Ćwiczenie 1

1. Wzory: sacharydy

β-D-fruktoza

β-D-glukoza

Laktoza β-D-galaktoza

Aminokwasy:

Konfiguracja S/R - Ustalanie konfiguracji absolutnej wokół danego centrum chiralności przeprowadza się zgodnie z następującymi regułami:

1. kolejności pierwszeństwa podstawników przyłączonych do atomu stanowiącego centrum chiralności

2. podstawnik o najniższym pierwszeństwie musi znajdować się jak najdalej od obserwatora

3. jeśli układ pozostałych podstawników jest taki, że patrząc od strony obserwatora należy wodzić okiem od podstawnika o największym pierwszeństwie (A) do trzeciego w kolejności (C) zgodnie z kierunkiem wskazówek zegara to konfiguracja absolutna jest oznaczana literą R (do łac. rectus – prawy) , a gdy odwrotnie literą S (od łac. sinister – lewy).

Konfiguracja L/D - Określanie konfiguracji względnej formy łańcuchowej cukrów dokonuje się przedstawiając cząsteczkę w projekcji Fishera. Cząsteczkę cukru należy ustawić tak aby grupa -CHO (u aldoz) lub ketonowa (u ketoz) znalazła się na górze, a grupa etylowa -CH2OH na dole. Jeżeli -OH na przedostatnim atomie węgla w łańcuchu znajduje się po prawej stronie to dany cukier ma konfigurację D, jeśli grupa ta jest po lewej stronie to jest to cukier L. Cukry w przyrodzie to najczęściej D-cukry

2. Reakcje charakterystyczne

3. Pojęcia:

- punkt izoelektryczny- jest to pH środowiska (odczyn), w którym cząsteczka aminokwasu staje się obojętna i traci zdolność poruszania się w polu elektrycznym (podczas elektroforezy). Inaczej mówiąc jest to takie pH, przy którym aminokwas nie jest obdarzony ładunkiem elektrycznym. W punkcie izoelektrycznym aminokwas jest w jednakowy sposób zdysocjowany jako kwas i jako zasada. Stężenie jonu obojnaczego przyjmuje wtedy maksymalną wartość, a stężenia form anionowej i kationowej mają jednakowe, minimalne stężenie. W roztworze o pH = pI białka posiadają najmniejszą rozpuszczalność i wytrącają się z roztworu.

- koagulacja białek- łączenie się rozproszonych cząstek koloidu w nieregularne agregaty które w odpowiednich warunkach można uzyskać w postaci osadu – koagulatu. Koagulacja może być procesem odwracalnym albo nieodwracalnym.

- wysalanie białek- proces wytrącenia z roztworu białek rozpuszczalnych w wodzie przez wysokie stężenie soli. Stosuje się w tym celu sole, których jony łatwo tworzą wodziany. Zjawisku wysalania sprzyjają te aniony, które tworzą wiązania wodorowe lub mają dużą elektroujemność. Sole wiążące wodę pozbawiają białka płaszcza wodnego, sprzyjając ich asocjacji w większe agregaty o zmniejszonej rozpuszczalności, które wypadają z roztworu. Najłatwiej wysolić białko w jego punkcie izoelektrycznym, ponieważ cząsteczki na zewnątrz obojętne łatwo asocjują w większe agregaty wypadające z roztworu. Do wysalania najczęściej stosuje się (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4. Wysalanie białek jest procesem odwracalnym

- denaturacja białek- polega na zniszczeniu (w różnym stopniu) struktury drugo-, trzecio- lub czwartorzędowej białka, czyli obejmuje zmiany konformacji łańcucha polipeptydowego, czego konsekwencją jest utrata specyficznych biologicznych aktywności białek. Przy denaturacji dochodzi do zdeformowania ukształtowania cząsteczki, swoistego dla każdego białka, bez hydrolitycznej degradacji łańcucha polipeptydowego. Czynniki denaturujące działają na wiązania, które stabilizują przestrzenną strukturę białek

