Koniugacja jest procesem, w którym bakteria-dawca przekazuje materiał genetyczny (plazmidy, chromosom) do komórki-biorcy.

Koniugują bakterie posiadające plazmid F (fertility), który odpowiada za syntezę pili płciowych. Pili stanowi połączenie między koniugującymi komórkami

Plazmid F

Region tra (transfer)- zawiera kompleks genów odpowiedzialnych za syntezę pili płciowych i koniugacyjny transfer DNA plazmidowego. Jeśli plazmid wintegruje do chromosomu tworząc komórki typu Hfr może także być przenoszony chromosomalny DNA do biorcy

F’ może:

Przekazać się sam do biorcy

przekazywać gen np. Lac+ i wbudować się do chromosomu

Wymienić gen w homologicznym miejscu np. lac- na lac+

Transdukcja ogólna i specyficzna

W transdukcji fag jest wektorem przenoszącym obce geny do komórki

Bakteriofagi transdukujące wprowadzają DNA do biorcy gdzie następuje włączenie tego DNA do chromosomu przez rekombinację.

Transdukcja może być: ogólna lub specyficzna

Transdukcja ogólna

zachodzi na skutek pomyłki enzymu odcinającego genomy fagowe z ogólnej puli DNA fagowego. Chromosomalny DNA jest pakowany do główek fagowych. Te fagi, które otrzymają DNA bakteryjne (przez rzadki przypadek) są fagami transdukującymi, czyli przenoszącymi DNA chromosomalne.

Gen trp+ jest przekazywany do bakterii Trp-.Po rekombinacji gen trp jest włączany do chromosomu.

Transdukcja ogólna

Przeniesienie dowolnego fragmentu DNA dawcy do biorcy za pośrednictwem faga

Fag wstrzykuje DNA

Enzymy fagowe degradują DNA chromosomalne

Tworzą się nowe fagi, ale pomyłkowo niektóre fagi zawierają bakteryjne DNA zamiast fagowego – to są fagi transdukujące

Transdukujący fag zakaża biorcę i wstrzykuje mu DNA, które pobrał od dawcy

Dawca włącza pobrane DNA do swojego chromosomu

Fagi transdukujące to fagi łagodne np. P1, P22

Transdukcję specyficzną przeprowadza fag λ,

ponieważ integruje do chromosomu zawsze w jednym miejscu tzn. między genami gal i bio na chromosomie. Kiedy fag ulega wycięciu z chromosomu porywa ze sobą geny leżące obok tzn. bio lub gal i wtedy może je transdukować do innych bakterii.

Integracja faga λ do chromosomu E. coli

Transformacja-przeniesienie genów z dawcy do biorcy za pomocą czystego DNA

Transformacja Niektóre bakterie ulegają naturalnej transformacji (trwała kompetencja) np: Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis 

Etapy transformacji u bakterii G-dodatnich:

związanie DNA na zewnątrz komórki przez kompleks białkowy w skład którego wchodzą: labilny czynnik kompetencji, specyficzna endonukleaza, białka wiążące się z DNA, autolizyny zwiększają przepuszczalność błon.

fragmentacja DNA przez specyficzne endonukleazy transport jednego pasma DNA do cytoplazmy przy pomocy białek wiążących się z DNA i degradacja drugiego pasma przez egzonukleazy rekombinacja ssDNA w homologicznym miejscu w biorcy.

Gram-ujemnych bakterii  

DNA jest pobierane przez struktury membranowe nazywane transformasomami, które wystają na zewnątrz komórki.

w cytoplazmie jedno pasmo jest degradowane,

a drugie ulega rekombinacji

w rekombinacji wymagane są specyficzne sekwencje w DNA, które są powtórzone w genomie wiele razy;

Haemophilus influenzae   AAGTGCGGTCA

Neisseria gonorrhoeae GCCGTCTCAA

Rekombinacja

Niektóre fragmenty DNA rekombinują w odpowiednich (homologicznych) miejscach z genomem biorcy. W biorcy te geny mogą ulegać ekspresji i są przekazywane potomnym komórkom

Końcowy etap, czyli rekombinacja jest wspólna dla wszystkich procesów przenoszenia informacji genetycznej

Plazmid integruje do chromosomu, przekazuje geny do biorcy, a geny integrują do chromosomu biorcy na drodze rekombinacji

Rodzaje mutagenów:

Analogi strukturalne zasad azotowych – wykorzystując podobną budowę są wbudowywane w czasie replikacji w miejsce normalnych zasad. Działają tylko na komórki dzielące się.

np. 5-bromodeoksyurydyna (5-BUdR) – analog tyminy

2- aminopuryna (2-AP) – analog adeniny

2. Związki chemiczne, które chemicznie zmieniają zasady azotowe w DNA

kwas azotawy – HNO₂

hydroksylamina - NH₂OH

związki alkilowe – etyloetanosulfonian (EES), etylometanosulfonian (EMS), nitrosoguanidyna – NTG, iperyt

3. Związki interkalujące między zasady w DNA

bromek etydyny

barwniki akrydynowe – proflawina, oranż akrydynowy itd.

