Ćwiczenie XII


Ćwiczenie 1.

Temat: Otrzymywanie kwasów nukleinowych

Wykonanie:
Do probówki wirowej na 10 ml pobrać 3 ml soku z kapusty , dodać 3 ml 90% fenolu, zatkać szczelnie probówkę korkiem i wytrząsać przez 10 minut. Powstałą zawiesinę odwirować przy 4 tys obrotach/ min. W ciągu 15 minut. Po odwirowaniu zebrać ostrożnie górną fazę wodną przy pomocy pipety do innej wirówki na 10 ml. Dolną fazę enolową wylać wprost do odpływu zlewu i umyć ostrożnie. Do probówki wirowej z zebraną fazą wodną dodać 5 ml 96% etanolu, dokładnie wymieszać i odstawić na 20 min. Po tym czasie zaweisinę odwirować przez 15 minut. Supernatant zlać zaś osadu używać do dalszych ćwiczeń, jako preparat RNA.


Ćwiczenie 2.

Temat: Hydroliza kwasów nukleinowych.

Wykonanie:

Osad RNA rozpuścić w 2 ml 0,1 M roztworu NaOH, przenosząc go ilościowo do kalibrowanej probówki. Zatknąć probówkę korkiem i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po ochłodzeniu roztwór uzupełnić 0,01 M roztworem HCl do 20 ml. Dokładnie wymieszać.

Wynik:
Uzyskany produkt jest zobojętnionym hydrolizatem RNA z domieszka DNA.

Ćwiczenie 3.

Temat: Oznaczanie kolorymetryczne RNA

Wykonanie:
Sporządzić odczynnik orcynolowy. Do 2 probówke pobrać po 2 ml hydrolizatu RNA otrzymanego w ćwiczeniu 2, dodać po 1 ml wody destylowanej i po 3ml odczynnika orcynolowego. Równolegle wykonać próbę odczynnikową ( 3ml H20 + 3 ml odczynnika orcynolowego). Zawartość wszystkich probówek wymieszać po czym probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 20 minut. Po ostudzeniu odczytać absorbancję przy 660nm dla prób badanych wobec próby odczynnikowej.


Ćwiczenie 4.

Temat: Wykonanie krzywej kalibracyjnej dla RNA


a/ HYDROLIZA WZORCOWEGO RNA: 2ml wzorcowego roztworu RNA w NaOH( 1,0mg/ml), podać hydrolizie przez ogrzewanie we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. Hydrolizat przenieść ilościowo do kalibrowanej probówki i uzupełnić 0,1 M roztworem HCl do 20 ml. W Tak otrzymanym hydrolizacie stężęnie wynosi 100µg/ml.

b/ KRZYWA KALIBRACYJNA: Z hydrolizatu wzorcowego RNA w NaOH i 0,01 M HCl sporządzić po 2 ml roztworu o następujących stężeniach: 0µm/ml; 20 µm/ml; 40 µm/ml; 60 µm/ml; 80 µm/ml; 100 µm/ml.
Przeprowadzić reakcję barwną z odczynnikiem orcynolowym z ćwiczenia 3. Na podstawie zmierzonych absorbancji przy 660 nm dla badanych prób wykreślić krzywą kalibracyjną.

Na podstawie krzywej kalibracyjnej odczytać stężenie RNA w badanym preparacie.

Ćwiczenie 5.


Temat: Oznaczanie kolorymetryczne DNA


Wykonanie:
Przygotować 6 probówek z korkami. Do probówki 1 i 2 odmierzyć po 1 ml 0,01 M HCl (próby zerowe) a do probówek 3 i 4 dodać po 0,5 ml M HCl i po 0,5 ml wzorcowego roztworu DNA o stężeniu 200 µm/ml a do probówki 5 i 6 po 1 ml hydrolizatu otrzymanego w ćwiczeniu 2 . Do wszystkich probówek dodac po 2 ml odczynnika Dischego i wymieszać. Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut po czym ostudzić. Zmierzyć absorbancje dla prób wzorcowych i badanych wobec próby zerowej.