Marzena Leder 196684 Wrocław, 03.04.2014r
Judyta Raniś 193286
Inżynieria bioreaktorów
Sprawozdanie z zajęć komputerowych
Wstęp teoretyczny:
Reakcje zachodzące przy udziale enzymów można opisać za pomocą określonych parametrów kinetycznych, a także za pomocą parametrów termodynamicznych, wyrażanych przez stałe równowagi reakcji. Wyznaczenie parametrów kinetycznych charakteryzujących określoną reakcje enzymatyczną jest krokiem niezbędnym w celu poznania własności badanego biokatalizatora. Dla enzymów, których działanie opisane jest modelem kinetyki Michaelisa-Menten, wyznaczenie parametrów ogranicza się do wyznaczenia wartości Vmax oraz KM. Niestety, wspomniany model charakteryzuje bardzo ograniczoną ilość enzymów, w związku z czym wymaga pewnych modyfikacji w przypadku inhibicji enzymu substratem, czy też produktem. [1][2]
Najprostszy model, opisujący kinetykę enzymu (model Michaelisa-Menten) opiera się na następującym równaniu [5]:
$$E + S\begin{matrix}
k_{1} \\
\rightleftarrows \\
k_{- 1} \\
\end{matrix}\ \text{ES}{\ E + P}$$
gdzie:
E - enzym,
S - substrat,
ES - kompleks enzym-substrat,
P - produkt,
k1 - stała szybkości reakcji pierwszej,
k-1 - stała szybkości reakcji pierwszej, odwrotnej do k1,
k2 - stała szybkości reakcji drugiej.
Powyższe równanie należy interpretować w następujący sposób: enzym i substrat łączą się, w wyniku czego powstaje przejściowy kompleks enzym-substrat. Reakcja jest charakteryzowana przez stałą szybkości reakcji k1. Następnie z kompleksu enzym-substrat, w reakcji nieodwracalnej opisaną przez stałą szybkości reakcji k2, może powstać enzym oraz produkt. Istnieje również odmienna droga przekształcenia powstałego kompleksu. Reakcja opisywana jest przez stałą szybkości k-1 prowadzi do powstania enzymu oraz substratu z przejściowego kompleksu enzym-substrat. [3][4]
Aby równanie Michaelisa-Menten zostało spełnione konieczne jest przyjęcie szeregu założeń takich jak:
enzym i substrat reagują odwracalnie tworząc przejściowy kompleks enzym-substrat lub doświadczenie obejmuje badania jedynie początkowych etapów reakcji, kiedy stężenie produktu jest stosunkowo niewielkie, a stopień przereagowania nie przekracza wartości 3%,
ignorowanie potencjalnych reakcji w której enzym oraz produkt mógłyby odtworzyć kompleks enzym-substrat (tzw. założenie prędkości początkowej),
stężenie kompleksu enzym-substrat szybko osiąga stałą wartość w dynamicznym układzie (tzw. założenie stanu stacjonarnego),
parametry, takie jak pH, temperatura oraz siła jonowa są stałe w trakcie reakcji,
katalizatory (enzymy) nie zużywają się po przeprowadzonym cyklu reakcji,
reakcja jest jedno substratowa lub, w przypadku reakcji wielosubstratowej, stężenie tylko jednego substratu ulega zmianie się w czasie. [4]
Równanie Michaelisa-Menten, opracowane na podstawie przyjętych założeń przyjmuje następującą postać:
$$v = \frac{v_{\max}*\lbrack S\rbrack}{K_{M}*\{ S\rbrack}$$
Rozwiązaniem równania Michaelisa-Menten jest poniższy wykres [5]:
Wykres 1) Krzywa wysycenia substratem reakcji katalizowanej enzymatycznie. [5]
W celu dokładnego wyznaczenia parametrów kinetycznych Km oraz Vmax należ posłużyć się równaniem Lineweavera-Burk'a, będącym odwrotnością równania Michaelisa-Menten. [3]
$$\frac{1}{V} = \frac{K_{M}}{V_{\max}}*\frac{1}{C_{s}} + \frac{1}{V_{\max}\ }$$
Obrazem powyższej zależności jest wykres będący linią prostą:
Wykres 2) Wykres podwójnych odwrotności Lineweavera-Burk'a. [6]