Analogi strukturalne zasad azotowych

Adenina 2-aminopuryna, grupa aminowa przy C2 zamiast C6

Tymina 5-bromouracyl, Br zamiast grupy metylowej przy Mutageneza 5-BUdR

BudR powoduje tranzycję pary AT→GC

Rzadkie formy tautomeryczne zasad są przyczyną mutacji powstających w replikującym DNA

Działanie kwasu azotawego na DNA określa się jako oksydatywną dezaminację zasad azotowych

Skutek mutagenny ma tylko działanie kwasu azotawego na cytozynę i adeninę.

Działanie HNO₂ na cytozynę powoduje tworzenie uracylu i tranzycję CG→AT.

Działanie HNO₂ na adeninę powoduje powstanie hipoksantyny i tranzycję AT→CG.

HNO₂ nie działa na tyminę.

Guanina przechodzi w ksantynę, która nie jest mutagenna, bo paruje z cytozyną

Spontaniczna dezaminacja cytozyny tworzy uracyl, który jest usuwany enzymatycznie z DNA

Spontaniczna dezaminacja 5-metylocytozyny, która występuje często w DNA tworzy tyminę, która nie jest usuwana z DNA, bo nie jest rozpoznawana przez uracylo-N-glikozylazę. Jest to przyczyna mutacji typu tranzycja CG→AT.

NH₂OH - Hydroksylamina (HA,) działa mutagennie tylko na

cytozynę. Pochodna cytozyny tworzy podwójne wiązanie z adeniną.

HA indukuje tranzycję CG→AT

Związki nitrowe i ich alkilowe pochodne są groźnymi mutagenami:

Nitrosoaminy

dimetylonitrosoamina dietylonitrosoamina

Nitrosoguanidyna:

Alkilacja guaniny powoduje tworzenie O⁶-metyloguaniny. Zmieniona zasada może tworzyć parę z tyminą zamiast z cytozyną powodując tranzycję GC→AT

Reakcja guaniny z EMS powoduje alkilację guaniny i połączenie z tyminą zamiast z cytozyną

Alkilacja zasad jest przyczyną depurynacji lub depirymidynacji, czyli wypadnięcia z łańcucha DNA zasad azotowych

Z guaniny powstaje 8-oksoguanina, która tworzy parę z adeniną, a nie z cytozyną. Powstaje transwersja GC --TA

Proflawina i inne barwniki akrydynowe powoduje mutacje typu mikrodelecji lub mikroinsercji w DNA, a w białku mutacje typu przesunięcia fazy odczytu.

Proflawina interkaluje między zasady azotowe, rozrywa pary zasad i odkształca heliks.

Bromek etydyny należy do barwników interkalujących do DNA i należy do kancerogenów.

Interkalacja EtBr powoduje świecenie DNA w świetle UV i jest wykorzystywana do znakowania DNA

Działanie promieni UV w zakresie długości fali 220-260 nm powoduje powstawanie dimerów pirymidyn T-T, C-C, C-T

Efektem działania promieni jonizujących na DNA są złamania jedno- lub dwuniciowe, a także tzw. krzyżowe wiązania między dwoma zasadami

Różne możliwe mutacje wywoływane przez mutageny fizyczne i chemiczne

Tworzenie dimerów pirymidyn powoduje odkształcenie heliksu

Silne naświetlenie promieniami jonizującymi powoduje powstawanie pęknięć dwuniciowych lub jednoniciowych w DNA

Mylnie wbudowane pary zasad są przyczyną mutacji typu tranzycji i transwersji

Krzyżowe wiązania między parami zasad

Alkilacja zasad powoduje apurynację lub apirymidynację

Systemy ochrony DNA

Fotoreaktywacja

Fotoreaktywacja jest naprawą uszkodzeń spowodowanych promieniami UV w świetle widzialnym o dłg. fali powyżej 300 nm (350-500 nm)

Działanie promieni UV w zakresie długości fali 220-260 nm powoduje powstawanie dimerów pirymidyn T-T, C-C, C-T.

Występuje u wszystkich organizmów poza ssakami łożyskowymi.

W obecności światła enzym fotoreaktywujący – fotoliaza tworzy kompleks z dimerem

Fotoliaza działa w obecności nukleotydu flawinowego FADH₂ i absorbuje światło widzialne.