- sacharyd redukujący- za właściwości redukujące odpowiedzialna jest ‘wolna’ grupa karbonylowa; ze względu na tautomeryzację zarówno aldozy jak i ketozy mogą być utleniane; aby disacharyd posiadał właściwości redukujące przynajmniej jedna z grup hydroksylowych obecnych przy anomerycznym atomie węgla nie może być zaangażowana w tworzenie wiązania glikozydowego, jest to warunek konieczny aby możliwe było otwarcie pierścienia cukru z odtworzeniem grupy karbonylowej; zaliczamy tu cukry: glukoza, fruktoza, maltoza, laktoza, celobioza

- sacharyd nieredukujący- składniki łączą się poprzez wiązania acetalowe pomiędzy ich centrami anomerowymi oraz żaden z monosacharydów nie posiada wolnej jednostki hemiacetalowej. do disacharydów nieredukujących należą sacharoza; także polisacharydy nie wykazują właściwości redukujących

4. Czynniki powodujące koagulację i denaturację białek

5. Struktura I-, II-, III-rzędowa białek

6. Metody oznaczania C-końcowego aminokwasu w wyniku hydrazynolizy oraz N-końcowego aminokwasu metodami: Edmana, dinitrofenylowania i dansylowania

7. Ilościowe oznaczanie zawartości aminokwasów (i składu aminokwasowego białek) metodą ninhydrynową i białek metoda biuretową; wykorzystanie metod HPLC

Ćwiczenie 3

1. Podział enzymów i ‘ogólne’ typy reakcji jakie katalizują.

Klasa główna Typ katalizowanej reakcji

EC 1. Oksyreduktazy utlenienie i redukcja między dwoma substratami (przenoszenie eketronów i protonów lub bezpośrednie włączanie tlenu do substratu

EC 2. Transferazy przenoszenie grup funkcyjnych (innych niż wodór) między dwoma substratami

EC 3. Hydrolazy hydroliza

EC 4. Liazy niehydrolityczne rozrywanie wiązań pojedynczych

EC 5. Izomerazy przekształcenia w obrębie tej samej cząsteczki (wewnątrzcząsteczkowe, racemizacja, izomeryzacja, utlenianie i redukcja, przenoszenie grup itp.)

EC 6. Ligazy (syntetazy) łączenie dwóch związków sprzężone z rozerwaniem wiązania pirofosforanowego w ATP lub innych nukleotydach wysokoenergetycznych

1. Reakcje katalizowane przez enzymy: ureazy, oksydazy, peroksydazy, katalazy, inwertazy, amylazy, pepsynę, trypsynę, chymotrypsynę, lipazy

• Ureaza - katalizuje reakcję hydrolitycznego rozkładu mocznika na amoniak i dwutlenek węgla:

• Oksydazy - katalizują przenoszenie wodoru na tlen w wyniku czego powstaje woda lub nadtlenek wodoru.

Np.

• Peroksydaza - katalizuje utlenianie nadtlenkiem wodoru różnych substratów

Np.

• Katalaza - katalizuje proces rozkładu nadtlenku wodoru do wody i tlenu

Np.

• Inwertaza - katalizuje hydrolizę wiązania fruktofuranozydowego (+)-sacharozy z wytworzeniem (+)-glukozy i (−)-fruktozy.

• Amylaza - katalizuje hydrolize poliglikanów takich jak : glikogen, amylopektyna, do cukrów prostych (maltoza, glukoza)

Np. hydroliza skrobi

• Pepsyna – katalizuje hydrolize wiązania peptydowego białka do krótszych polipeptydów i oligopeptydów

• Trypsyna - katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w miejscach w których grupy karbonylowe należą do argininy albo lizyny

• Chymotrypsyna

• Lipaza - katalizuje hydrolizę nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli (TAG)

1. Próby jakościowe wykrywające aktywność: ureazy, oksydaz, peroksydaz, katalazy, inwertazy, pepsyny. - INSTRUKCJA

2. Czynniki wpływające na aktywność enzymatyczną (inhibitory, temperatura, pH).

• Inhibitory :

- nieodwracalne – wiążą się kowalencyjnie z enzymem (nie zawsze w obrębie centrum aktywnego), powodując trwałą utratę aktywności katalitycznej. Przykłady: DIFP, amid kwasu jodooctowego

- odwracalne – stanowią zróżnicowaną grupę cząsteczek zarówno względem budowy jak i kinetyki oddziaływania z enzymem. Ich wspólną cechą jest możliwość dysocjacji kompleksu enzym-ihibitor. Można je podzielić na kilka podgrup, między innymi: inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne.