Wykres Lineweavera - Burk'a jest wyjątkowo przydatnym narzędziem do badań odchyleń od kinetyki Michaelisa-Menten (należy pamiętać, że większość enzymów, w tym enzymy allosteryczne oraz większość enzymów proteolitycznych, wykazuje odmienny model kinetyki). Błędy popełnione podczas pozyskiwania danych do sporządzenia wykresu Michaelisa-Menten, a później Lineweavera-Burk'a wykazują relatywnie małe konsekwencje jeśli chodzi o wartość 1/Vmax (Vmax). Niestety jakakolwiek pomyłka, czy też wyeliminowanie nieodpowiednich punktów spowoduje dużą zmianę wartości KM. [8]
Na podstawie wyznaczonej wartości stałej Michaelisa-Menten (KM) uzyskujemy informację o stężeniu substratu, jakie jest niezbędne do osiągnięcia maksymalnej szybkości reakcji enzymatycznej oraz o ułamku miejsc aktywnych zajętych przez substrat. [7]
Przed wyznaczaniem parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej należy bardzo precyzyjnie zaplanować eksperyment. W celu przeprowadzenia odpowiednich doświadczeń należy znać stężenie maksymalne (szacunkowo równe 20xKM) oraz stężenie minimalne (zakres stężeń) w jakich będziemy badać enzym. Dodatkowo niezbędna jest znajomość wartości pH oraz temperatury. Przydatną informacją będzie również orientacyjna, szacunkowa wartość stałej Michaelisa-Menten (KM). Nie należy zbytnio obniżać stężenia minimalnego (szacunkowo powinno być większe lub równe od 0,5xKM), wówczas otrzymane przez nas wyniki mieszczą się w błędzie analitycznym, dodatkowo istnieje możliwość zarejestrowania szumu aparatu. [8]
Badań kinetycznych dokonuje się w pH równym wartości pH optymalnego dla danego enzymu, w którym to enzym jest stabilny konformacyjne. Z kolei temperatura podczas doświadczenia powinna być o 5-10˚C niższa od temperatury optymalnej, co powoduje zmniejszenie reaktywności biokatalizatora, ale gwarantuje jego stabilność (pomiar w temperaturze optymalnej powoduje, że enzym traci swoją aktywność w czasie, co jest sprzeczne z przyjętym założeniem, że stężenie enzymu=const). [8]
Ze względu na założenie dotyczące początkowych szybkości reakcji, aby poznać czas, po którym należy zatrzymać reakcję należy posłużyć się jednym z eksperymentów zasadniczych. Jeden z nich polega na dodaniu do różnych objętości roztworu identycznej ilości enzymu o jednakowym stężeniu, w wyniku czego otrzymamy odmienne stężenia biokatalizatora. Reakcje zatrzymujemy po określonym czasie (identycznym dla wszystkich probówek), zaś reżim stopnia przereagowania nie przekraczającego 3 % dla reakcji równowagowych (dla nierównowagowych wartości stopnia przereagowania mogą przyjmować wartości większe) pozwoli nam określić czas, po którym należy zatrzymać reakcję. Drugi sposób polega na dodaniu do równych objętości roztworu tej samej ilości enzymu o identycznym stężeniu. W każdej probówce zatrzymujemy reakcję (za pomocą np. odpowiedniego odczynnika) po różnym czasie. Nanosząc otrzymane wyniki na wykres zależności Cp=f(t) poszukujemy zależności liniowej, pozostałe zaś punkty ignorujemy, co pozwala nam określić czas (dla danego stężenia enzymu) odpowiedni do przerwania reakcji. [8]
Należy pamiętać, że posługując się jedną z powyższych metod popełniamy błąd analityczny związany chociażby z precyzją 1 mililitra. Metoda probówkowa prowadzi więc do otrzymania większych, bądź mniejszych wartości błędu analitycznego, co jest podstawową wadą tej metody. W celu zminimalizowania błędu analitycznego należy posłużyć się reaktorem termostatowanym. Co jakiś czas z roztworu pobieramy próbkę do badań, unikając w ten sposób znaczących błędów. [8]
Do wyznaczenia parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznych, w zależności od potrzeb i celu, stosujemy jedną z dwóch metod [8]:
Metodę poprawną biochemicznie (metodę biochemiczną),
Metodę przemysłową.
