Podstawy transgenezy zwierząt (wykład IV część 2)

• BAC

  • Bacterial artificial chromosome

  • Cechy charakterystyczne

    • Oparte na plazmidzie F E. coli

    • Mogą zawierać częściowo strawione genomiczne DNA

      • Do 300 kbp DNA

    • Ich inżynieria wymaga homologicznej rekombinacji w komórkach bakteryjnych

      • Dostarczany jest plazmid kodujący enzymy rekombinacyjne

    • Zwykle używane jako wektor do niehomologicznej rekombinacji

      • Nie jest niezależnym chromosomem

        • Brak telomerów i centromerów

      • Służy jako duży plazmid

• YAC

  • Yeast artificial chromosome

  • Funkcjonalny chromosom, zawiera

    • Telomery, centromer i miejsce startu replikacji (ORI)

    • Miejsca restrykcyjne

    • Markery selekcyjne na każdym ramieniu

    • Może nieść od 200 kbp do 1,5 mbp

    • Mogą być manipulowane głównie poprzez rekombinację homologiczną

  • Między rozdzielone ramiona chromosomu można wkleić fragment DNA genomicznego

  • Nie są powszechnie używane ze względu na problem z chimeryzacją (do 50% YACs)

    • Koligacja kilku fragmentów genomicznych

    • Rekombinacja między YAC-ami

    • Rearanżacja chromosomalna

    • W BAC-ach zjawisko zachodzi rzadko

• MAC i HAC

  • MAC-i uzyskiwane są poprzez traktowanie komórek np. promieniowaniem

    • Najpierw uzyskanie komórek z dicentrycznym chromosomem, następnie połamanie na minichromosom i pozostałą część która zostanie chromosomem

      • Sztuczny chromosom zawiera głównie satelitarne DNA i heterochromatynę

      • Poza wprowadzonym transgenem nie zawiera informacji genetycznej

    • Obecnie popularną metodą jest użycie inżynierii chromosomalnej z użyciem systemu loxP

    • Mogą nieść relatywnie duże geny lub nawet zestaw genów

    • Ulega niezależnej segregacji i przeniesieniu do linii płciowej

• Problem z wektorami ze sztucznych chromosomów

  • Mogą być manipulowane głównie przez rekombinację homologiczną, która jest mało wydajna w liniach komórek ludzkich i mysich

    • Modyfikacja MAC-ów w komórkach kurzego chłoniaka lub linii CHO (intensywne procesy rekombinacyjne)

      • Rozbijanie komórki i izolacja chromosomów na sorterze przepływowym

        • Najczęściej mitotyczne

      • Wprowadzenie do komórek ES za pomocą mikroiniekcji lub wprowadzenie do komórek ES za pomocą mikrofuzji komórkowej

        • Microcell mediated chromosome transfer – MMCT – rozbicie komórki na mniejsze elementy włącznie z jądrem komórkowym (uszkodzenie cytoszkieletu) i pozbawiamy komórkę otoczki jądrowej (chemicznie) – do takiej mikrokomórki wpływa chromosom, następuje fuzja mikrokomórek z komórką ES

          • Fuzyjną strukturę można wprowadzić do embrionu

          • Średnia wydajność – fuzyjna komórka może nie tworzyć chimery

  • Stabilność mitotyczna w komórkach linii płciowej jest ograniczona i silnie zależna od struktury centromeru

    • Utrata centromeru – utrata chromosomu

      • Wysoka stabilność 0,1% utraty na podział/ zwykle 3,2% utraty na podział

        • Żeby wyprodukować spermę zachodzą 63 podziały, a oocyty – 25

        • Bardzo mała stabilność w komórkach linii płciowej – jeśli już zajdzie modyfikacja to najczęściej jest u samicy niż u samca

• Zalety sztucznych chromosomów

  • Transgeneza jest niezależna od efektu pozycji

    • Ekspresja jest zależna tylko od liczby kopii i jest optymalna niezależnie od lokacji w genomie gospodarza

    • Przykład: wprowadzenie tyrozynazy do myszy albinotycznych (eliminacja albinizmu)