• Temperatura

Szybkość reakcji enzymatycznych wzrasta wraz ze wzrostem temperatury. Wiąże się to ze wzrostem energii kinetycznej cząstek i większą częstotliwością ich zderzeń. Wzrost aktywności enzymatycznej w zależności od temperatury opisuje współczynnik temperaturowy Q₁₀, określający jak zmienia się szybkość reakcji przy wzroście temperatury o 10 °C:

Wpływ temperatury na aktywność enzymów nie jest prostą zależnością. Aktywność rośnie wraz ze wzrostem temperatury, jednakże tylko w takim zakresie temperatury, w którym enzym pozostaje stabilny. Po przekroczeniu temperatury krytycznej, następuje denaturacja termiczna enzymów, w wyniku czego aktywność gwałtownie spada. Przeciętnie szybkość reakcji enzymatycznych wzrasta dwukrotnie przy wzroście o każde 10 °C w zakresie temperatur niedenaturujących struktury enzymu (Q₁₀=2). Zatem także parametr Q₁₀ ma zastosowanie tylko w niedenaturującym zakresie temperatur i jest on charakterystyczny dla danego enzymu, i zależny od energii aktywacji katalizowanej reakcji. W temperaturze optymalnej aktywność enzymu jest największa. Obserwowana temperatura optymalna jest wypadkową dwóch procesów:

*wzrostu szybkości reakcji związanego ze wzrostem energii kinetycznej,

*wzrostu szybkości denaturacji termicznej enzymu powyżej krytycznej temperatury. Gdy drugi składnik zaczyna przeważać, następuje spadek aktywności. Większość enzymów ma optimum temperaturowe w zakresie 30-45 °C i nieodwracalnie denaturuje oraz traci aktywność w temperaturach wyższych niż 60 °C. Jednak w przypadku organizmów termofilnych (np. bakterii ze źródeł termalnych) ich enzymy zachowują aktywność i osiągają maksymalną szybkość w podwyższonych temperaturach.

Większość enzymów ulega powolnej denaturacji nawet w temperaturach optymalnych i niższych niż krytyczna. Zależy to od natury samego enzymu, stopnia jego oczyszczenia (w preparatach), a także od pH, siły jonowej i pozostałych parametrów. Najwyższa temperatura, w której jeszcze nie zachodzi termiczna dezaktywacja enzymu w danych warunkach określa tak zwaną termostabilność enzymu.

- pH

Większość enzymów wykazuje maksymalną aktywność w środowisku o określonym pH. Optimum pH, obok optimum temperaturowego, to drugi pod względem znaczenia parametr środowiska charakteryzujący aktywność enzymów. Wpływ pH na aktywność enzymów wiąże się z faktem, że enzymy jako białka posiadają wiele aminokwasów ulegających jonizacji, a aminokwasy centrum aktywnego często mogą pełnić swoją rolę tylko w określonym stanie jonizacji. Ponadto na aktywność enzymów, wpływ ma także jonizacja samych substratów oraz kompleksów ES.

Również oddziaływania enzym-substrat mogą mieć charakter jonowy, zależny od jonizacji. Przykładem takiego zjawiska jest proces hydrolizy przeprowadzany przez pepsynę. Punkt izoelektryczny (pI) tego enzymu wynosi 1, natomiast optimum jego działania to około 2,0-2,5. W tym odczynie cząsteczka pepsyny, bogata w aminokwasy dikarboksylowe, jest jeszcze ujemnie naładowanym anionem, podczas gdy większość białek ma już przy tym pH ładunek dodatni. Od stopnia jonizacji pewnych grup zależy także ogólna konformacja cząsteczki enzymu, zapewniająca mu pełną aktywność, a w za kwaśnym czy zbyt zasadowym środowisku enzym ulegnie denaturacji.