Metoda biochemiczna - jedna z metod wykorzystywana do określenia parametrów kinetycznych. W metodzie tej spełnione są wszystkie założenia kinetyki Michaelisa-Menten. Ze względu na swoją dokładność, oraz brak wymogów dotyczących orientacyjnej wiedzy na temat określonych parametrów charakteryzujących badany enzym, jest metodą najczęściej wykorzystywaną w laboratoriach chemicznych. W przeciwieństwie do metody przemysłowej pozwala na analizę oraz sporządzenie charakterystyki nowego enzymu. Wykorzystując metodę biochemiczną należy pamiętać, aby do publikacji, bądź też jakiejkolwiek pracy pisemnej stworzonej na podstawie naszych badań, dodać odpowiednie wykresy. [8]
Metoda przemysłowa - druga z metod wykorzystywana do określenia parametrów kinetycznych. W przeciwieństwie do metody biochemicznej wymaga znajomości orientacyjnych wartości parametrów kinetycznych, nie spełnia też wszystkich założeń kinetyki Michaelisa-Menten. Nieodpowiednia do analizy nowego enzymu. Jest to metoda mniej dokładna, jednak znacznie szybsza i tańsza, w związku z czym najczęściej wykorzystywana jest w przemyśle. Wykorzystując metodę przemysłową i umieszczając jej wyniki w publikacji, bądź jakiejkolwiek innej pracy pisemnej nie musimy załączać wykresów. Należy jednak pamiętać o podaniu wartości błędów statystycznych dla wyznaczonych parametrów. [8]
W jaki sposób stwierdzić obecność inhibicji bądź jakichkolwiek niezgodności z kinetyką Michaelisa-Menten? W tym celu należy sporządzić wykres dwóch zależności naniesionych na jeden wykres, ściślej zależność czasu eksperymentalnego od stężenia substratu oraz zależność czasu modelowego (obliczonego według odpowiednich równań) od stężenia substratu. Jeśli wykres dla czasu modelowego pokrywa sie z wykresem dla czasu eksperymentalnego jest to jasna dla eksperymentatora informacja, że kinetyka enzymu zależy wyłącznie od dwóch parametrów: KM i Vmax (zakładamy brak inhibicji). Jeśli obserwujemy jakiekolwiek odchylenia któregoś wykresu jest to jasny sygnał - mamy inhibicję. [8]
Reaktory okresowe należą do reaktorów wykorzystywanych zarówno w praktyce laboratoryjnej, jak i do procesów przebiegających w skali przemysłowej, ze względu na wiele zalet płynących z ich wykorzystania. Reaktory periodyczne (okresowe) są bardzo często wykorzystywane w biotechnologii, chociażby w celu przeprowadzenia hodowli okresowej mikroorganizmów, co pozwala otrzymać określone metabolity pierwotne i wtórne. Ich niewątpliwą zaletą jest możliwość otrzymania wysokich stopni przereagowania substratu, co jest możliwe dzięki dowolnie długiemu czasu reakcji. [9][10]
