadu bakteryjnego i liza alkaliczna w NaOH

c) preparaty poddajemy analizie elektroforetycznej lub PCR

d) transformacja komórek tym materiałem, który dał pozytywny wynik w punkcie c)

e) wysiew na płytkę (transformacja w skali midi) i zawieszenie koloni w 50ml płynnej pożywki

f) analiza elektroforetyczna lub PCR

g) kolejny wysiew na płytkę, z której tworzymy inokulum, które zanosimy studentom na zajęcia.

EKSPRESJA

1. porozmawiamy o NRs na podstawie publikacji “One big family”

2. różnica między transformantami a rekombinantami

3. jak stwierdzić obecność posiadanie transformantów

4. jak stwierdzić posiadanie rekombinantów

5. jak stwierdzić posiadanie rekombinantów z poprawnie (w poprawnej orientacji) wklonowanym insertem

6. zastanowić sie nad odczynnikimi stosowanymi podczas zajęć

NRs:

Ligandy dla receptorów jądrowych:

-ogółem substancje lipofilowe

-hormony steroidowe

-kwasy tłuszczowe

-hormony tyroidowe

-wit. D3

-proglastyny

receptory sieroce - nie posiadają specyficznego ligandu

3 domeny: NTD (N-terminal domain) DBD (DNA binding domain) i LBD (ligand binding domain)

a) NTD - regulacja transkrypcji; posiada sekwencję AF1 - ważna przy transaktywacji
i oddziaływań białko - białko

-brak stabilnej struktury

b) DBD - znajduje się w środku cząsteczki białka i zawiera dziewięć zachowawczych reszt cysteinowych. Domena ta jest odpowiedzialna za wiązanie się receptora do swoistej sekwencji nukleotydowej. PALEC CYNKOWY: 8 reszt Cys bierze udział w wiązaniu jonów Zn2+: pierwsze 4 wiążą jeden jon, a drugie 4 drugi jon. Jony Zn2+ stabilizują strukturę domeny; jeżeli ich nie ma, to domena nie przyjmuje właściwej dla siebie konformacji.

Rejon wiążący Zn2+ w receptorze steriodowym rozpoczyna się helisą alfa na końcu pierwszej domeny palca cynkowego. Jeśli receptor jest związany z DNA to helisa ta leży w dużym rowku DNA i oddziałuje ze swoistą sekwencją nukleotydową.

ERE - elementy odpowiedzi na estrogeny - receptor estrogenu przyłącza się do DNA jako dimer.

c) LBD - domena położona bliżej końca karboksylowego.

- zbudowana głównie z helis alfa

- ligand wiąże się w hydrofobowej kieszeni, między helisami

-bierze udział w procesie dimeryzacji cząsteczek receptora

Przyłączenie liganda prowadzi do rearanżacji strukturalnych - ostatnia helisa alfa (12),która:

- posiada reszty hydrofobowe po jednej stronie helisy i wystaje na zewnątrz receptora w formie niezwiązanej z ligandem

- przemieszcza się do powierzchniowej bruzdy znajdującej się u boku receptora w formie związanej z ligandem

Koaktywatory: zawierają motyw L-X-X-L-L.

Jak odróżnić transformanty od rekombinantów?

-PCR/ odpowiednie startery, elektroforeza

-insercyjna inaktywacja

-selekcja biało-niebieska

-trawienie enzymami restrykcyjnymi

Transfekcja- proces wprowadzenia obcego DNA lub RNA do komórki.

• chemiczna

  • transfekcja kompleksami DNA z fosforanem wapnia

  • lipofekcja − transfekcja liposomami zawierającymi DNA lub RNA

• elektroporacja − transfekcja za pomocą krótkotrwałego szoku elektrycznego w roztworze zawierającym kwas nukleinowy. Szok elektryczny powoduje przejściowe utworzenie w błonie komórkowej mikroporów, przez które może się dostać DNA lub RNA.

• pocisk genowy − transfekcja balistyczna − wstrzeliwanie do wnętrza komórki mikrokulek złota opłaszczonych DNA

• mikroiniekcja – roztwór DNA jest wstrzykiwany bezpośrednio do jądra komórkowego, lub w przypadku RNA do cytoplazmy, za pomocą specjalnie spreparowanej szklanej kapilary.

Transdukcja- proces wprowadzenia nowego genu do komórki przez wirusa.

Zastosowanie praktyczne do wprowadzania genów do komórek. Do transdukcji komórek bakteryjnych najczęściej używa się wektorów opartych na fagu lambda

A ja przed chwilą zobaczyłam w dżin klouning end dienej analajzys, że transdukcja, to przyjęcie DNA fagowego, w taki sam sposób jak na skutek transformacji.

Transduction is the process by which DNA is transferred from one bacterium to another by a virus.

Transformacja- wprowadzenie do komórki obcego materiału genetycznego (DNA), zwłaszcza niewielkiej jego porcji, obejmującej jeden do kilku genów.