      • Konstrukt YAC obejmuje cały locus tyrozynazy myszy

      • W efekcie następuje odtworzenie fenotypu wild type

• Główne typy modyfikacji

  • Wymiana genu

    • Najczęściej inaktywacja genu poprzez wymianę z markerem selekcyjnym

      • Generacja niefunkcjonalnego allelu

    • Modyfikacja sekwencji genu przez wymianę

      • Zwykle wprowadzany również marker selekcyjny

      • Obecność markera może zmienić ekspresję genów w locus

        • Tworzy się allel hypomorficzny

    • Podwójna wymiana (double replacement/”tag-and-exchange”)

      • Wprowadzanie markerów do pozytywnej i negatywnej selekcji do locus docelowego za pomocą homologicznej rekombinacji

      • Następnie wymiana markerów na fragment zawierający nieselektywną mutację za pomocą drugiego wektora docelowego

        • Uzyskujemy małe, nieselekcjowalne mutacje

        • Możliwe są wielokrotne wymiany albo różne typy wymian

  • Insercja genu

    • Inaktywacja genu przez wprowadzenie markera selekcyjnego do genu

      • Generacja niefunkcjonalnego allelu

    • Wprowadzenie nowego genu i ekspresja

    • Nadekspresja dodatkowej kopii genu

    • Obecność markera może zmienić ekspresję genów w locus

      • Tworzy się allel hipomorficzny

    • Niehomologiczna

      • Wadą jest występowanie mutagenezy insercyjnej jak w przypadku retrowirusów

    • Homologiczna

      • W wektorze naokoło transgenu i kasety selekcyjnej występują sekwencje homologiczne umożliwiające homologiczną rekombinację

        • Jeśli jedno miejsce homologicznej rekombinacji – następuje insercja zamiast wymiany

          • Rozbicie struktury genu

  • Systemy rekombinaz

    • Wprowadzenie zmian w genomie z użyciem systemu rekombinaza-miejsce specyficzne

  • RNAi (interferencyjne RNA)

    • Odmiana metod insercji genu

    • Wprowadzony gen produkuje RNA interferujące (siRNA, shRNA, shRNA-mir)

• Insercja homologiczna genu „hit-and-run”

  • Hit - Integracja wektora za pomocą homologicznej rekombinacji i w konsekwencji duplikacja sekwencji genomicznej

    • Selekcja pozytywna

  • Run - Duplikacja rozwiązana przez rekombinację intrachromosomalną

    • Wypętlenie i usunięcie jednej z kopii (nie wiadomo której – może tej z mutacją)

    • Uzyskiwane są małe nieselekcjonowalne mutacje

    • Selekcja negatywna

  • NeoR może mieć w sekwencji „cryptic splice sites”

• Gene trap – pułapka promotorowa

  • Przypadkowa integracja konstruktu zawierającego gen reporterowy (entrapment vector) do genomu

    • Wprowadza gen reporterowy i selekcyjny pod kontrolę transkrypcyjną endogennego genu

    • Gen reporterowy nie posiada promotora oraz ma „splice-acceptor site” (sekwencja kończąca intron) i sekwencję poliA

    • Insercja do sekwencji intronowej pozwala na uzyskanie transkryptu fuzyjnego, którego ekspresja jest pod kontrolą promotora genu endogennego

      • Białko-ramka odczytu

    • Generuje mutację insercyjną

  • Screening

    • Pułapkowane promotory wykrywa się w komórkach ES badając ich zdolności przeżycia po różnicowaniu

      • Promotory mogą być tkankowo-specyficzne

  • Zastosowanie

    • Wykrywanie wzorów ekspresji genów

• Systemy specyficznych rekombinaz/integraz

  • Systemy używane do

    • Usunięcia markera selekcyjnego

    • Rozwiązanie problemu jeśli knock-out gene of interest jest śmiertelny na etapie embrionu

    • Badanie knock-out gene of interest u dorosłych myszy

      • Biorąc pod uwagę mechanizmy kompensatorowe

    • Badanie tkankowo-specyficznego lub czasowo regulowany knock-out gene of interest

  • Rodzina specyficznych rekombinaz

    • Używane są także modyfikacje rekombinaz Cre i Flp, ale także inne o podobnym mechanizmie działania