Reaktory okresowe służą do przeprowadzania reakcji, w których reagenty znajdują się w fazie ciekłej. Nazwa tego reaktora nawiązuje do trybu jego pracy, reaktory okresowe charakteryzują się bowiem jednorazowym wprowadzeniem produktu, przeprowadzeniem reakcji z dobrym mieszaniem w celu zapewnienia homogeniczności przez określony czas, a następnie, po zakończeniu reakcji, opróżnieniu reaktora. Bardzo istotny jest fakt, że w reaktorach tego typu jesteśmy w stanie prowadzić reakcję wyłącznie w warunkach nieustalonych. Jest to cechą charakterystyczną zarówno reaktorów okresowych jak i półokresowych. Szybkość reakcji w reaktorze okresowym jest znacznie większa niż w przypadku reaktora ciągłego, co stanowi jego podstawową zaletę w odniesieniu do reaktora ciągłego. [9][10]
Do dodatkowych zalet, jakie niesie ze sobą stosowanie reaktora okresowego zaliczymy prostotę reakcji, możliwość utrzymania skomplikowanych hodowli mikroorganizmów, a także nieco pracochłonną, ale nietrudną sterylizację reaktora. Opisywany reaktor charakteryzuje sie także dużą elastycznością produktów. Do jego wad zaliczymy z kolei obecność czasu jałowego (jest to czas niezbędny na opróżnienie i oczyszczenie reaktora, a także na jego sterylizację), a także trudności w kontrolowaniu przebiegających procesów (ze względu na stan nieustalony panujący podczas doświadczenia). Ostatnia cecha jest również nieco kłopotliwa w przypadku przeprowadzania hodowli mikroorganizmów, które są wrażliwe na przykład na wysokie stężenia produktu, co jednak nie wyklucza ich częstego użytkowania.[9][11]
Cel doświadczenia:
Celem doświadczenia było zapoznanie sie z metodami wyznaczania parametrów kinetycznych za pomocą programów Excel oraz OriginPro9, a także wykonanie odpowiednich obliczeń metodą biochemiczną oraz przemysłową.
Wyniki oraz ich opracowanie:
Kinetyka Michaelisa-Menten:
Wyznaczenie parametrów kinetycznych za pomocą regresji nieliniowej:
| Cs | r | 1/Cs | 1/r |
|---|---|---|---|
| 0,10 | 0,021 | 10,000 | 46,667 |
| 0,20 | 0,038 | 5,000 | 26,667 |
| 0,30 | 0,050 | 3,333 | 20,000 |
| 0,50 | 0,068 | 2,000 | 14,667 |
| 0,75 | 0,083 | 1,333 | 12,000 |
| 1,00 | 0,094 | 1,000 | 10,667 |
| 1,50 | 0,107 | 0,667 | 9,333 |
| 2,00 | 0,115 | 0,500 | 8,667 |
| 2,50 | 0,121 | 0,400 | 8,267 |
| 3,00 | 0,125 | 0,333 | 8,000 |
| 4,00 | 0,130 | 0,250 | 7,667 |
| 5,00 | 0,134 | 0,200 | 7,467 |
| 7,50 | 0,139 | 0,133 | 7,200 |
| 10,00 | 0,142 | 0,100 | 7,067 |
| 15,00 | 0,144 | 0,067 | 6,933 |
| 20,00 | 0,146 | 0,050 | 6,867 |
| 25,00 | 0,146 | 0,040 | 6,827 |
Na podstawie powyższej tabeli sporządzono dwa wykresy:
- Wykres przedstawiający kinetykę Michaelisa-Menten:
- Wykres przedstawiający podwójne odwrotności (wykres Lineweavera-Burk'a):
Na podstawie sporządzonych wykresów nie zaobserwowano jakichkolwiek odchyleń od kinetyki Michaelisa - Menten.
Wyznaczenie parametrów kinetycznych KM i Vmax na podstawie równania krzywej z wykresu Lineweavera- Burk'a.