Dzięki absorpcji światła fotoliaza przecina wiązanie między dwoma pirymidynami i przywraca normalne funkcjonowanie DNA

System naprawy przez wycinanie zasad BER – base excision rep air

Występuje u bakterii i organizmów wyższych

Usuwa błędnie zmodyfikowane zasady z DNA

Etapy działania

Rozpoznanie zmodyfikowanej zasady przez specyficzną DNA-glikozylazę

Hydroliza wiązania glikozydowego między zasadą i cukrem, co powoduje powstanie miejsca apurynowego (AP) lub apirymidynowego

Przecięcie wiązania fosfodiestrowego w 5’ końcu miejsca AP przez AP-endonukleazę, co daje wolny koniec 3’-OH

Polimeraza uzupełnia brakującą zasadę i ligaza łączy łańcuch DNA

System naprawy przez wycinanie nukleotydów NER – nucleotide excision rep air

Występuje u bakterii i organizmów wyższych

Usuwa uszkodzenia z dsDNA (fotodimery i addukty, czyli zmienione zasady przez przyłączenie różnych grup chemicznych np. alkilowych)

Białka uczestniczące w NER

UvrA – białko wiążące się z DNA

UvrB – endonukleaza, która nacina DNA w 3’ końcu w odległości 4 nt od uszkodzenia

UvrC - endonukleaza, która nacina DNA w 5’ końcu w odległości 7 nt od uszkodzenia

UvrD – helikaza II usuwa oligonukleotyd zawierający uszkodzenie

PolA – polimeraza I uzupełnia brakujące nukleotydy

LigA - ligaza łączy jednoniciowe przerwy

System SOS
Jest to naprawa uszkodzeń za wszelką cenę, kosztem generowania nowych mutacji. Występuje u bakterii i Eukaryota.

Główne geny zaangażowane w naprawę SOS (ok. 20 genów jest aktywowanych w tym systemie)

lexA – represor wszystkich genów odpowiedzi SOS, działa jako dimer. Jedna domena tego białka wiąże się z DNA , druga odpowiada za dimeryzację. Wiąże się z kasetą - SOS złożoną z 17 nt, która znajduje się w promotorach wszystkich genów systemu SOS

recA – białko rekombinacyjne, koproteaza indukująca proteolityczną aktywność białka LexA. W odpowiedzi na pojawienie się w komórce ssDNA w wyniku uszkodzeń np. promieniowaniem, RecA indukuje aktywność proteolityczną LexA

uvrABC –aktywacja tych genów następuje w wyniku proteolizy represora LexA, który blokował ekspresję tych genów

uvrD – helikaza – usuwa uszkodzone nukleotydy

umuC, umuD (umuD’)– (UV mutagenesis)- białka tworzące tzw. polimerazę V, która może replikować matrycę mimo uszkodzeń (translesion polymerase). Wstawia głównie A, generując mutacje, ale replikacja się nie zatrzymuje.

Restrykcja oznacza ograniczanie rozwoju faga na skutek działania enzymów restrykcyjnych, czyli specyficznych endodeoksyrybonukleaz.

Restryktazy są skierowane na każde obce DNA posiadające inną modyfikację (metylację). Jest to czynnik ograniczający np. transformację czy koniugację.

Modyfikacja jest to proces metylacji DNA swoisty dla danego gatunku lub szczepu. Zmetylowane DNA jest niewrażliwe na własne-komórkowe restryktazy. Jest to proces nabyty, przejściowy, nie dziedziczony.

Eskpresja genów

U bakterii geny są zorganizowane w jednostki funkcjonalne nazywane operonami.
Operon jest jednostką funkcjonalną genomu bakterii.
Zwykle w obrębie operonu znajdują się geny kodujące białka jednego szlaku metabolicznego.
Operon stanowi jedną jednostkę transkrypcyjną, niezależnie od ilości genów wchodzących w jego skład i znajduje się pod kontrolą jednego promotora.
Termin jednostka transkrypcyjna oznacza, że tworzy się jedna cząsteczka mRNA, inicjowana dzięki aktywności jednego promotora.
U bakterii transkrypcja jest sprzężona z translacją, co oznacza, że równocześnie z syntezą mRNA następuje synteza białek.
Dopiero na poziomie translacji kodony nonsensowne rozdzielają poszczególne białka.

W komórkach część genów tzw. podstawowego metabolizmu ulega ekspresji konstytutywnie - na stałym poziomie.

Adaptacja do określonych warunków środowiskowych odbywa się dzięki indukcji lub represji określonych szlaków metabolicznych.