    • Rekombinaza Cre

      • Rekombinaza bakteriofaga P1 E. coli

      • Rozpoznawana sekwencja to miejsce loxP (34 bp)

        • Sekwencja palindromiczna z niepalindromicznym środkiem

    • Rekombinaza Flp

      • Rekombinaza Saccharomyces cerevisiae

      • Rozpoznawana sekwencja to miejsce frt (48 bp)

        • Sekwencja palindromiczna z niepalindromicznym środkiem

      • Mniej wydajna od Cre

  • Rekombinazy działają dwukierunkowo

    • Możliwe modyfikacje intra- i interchromosomalne

• Specyficzna integraza

  • Integraza bakteriofaga φC31

    • Sekwencje docelowe to attB i attP

    • W wyniku integracji powstają miejsca hybrydowe attL i attR, które nie są już rozpoznawane przez integrazę

    • Rekombinacja z wykorzystaniem regionów loxP jest odwracalna – z wykorzystaniem attB i attP jest nieodwracalna

• Wycięcie genu

  • Strategia 2-loxP

    • Stosowana do uzyskiwania konstytutywnego knock-outu

    • Homologiczna rekombinacja transgenu wraz z sekwencją markerową, ograniczonego sekwncjami loxP

    • Po rekombinacji transgen z kasetą markerową ulega wycięciu przez rekombinazę Cre

  • Strategia 3-loxP

    • Homologiczna rekombinacja transgenu wraz z sekwencją markerową

      • Konstrukt zawiera 3 sekwencje loxP – na początku markera, na końcu markera i końcu transgenu

    • Częściowe wycięcie rekombinazą Cre powoduje powstanie allelu floksowanego (floxed allele – wycięty marker – kondycjonalny allel) lub pozostanie jedynie markera

      • Wycięcie jest randomowe

    • Całościowa modyfikacja rekombinazą Cre powoduje delecję transgenu wraz z markerem

    • Zarodkowa komórka pnia z takim typem modyfikacji służy do uzyskania zwierzęcia z kondycjonalnym knock-outem danego genu

      • Do uzyskania knock-outu in vivo konieczne jest wprowadzenie rekombinazy Cre

  • Strategia 2-loxP/2-frt

    • Wprowadzony za pomocą homologicznej rekombinacji transgen otoczony rejonami loxP wraz z markerem otoczonym rejonami frt

      • Pozwala na specyficzne usunięcie markera lub całego konstruktu z genomu

    • Rekombinaza Flp ma mniejszą wydajność niż Cre

      • Flp wycina tylko marker (wewnątrz)

• Ablacja genetyczna

  • Strategia 2-loxP

    • Konstruowanie deficytów komórkowych

    • Wprowadzony gen toksyny

    • Uzyskuje się ablację linii komórkowej w której aktywny jest promotor pod którego kontrolę wstawiono gen kodujący toksynę

• Integracja genu z udziałem rekombinaz

  • Możliwość wprowadzenia nowych genów albo serii zmutowanych genów w określony locus

  • Metoda zastępcza w stosunku do „double replacement”

  • Wymaga najpierw wprowadzenia miejsca rekombinacji za pomocą insercji lub wymiany

  • Rekombinazy wykazują preferencję do wycinania fragmentu a nie integracji

    • Wymagany marker selekcyjny

      • Rozbite kasety selekcyjne – fragment wraz z transgenem na konstrukcie

      • Możliwe stosowanie różnych mutantów loxP

        • Po homologicznej rekombinacji tworzy się fragment nie rozpoznawany przez rekombinazę

• Inżynieria chromosomalna

  • Duże rearanżacje chromosomalne w komórkach ES i myszach

    • Duże delecje, duplikacje, inwersje i translokacje

  • Modyfikacje konieczne do użycia metody

    • Dwukrotne wprowadzenie miejsca loxP lub frt do genomu – osobne, następujące po sobie manipulacje

    • Przejściowa ekspresja rekombinazy

    • Selekcja rzadkich przypadków rekombinacji za pomocą rozbitych kaset markerów selekcyjnych