Równanie wyznaczone za pomocą regresji liniowej w programie Excel:
y = 4x + 6, 6667
$\frac{1}{V} = \frac{K_{M}}{V_{\max}}*\frac{1}{C_{s}} + \frac{1}{V_{\max}\ }\ $ <=> $\frac{1}{r} = \frac{K_{M}}{V_{\max}}*\frac{1}{C_{s}} + \frac{1}{V_{\max}\ }$
$$\frac{1}{r} = 4*\frac{1}{C_{s}} + 6,6667$$
$\frac{1}{V_{\max}\ } = 6,6667$ => Vmax = 0, 150
$\frac{K_{M}}{V_{\max}} = 4$ => KM = 0, 600
Metoda biochemiczna: Wyznaczenie parametrów kinetycznych za pomocą równania Michaelisa-Menten:
| Parametr | Wartość | Błąd statystyczny |
|---|---|---|
| Vmax | 0,150 | 1,694*10-15 |
| Km | 0,600 | 8,870*10-17 |
Metoda przemysłowa z wykorzystaniem całkowej postaci równania Michaelisa-Menten.
Przykładowe obliczenie czasu modelowego:
$$t_{\text{modelowy}} = \left( \frac{1}{V_{\max}} \right)*\left( K_{M}*\ln\left( \frac{C_{s0}}{C_{s}} \right) + C_{s0} - C_{s} \right)\ \ \ \lbrack 8\rbrack$$
$$t_{\text{modelowy}} = \left( \frac{1}{0,150} \right)*0,600*(\ln\left( \frac{30,000}{29,850} \right) + 30,000 - 29,850) = 1,020$$
| t | Cp | Cs | tmodelowy |
|---|---|---|---|
| 0 | 0 | 30,000 | 0,000 |
| 1 | 0,15 | 29,850 | 1,020 |
| 2 | 0,3 | 29,700 | 2,040 |
| 3 | 0,45 | 29,550 | 3,060 |
| 5 | 0,75 | 29,250 | 5,101 |
| 10 | 1,5 | 28,500 | 10,205 |
| 15 | 2,25 | 27,750 | 15,312 |
| 20 | 2,9 | 27,100 | 19,740 |
| 25 | 3,7 | 26,300 | 25,193 |
| 30 | 4,5 | 25,500 | 30,650 |
| 40 | 5,9 | 24,100 | 40,209 |
| 50 | 7,3 | 22,700 | 49,782 |
| 60 | 8,7 | 21,300 | 59,370 |
| 79 | 11,6 | 18,400 | 79,289 |
| 100 | 14,6 | 15,400 | 100,001 |
| 120 | 17,5 | 12,500 | 120,169 |
| 150 | 22 | 8,000 | 151,954 |
| 180 | 25,7 | 4,300 | 179,104 |
| 196 | 28 | 2,000 | 197,499 |
| 210 | 29,3 | 0,700 | 210,365 |
| 219 | 29,8 | 0,200 | 218,709 |
| 222 | 29,9 | 0,100 | 222,148 |
| 225 | 29,95 | 0,050 | 225,254 |
Na podstawie powyższej tabeli sporządzono wykresy dwóch zależności: zmiany stężenia substratu w reaktorze okresowym w czasie (t = f(Cs)) oraz wykres zmiany stężenia substratu w czasie modelowym (tmodelowy = f(Cs)), które umieszczono na jednym wykresie, co pozwala porównać oba czasy.
Na podstawie analizy wykresu stwierdzono zgodność czasu modelowego i eksperymentalnego (nasz enzym pracuje pod kontrolą dwóch parametrów), a więc brak jakiejkolwiek inhibicji.
Wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji w przypadku inhibicji substratem:
Wyznaczenie parametrów kinetycznych za pomocą regresji nieliniowej:
| Cs | r | 1/Cs | 1/r |
|---|---|---|---|
| 0,1 | 0,021 | 10,000 | 46,680 |
| 0,2 | 0,037 | 5,000 | 26,693 |
| 0,3 | 0,050 | 3,333 | 20,040 |
| 0,5 | 0,068 | 2,000 | 14,733 |
| 0,8 | 0,083 | 1,333 | 12,100 |
| 1,0 | 0,093 | 1,000 | 10,800 |
| 1,5 | 0,105 | 0,667 | 9,533 |
| 2,0 | 0,112 | 0,500 | 8,933 |
| 2,5 | 0,116 | 0,400 | 8,600 |
| 3,0 | 0,119 | 0,333 | 8,400 |
| 4,0 | 0,122 | 0,250 | 8,200 |
| 5,0 | 0,123 | 0,200 | 8,133 |
| 7,5 | 0,122 | 0,133 | 8,200 |
| 10,0 | 0,119 | 0,100 | 8,400 |
| 15,0 | 0,112 | 0,067 | 8,933 |
| 20,0 | 0,105 | 0,050 | 9,533 |
| 25,0 | 0,098 | 0,040 | 10,160 |
| 30,0 | 0,093 | 0,033 | 10,800 |
| 35,0 | 0,087 | 0,029 | 11,448 |
| 40,0 | 0,083 | 0,025 | 12,100 |
Na podstawie tabeli umieszczonej na poprzedniej stronie sporządzono dwa wykresy:
- Wykres przedstawiający kinetykę Michaelisa-Menten:
- Wykres przedstawiający podwójne odwrotności (wykres Lineweavera-Burk'a):
Na podstawie sporządzonych wykresów zaobserwowano wyraźną różnicę pomiędzy otrzymanymi przebiegami powyższych wykresów, a ich typowym przebiegiem. Na tej podstawie mogliśmy sądzić, iż występuje pewien rodzaj inhibicji. Parametry równania kinetycznego metodą regresji liniowe obliczono dla punktów wykresu Lineveawera-Burk'a tworzących linię prostą bez wyraźnego odchylenia ku górze.
Wyznaczenie parametrów kinetycznych KM i Vmax na podstawie równania krzywej z wykresu Lineweavera- Burk'a.
Równanie wyznaczone za pomocą regresji liniowej w programie Excel:
y = 3, 9625x + 6, 9435
$\frac{1}{V} = \frac{K_{M}}{V_{\max}}*\frac{1}{C_{s}} + \frac{1}{V_{\max}\ }\ $ <=> $\frac{1}{r} = \frac{K_{M}}{V_{\max}}*\frac{1}{C_{s}} + \frac{1}{V_{\max}\ }$
$$\frac{1}{r} = 3,9625*\frac{1}{C_{s}} + 6,9435$$
$\frac{1}{V_{\max}\ } = 3,9625$ => Vmax = 0, 144
$\frac{K_{M}}{V_{\max}} = 6,9435$ => KM = 0, 571
Metoda biochemiczna: Wyznaczenie parametrów kinetycznych za pomocą równania Michaelisa-Menten:
| Parametr | Wartość | Błąd statystyczny |
|---|---|---|
| Vmax | 0,15 | 1,520*10-15 |
| KM | 0,6 | 1,169*10-16 |
| Kis | 50 | 1,474*10-13 |
Metoda przemysłowa z wykorzystaniem całkowej postaci równania Michaelisa-Menten.