Zmodyfikowana w ten sposób komórka oraz - w przypadku organizmów wielokomórkowych - zregenerowany z niej organizm nosi nazwę transformanta.

Gen wprowadzony na zasadzie transformacji do komórki-biorcy zwany jest ogólnie transgenem. Transformant i jego potomstwo dziedziczące transgeny nazywa się organizmami transgenicznymi albo zgodnie z przyjętym obyczajem, choć nie całkiem zgodnie z logiką, organizmami genetycznie zmodyfikowanymi, czyli GMO.

na wykładzie: “przeniesienie rekombinowanej cząsteczki DNA do kom. bakteryjnej”

SDS-PAGE

1. odczynniki używane podczas preparacji żeli i samej elektroforezy

2. zasady rozdziału podczas SDS-PAGE

Najczęściej stosuje się elektroforezę w tzw. żelu nieciągłym, w którym próbkę nanosi się na żel zagęszczający (o dużych porach) spolimeryzowany na wierzchu żelu rozdzielającego (o małych porach). W tej technice bufor używany jako bufor elektrodowy oraz bufory wchodzące w skład obu żeli różnią się składem i pH. Zaletą tego systemu jest koncentracja białek podczas wędrówki przez żel zagęszczający, co powoduje, że niezależnie od objętości próbki białka wchodzą w żel rozdzielający w postaci wąskiego, zatężonego pasma.

Użycie anionowego detergentu soli sodowej kwasu dodecylosiarkowego (SDS – ang. Sodium Dodecyl Sulfate) pozwala na rozdział elektroforetytczny białek zgodnie z ich masą cząsteczkową. Przed i w trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i denaturacji w obecności SDS, który łączy się z białkami specyficznie w stosunku masowym 1 g białka - 1,4 g SDS. Zapewnia to przejęcie przez białko ujemnego ładunku elektrycznego netto o stałej gęstości bez względu na jego długość. Dla całkowitego rozwinięcia polipeptydu, zapewnienia mu pierwszorzędowej struktury, niezbędne jest dodatkowo zniszczenie mostków dwusiarczkowych (β-merkaptoetanol lub ditiotretiol). Opłaszczenie białka przez SDS oraz redukcja mostków dwusiarczkowych pozwala na separację białek w żelu poliakrylamidowym ze względu na ich wielkość, a zatem pośrednio masę cząsteczkową. Szybkość migracji w SDS-PAGE nie jest determinowana przez ładunek elektryczny białka zależny od pH i jego konformację ale przez masę białka.

W obecności SDS i czynnika redukującego wiązania dwusiarczkowe (β-merkaptoetanolu) białka ulegają denaturacji (rozdzielają się na podjednostki) a ich wiązania niekowalencyjne ulegają rozkładowi. Początkowo rozdział prowadzi się przy małym napięciu (60 V), aby białka jak najlepiej weszły w pory żelu. Następnie zwiększa się napięcie (do 120 V), przyspieszając przepływ białek. Rozdział prowadzi się w buforze glicynowym. Odpowiednie napięcie wraz z użyciem żelu o mniejszym stężeniu akrylamidów w stosunku do żelu dolnego pozwala na zagęszczenie próbek. Efekt taki uzyskujemy dzięki glicynie i jonom chlorkowym zawartym w buforze elektrodowym. Glicyna w pH 6.8 górnego żelu (wyższym od jej punktu izoelektrycznego pI 6.3) przyjmuje ładunek lekko ujemny. W porównaniu z silnym ładunkiem ujemnym jonów chlorkowych i białka (dzięki obecności SDS) jest to ładunek znikomy. Glicyna jako cząsteczka o najmniejszym ładunku wypadkowym ujemnym wędruje więc najwolniej ku anodzie. Przed nią przemieszczają się białka poprzedzone przez jony chlorkowe, charakteryzujące się dużą ruchliwością elektroforetyczną. Takie rozmieszczenie w żelu migrujących cząsteczek powoduje zagęszczenie próbki. Dzięki temu naniesione białka wchodzą równocześnie w żel dolny. Przejście białek z żelu górnego do dolnego rozpoczyna proces ich właściwego rozdziału. Żel dolny, poza stężeniem akrylamidów, a co się z tym wiąże wielkością porów, różni się od żelu górnego również pH, które wynosi 8.8. Takie pH jest znacznie wyższe od pI glicyny, co powoduje, że wypadkowy ładunek aminokwasu staje się bardziej ujemny (wraz ze zmniejszeniem liczby jonów H+ zwiększa się ilość cząsteczek glicyny ze zjonizowanymi grupami karboksylowymi). Zmiana ładunku glicyny jest przyczyną zmiany opisanej wcześniej kolejności migracji. Białka wędrują za jonami chlorkowymi i glicyną, ulegając rozdziałowi pod względem masy cząsteczkowej.

Białka w żelu można wybarwić następującymi metodami:

1. Barwienie w roztworze Coomassie Brilliant Blue R-250.

2. Barwienie srebrem

3. Barwienie roztworem czerni amidowej