  • Uzyskanie sztucznych chromosomów poprzez sterowaną rekombinację chromosomów za pomocą miejsc loxP

    • Między sekwencjami na sąsiednich chromosomach zajdzie wymiana fragmentów chromosomów przez rekombinację

• Wpływ markera selekcyjnego na ekspresję genów

  • Bakteryjny gen neo zawiera „criptic splice sites” interferujące ze składaniem genu u eukariontów

    • Tworzy się allel hypomorficzny

  • Toksyczność markera selekcyjnego w embriogenezie

    • Toksyczny wpływ produktu z nici antysensownej kasety PGK-Neo

      • Obecność kasety może wpływać na regulację transkrypcji genów leżących w pobliżu, a także w sporej odległości przez mechanizm konkurencji zależnej od pozycji

• Transgeneza z użyciem locus docelowego

  • Zwierzęta użyte do wprowadzenia transgenu już mają modyfikację w okreslonym locus

  • Myszy ROSA26

    • Promotor jest pułapkowany przez sekwencję STOP otoczoną miejscami loxP

    • Jeśli zajdzie wymiana genu na transgen, zachodzi ekspresja markera obecnego za sekwencją loxP

      • Β-gal lub lacZ

  • Typ modyfikacji popularny w procesie RMCE

    • Modyfikacja metody podwójnej wymiany

      • Wstawione najpierw miejsca rekombinacji a potem przez rekombinację sekwencja jest wymieniana przez transgen

      • Wprowadzany transgen nie zawiera dodatkowych sekwencji, występuje w pojedynczej kopii i nie wymaga pozostawienia markera

  • Dostarczanie rekombinazy Cre do komórek

    • Plazmid z którego zachodzi ekspresja rekombinazy

      • Przejściowa ekspresja w komórkach ES i oocytach

    • RNA rekombinazy

      • Przejściowa ekspresja w oocytach

      • RNA transkrybowany in vitro a następnie wstrzyknięty do cytoplazmy np. zapłodnionej komórki jajowej

    • Wprowadzenie białka rekombinazy

      • Kontrola czasowa aktywności Cre

      • W przypadku iniekcji do organizmu dorosłego jest problem ze specyficznością tkankową

    • Adenowirus niosący gen rekombinazy

      • Infekcja komórek ES, przedimplantacyjnych embrionów lub myszy

    • Myszy transgeniczne niosące gen rekombinazy

      • Stabilna ekspresja rekombinazy w komórkach organizmu

      • Wycinanie z „floxed” (sekwencje loxP) lub „flrted” (sekwencje flr) allelu

      • Sekwencja intronowa i sygnał poliadenylacji są dołączone dla właściwej obróbki i transportu mRNA rekombinazy

  • Szczepy myszy wyrażające rekombinazę Cre

    • Deleters – Cre wyrażana w komórkach linii płciowej

    • Szczepy z przestrzenną regulacją Cre (spatial regulation)

    • Szczepy z czasową regulacją Cre (temporal regulation)

    • Szczepy z przestrzenno-czasową regulacją Cre

• RNAi (RNA interference)

  • Post-transkrypcyjny mechanizm regulacji ekspresji genów wykorzystujący dsRNA do wyciszenia ekspresji komplementarnego mRNA

  • Proces zachodzi naturalnie w komórkach zwierzęcych i roślinnych

  • miRNA – produkowane endogennie RNA

    • Uczestniczą w regulacji ekspresji genów endogennych na poziomie mRNA

    • Wysoki poziom konserwacji

    • Niektóre miRNA występują w dużej ilości

  • Mechanizm post-transkrypcyjnego uciszania genów przez komplementarne RNA

    • Wysoka komplementarność

      • Następuje cięcie między resztami 10 i 11 od końca 5’ siRNA

    • Niska komplementarność

      • Represja translacji

  • Popularne typy RNA do interferencji w transgenezie

    • Służą analizie funkcji genów

    • dsRNA (double strand)

    • siRNA (short interfering)

    • shRNA (short hairpin)

    • shRNA-mir (modelowane na endogennych miRNA)

    • inne

  • Metody uzyskiwania RNAi u zwierząt transgenicznych