Przykładowe obliczenie czasu modelowego:
$$t_{\text{modelowy}} = \left( \frac{1}{V_{\max}} \right)*\left( K_{M}*\ln\left( \frac{C_{s0}}{C_{s}} \right) + C_{s0} - C_{s} \right)\ \ \ \ \lbrack 8\rbrack$$
$$t_{\text{modelowy}} = \frac{1}{0,144}*\left( 0,571*\ln\left( \frac{30,000}{29,850} \right) + \left( 30,000 - 29,850 \right) \right) = 1,020$$
| t | Cp | Cs | t modelowy |
|---|---|---|---|
| 0 | 0 | 30 | 0,000 |
| 2,2 | 0,15 | 29,85 | 1,092 |
| 4 | 0,3 | 29,7 | 2,184 |
| 6 | 0,45 | 29,55 | 3,276 |
| 11 | 0,75 | 29,25 | 5,460 |
| 19 | 1,5 | 28,5 | 10,923 |
| 26 | 2,25 | 27,75 | 16,389 |
| 34 | 2,9 | 27,1 | 21,128 |
| 42 | 3,7 | 26,3 | 26,964 |
| 52 | 4,5 | 25,5 | 32,805 |
| 66 | 5,9 | 24,1 | 43,034 |
| 80 | 7,3 | 22,7 | 53,278 |
| 97 | 8,7 | 21,3 | 63,537 |
| 123 | 11,6 | 18,4 | 84,847 |
| 150 | 14,6 | 15,4 | 107,001 |
| 176 | 17,5 | 12,5 | 128,564 |
| 211 | 22 | 8 | 162,524 |
| 239 | 25,7 | 4,3 | 191,481 |
| 245 | 26,5 | 3,5 | 198,033 |
| 256 | 27,8 | 2,2 | 209,209 |
| 260 | 28,3 | 1,7 | 213,830 |
| 267 | 29 | 1 | 220,991 |
| 273 | 29,5 | 0,5 | 227,384 |
| 278 | 29,8 | 0,2 | 233,258 |
Na podstawie powyższej tabeli sporządzono wykresy dwóch zależności: zmiany stężenia substratu w reaktorze okresowym w czasie eksperymentalnym (t = f(Cs)) oraz wykres zmiany stężenia substratu w czasie modelowym (tmodelowy = f(Cs)), które umieszczono na jednym wykresie pozwalającym porównać oba czasy.
Na podstawie analizy wykresu stwierdzono znaczną rozbieżność pomiędzy czasem eksperymentalnym a modelowym. Kształt obu wykresów, jak również fakt, iż w końcowym etapie oba wykres zbiegają się w jednym punkcie, świadczy o inhibicji substratem.
| Parametr | Wartość | Błąd statystyczny |
|---|---|---|
| Vmax | 0,978 | 0,112 |
| KM | 0,189 | 0,005 |
| Kis | 24,195 | 1,450 |
Wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji w przypadku inhibicji substratem - przykład drugi opracowany za pomocą programu OriginPro:
Tym razem w programie wykorzystano poniższy wzór:
$$t_{\text{mod}} = \frac{1}{V_{\max}} \bullet \left( K_{m} \bullet \ln\frac{C_{s0}}{C_{s}} + \left( C_{s0} - C_{s} \right) + \ \left( \frac{1}{2 \bullet K_{\text{is}}}\ \right) \bullet ({C_{S0}}^{2} - {C_{S}}^{2}) \right)\ \ \lbrack 8\rbrack$$
| t | Cs | tmod |
|---|---|---|
| 0 | 30 | 0,000 |
| 2,2 | 29,85 | 1,619 |
| 4 | 29,7 | 3,234 |
| 6 | 29,55 | 4,847 |
| 11 | 29,25 | 8,064 |
| 19 | 28,5 | 16,055 |
| 26 | 27,75 | 23,974 |
| 34 | 27,1 | 30,779 |
| 42 | 26,3 | 39,081 |
| 52 | 25,5 | 47,300 |
| 66 | 24,1 | 61,489 |
| 80 | 22,7 | 75,429 |
| 97 | 21,3 | 89,124 |
| 123 | 18,4 | 116,718 |
| 150 | 15,4 | 144,190 |
| 176 | 12,5 | 169,752 |
| 211 | 8 | 207,687 |
| 239 | 4,3 | 237,871 |
| 245 | 3,5 | 244,444 |
| 256 | 2,2 | 255,462 |
| 260 | 1,7 | 259,956 |
| 267 | 1 | 266,871 |
| 273 | 0,5 | 273,027 |
| 278 | 0,2 | 278,707 |
Na podstawie powyższej tabeli sporządzono wykresy dwóch zależności: zmiany stężenia substratu w reaktorze okresowym w czasie eksperymentalnym (t = f(Cs)) oraz wykres zmiany stężenia substratu w czasie modelowym (tmodelowy = f(Cs)), które umieszczono na jednym wykresie pozwalającym porównać oba czasy.