Są też geny, które ulegają ekspresji tylko w odpowiedzi na określone substraty – są to geny (operony) indukcyjne
Geny, których aktywność jest hamowana w obecności określonych substratów są genami (operonami) represyjnymi

Operon lac (laktozowy) składa się z sekwencji regulatorowych i genów strukturalnych.

Sekwencje regulatorowe to: promotor P i operator O

Geny strukturalne to: gen lacZ – koduje β-galaktozydazę, gen lacY – koduje permeazę β-galaktozydów i gen lacA – koduje transacetylazę, która nie uczestniczy w rozkładzie laktozy.

Gen regulatorowy lacI – jest odrębną jednostką transkrypcyjną i ma własny promotor. Koduje białko- represor

Promotor operonu lac ma typową sekwencję -10 i -35 i jest rozpoznawany przez podjednostkę sigma⁷⁰ polimerazy RNA.

Operator operonu lacZ jest to sekwencja długości 24 pz o strukturze palindromu. 4 podjednostki represora wiążą się do operatora.

Jeśli w podłożu jest laktoza, represor wiąże się z laktozą i odblokowuje operator. Transkrypcja może się odbywać i enzymy są syntetyzowane

Związanie laktozy przez represor powoduje zmianę formy allosterycznej i przejściową inaktywację represora

Operon lac

Jest negatywnie regulowany przez represor, który łączy się z operatorem i blokuje transkrypcję

Jest pozytywnie regulowany przez kompleks CAP-cAMP, który przyłącza się do promotora i włącza transkrypcję, ale tylko kiedy w podłożu nie ma glukozy, a jest laktoza (lub IPTG)

ANABOLICZNY szlak syntezy tryptofanu

Kwas choryzmowy → kwas antranilowy → IGP → indol → tryptofan

Operon anaboliczny – synteza tryptofanu

W skład operonu wchodzi 5 genów strukturalnych trpA-E, gen liderowy L , sekwencje regulatorowe promotor, operator i gen regulatorowy trpR z własnym promotorem.

Jeśli nie ma tryptofanu w podłożu, nieaktywny represor (aporepresor) produkowany przez gen regulatorowy pozostaje w formie nieaktywnej, nie wiąże się z operatorem i transkrypcja może się odbywać.

Jeśli w podłożu jest tryptofan to wiąże się do represora (aporepresora) i aktywuje go powodując przyłączenie go do operatora. Tryptofan jest korepresorem.

Polimeraza jest zablokowana i transkrypcja nie może przebiegać.

Gen regulatorowy trpR ulega autoregulacji przez własny produkt, tzn. reguluje własną transkrypcję przez wiązanie do swojego promotora.

Gen regulatorowy trpR produkuje represor, który reguluje aktywność własnego genu trpR– (jest to autoregulacja) oraz ekspresję dwóch innych genów tzn. aroH – synteza aminokwasów aromatycznych i enzymów operonu trp.

Operatory (czyli miejsca wiązania represora) mogą być zlokalizowane zarówno przed początkiem transkrypcji (przed +1) lub za startem transkrypcji.

Wszystkie operony anaboliczne mają gen nazywany liderem, ponieważ wyprzedza geny strukturalne. Koduje krótki peptyd, w którym kodon dla syntetyzowanego aminokwasu powtarza się wiele razy. Powtórzenia kodonu dla końcowego aminokwasu mają znaczenie w regulacji transkrypcji.

W przypadku operonu trp kodon powtarza się 2 razy.

Gen liderowy kończy się sekwencją zwaną atenuatorem, gdyż tutaj może zatrzymać się przedwcześnie transkrypcja, w sytuacji kiedy jest tryptofan w podłożu i nie ma potrzeby go syntetyzować.

Operon tryptofanowy (i inne operony) jest regulowany nie tylko przez represor, lecz nawet skuteczniej, przez atenuację

W warunkach braku tryptofanu rybosom odczytuje sekwencję lidera i zatrzymuje się na kodonach trp

Regiony 2 i 3 łączą się, bo zawierają komplementarne pary, co zapobiega tworzeniu szpilki w regionach 3-4. Transkrypcja może być kontynuowana

Kiedy nie ma tryptofanu rybosom zatrzymuje się na kodonach trp, tworzy się struktura, która nie kończy transkrypcji

W obecności tryptofanu rybosom szybko przechodzi przez 2 kodony trp zajmując

region 2 co powoduje, że regiony 3-4 tworzą szpilkę terminującą transkrypcję.

Transkrypcja kończy się zanim przejdzie na pierwszy gen operonu

W operonie represor reguluje ekspresję tylko genów stanowiących jedną jednostkę transkrypcyjną.

W regulonie represor reguluje ekspresję wielu operonów.