Wykres zależności aktywności enzymu od pH ma najczęściej kształt dzwonowaty, czyli enzym ma największą aktywność w swoim optymalnym pH i aktywność ta spada wraz z oddalaniem się od tego punktu (np. trypsyna). Niektóre jednak enzymy mają właściwie stała aktywność w szerokim zakresie pH (np. papaina) lub są wrażliwe tylko na niskie pH, zachowując aktywność w wysokim (jak esteraza cholinowa) lub na odwrót. Zależność aktywności od pH bada się w stałej temperaturze przy maksymalnym wysyceniu enzymu substratem oraz w buforach o odpowiednio dobranej pojemności, tak aby powstające produkty reakcji nie zmieniały ich pH. Należy również zwrócić uwagę, aby rodzaj stosowanego buforu nie wywierał wpływu na aktywność enzymu.

Ćwiczenie 4

1. Profil energetyczny dla reakcji katalizowanej enzymatycznie i nie katalizowanej przez enzym.

1. Wyprowadzenie równania Michaelisa-Menten i Lineweavera-Burka dla reakcji enzymatycznejS

Szybkość poszczególnych fragmentów przemiany przedstawiamy:

v₁ = k₊₁[E][S] v₂ = k₋₁[ES] v₃ = k₊₂[ES] v₄ = k₋₂[E][P]

 Kompleks [ES] tworzy się z szybkością V₁+V₄, a rozkłada z szybkością V₂+V₃

W stanie równowagi V₁+V₄ = V₂+V₃. Stąd:

k₊₁[E][S] +  k₋₂[E][P] =  k₋₁[ES]   +  k₊₂[ES]

[E](k₊₁[S]+ k₋₂[P]) = [ES](k₋₁   +  k₊₂)  

$$\frac{\lbrack ES\rbrack}{\lbrack E\rbrack} = \frac{k_{+ 1}\left\lbrack S \right\rbrack + \ k_{- 2}\left\lbrack P \right\rbrack}{k_{- 1}\ \ + \ k_{+ 2}} = \frac{k_{+ 1}\left\lbrack S \right\rbrack}{k_{- 1}\ \ + \ k_{+ 2}} + \frac{\ k_{- 2}\left\lbrack P \right\rbrack}{k_{- 1}\ \ + \ k_{+ 2}}$$

Na początku reakcji stężenie produktu [P] jest tak małe że jego wpływ na równowagę można pominąć

$$\frac{\lbrack ES\rbrack}{\lbrack E\rbrack} = \frac{k_{+ 1}\left\lbrack S \right\rbrack}{k_{- 1}\ \ + \ k_{+ 2}}$$

$$\frac{\lbrack ES\rbrack}{\left\lbrack E \right\rbrack\lbrack S\rbrack} = \frac{k_{+ 1}}{k_{- 1}\ \ + \ k_{+ 2}}$$

$K_{m} = \frac{k_{- 1}\ \ + \ k_{+ 2}}{k_{+ 1}} = \frac{\left\lbrack E \right\rbrack\lbrack S\rbrack}{\lbrack ES\rbrack}$ stała Michaelisa

W powyższym wzorze stężenie enzymu jest stężeniem enzymu wolnego, nie związanego w kompleksie, można więc napisać:

$$K_{m} = \frac{(\left\lbrack E \right\rbrack - \left\lbrack \text{ES} \right\rbrack)\lbrack S\rbrack}{\lbrack ES\rbrack}$$

K_m[ES] = [E][S] − [ES][S]

K_m[ES] + [ES][S] = [E][S]

[ES](K_m+[S]) = [E][S]

$$\left\lbrack \text{ES} \right\rbrack = \frac{\left\lbrack E \right\rbrack\lbrack S\rbrack}{K_{m} + \lbrack S\rbrack}$$

Dzielimy prawą stronę przez [S]

$$\left\lbrack \text{ES} \right\rbrack = \frac{\frac{\left\lbrack E \right\rbrack\lbrack S\rbrack}{\lbrack S\rbrack}}{\frac{K_{m}}{\lbrack S\rbrack} + \frac{\lbrack S\rbrack}{\lbrack S\rbrack}} = \frac{\lbrack E\rbrack}{\frac{K_{m}}{\lbrack S\rbrack} + 1}$$

Syzbkość początkowa reakcji enzymatycznej V₀ zależy głównie od stężenia kompleksu ES i szybkość tworzenia się z niego końcowego produktu w myśl równania:

v₀ = v₃ = k₊₂[ES]

Podstawiamy wartość [ES]

$v_{0} = \frac{k_{+ 2}\left\lbrack \text{ES} \right\rbrack}{\left( \frac{K_{m}}{\left\lbrack S \right\rbrack} \right) + 1}$

Ułamek K_m/[S] dąży do 0 bo [S]>> K_m

v₀ = k₊₂[ES] =  V_max (15)

Jeżeli stężenie substratu jest tak duże, że następuje zupełne wysycenie enzymu substratem, to szybkosć reakcji enzymatycznej jest maksymalna. W takim stanie po zwiekszeniu stęzenia substratu szybkość się nie zmieni, natomiast zależy od stężenia enzymu

Wprowadzając w rówaniu (14) symbol V_max z (15) otrzymujemy

$$v_{0} = \frac{V_{\max}}{\left( \frac{K_{m}}{\left\lbrack S \right\rbrack} \right) + 1}$$

Równanie Michaelisa-Menten

W postaci liniowej

(V_max − v₀)(K_m + [S]) = V_max  •  K_m

Równanie Lineweavera – Burka

Jest to przekształcenie wzoru Michaelisa-Menten

$$\frac{1}{v_{0}} = \frac{1 + (\frac{K_{m}}{\left\lbrack S \right\rbrack})}{V_{\max}}$$

$$\frac{1}{v_{0}} = \left( 1 + \frac{K_{m}}{\left\lbrack S \right\rbrack} \right)\frac{1}{V_{\max}}$$

$$\frac{1}{v_{0}} = \frac{K_{m}}{V_{\max}} \bullet \frac{1}{\left\lbrack S \right\rbrack} + \frac{1}{V_{\max}}$$

1. Pojęcie: stała Michaelisa

Km- stała równowagi rozważanego układu, którego szybkość reakcji zależy od stężenia kompleksu [ES] i szybkości jego rozkładu

$$K_{m} = \frac{k_{- 1} + k_{+ 2}}{k_{+ 1}} = \frac{\left\lbrack E \right\rbrack\lbrack S\rbrack}{\lbrack ES\rbrack}$$

1. Wyznaczanie stałej Michaelisa z wykorzystaniem krzywej Michaelisa-Menten oraz wykresu Lineweavera-Burka

Zależność pomiędzy szybkością reakcji enzymatycznej i stężeniem molowym substratu określa równanie Michaelisa-Menten:

Wykreślona na podstawie tego równania zależność szybkości reakcji od stężenia substra-tu przyjmuje postać hiperboli (Rys. 1)

Takie stężenie substratu (w mol/dm³), przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej nosi nazwę stałej Michaelisa – K_m. Stała ta mówi o powinowactwie enzymu do substratu. Zazwyczaj K_m równa jest stałej dysocjacji kompleksu ES na E i S, tzn. im jest ona niższa, tym łatwiej kompleks ES powstaje, a trudniej rozpada się, gdyż jest silniejsze wiązanie enzymu z substratem. Wartości K_m dla większości enzymów wahają się w granicach od 10^-5 do 10^-3 mol/dm³.

Jednak z wykresu hiperboli trudno jest oszacować, czy osiągnięta została rzeczywiście V_max reakcji. A co za tym idzie, nie ma wtedy pewności, że wyznaczona wartość K_m jest dokładna. Z tego powodu, do wyznaczania wartości Km wykorzystywana jest zależność 1/v od 1/s, czyli równanie Lineweavera-Burka, które jest przekształceniem równania Michaelisa-Menten:

1. Wykresy dla reakcji enzymatycznej: stężenie subs. (lub prod.)= f(t), V _max=f(stę.sub.)