Na podstawie powyższego wykresu możemy stwierdzić, iż czas modelowy niemal idealnie pokrywa się z czasem eksperymentalnym, a wiec użycie do obliczeń odpowiedniego wzoru (w tym przypadku uwzględniającego inhibicję substratową) jest niezwykle istotne, w określeniu rodzaju inhibicji.
Wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji w przypadku inhibicji produktem:
Wyznaczenie parametrów kinetycznych za pomocą regresji nieliniowej:
| Cs | r |
|---|---|
| 0,10 | 0,021 |
| 0,20 | 0,038 |
| 0,30 | 0,050 |
| 0,50 | 0,068 |
| 0,75 | 0,083 |
| 1,00 | 0,094 |
| 1,50 | 0,107 |
| 2,00 | 0,115 |
| 2,50 | 0,121 |
| 3,00 | 0,125 |
| 4,00 | 0,130 |
| 5,00 | 0,134 |
| 7,50 | 0,139 |
| 10,00 | 0,142 |
| 15,00 | 0,144 |
| 20,00 | 0,146 |
| 30,00 | 0,147 |
| 40,00 | 0,148 |
Na podstawie powyższej tabeli sporządzono wykres przedstawiający kinetykę Michaelisa - Menten::
Dzięki informacji, a analogii powyższych danych do krzywej Michaelisa-Menten bez inhibicji, przyjęto identyczne wartości Vmax oraz KM bez ich kolejnego obliczania.
Vmax = 0, 150
KM = 0, 600
Metoda przemysłowa:
Przykładowe obliczenie czasu modelowego:
$$t_{\text{modelowy}} = \left( \frac{1}{V_{\max}} \right)*\left( K_{M}*\ln\left( \frac{C_{s0}}{C_{s}} \right) + C_{s0} - C_{s} \right)\ \ \ \lbrack 8\rbrack$$
$$t_{\text{modelowy}} = \frac{1}{0,150}*0,600*\ln\left( \frac{30,000}{29,850} \right) + \left( 30,000 - 29,850 \right) = 1,020$$
| t | Cp | Cs | tmodelowy |
|---|---|---|---|
| 0,0 | 0 | 30,00 | 0,000 |
| 1,0 | 0,15 | 29,85 | 1,020 |
| 2,0 | 0,3 | 29,70 | 2,040 |
| 3,1 | 0,45 | 29,55 | 3,060 |
| 5,1 | 0,75 | 29,25 | 5,101 |
| 10,4 | 1,5 | 28,50 | 10,205 |
| 15,8 | 2,25 | 27,75 | 15,312 |
| 20,5 | 2,9 | 27,10 | 19,740 |
| 26,4 | 3,7 | 26,30 | 25,193 |
| 32,5 | 4,5 | 25,50 | 30,650 |
| 43,6 | 5,9 | 24,10 | 40,209 |
| 55,1 | 7,3 | 22,70 | 49,782 |
| 67,2 | 8,7 | 21,30 | 59,370 |
| 94,6 | 11,6 | 18,40 | 79,289 |
| 127,0 | 14,6 | 15,40 | 100,001 |
| 164,0 | 17,5 | 12,50 | 120,169 |
| 240,2 | 22 | 8,00 | 151,954 |
| 342,0 | 25,7 | 4,30 | 179,104 |
| 463,7 | 28 | 2,00 | 197,499 |
| 627,5 | 29,3 | 0,70 | 210,365 |
| 821,3 | 29,8 | 0,20 | 218,709 |
| 928,2 | 29,9 | 0,10 | 222,148 |
| 1035,0 | 29,95 | 0,05 | 225,254 |
Na podstawie powyższej tabeli sporządzono wykresy dwóch zależności: zmiany stężenia substratu w reaktorze okresowym w czasie eksperymentalnym (t = f(Cs)) oraz wykres zmiany stężenia substratu w czasie modelowym (tmodelowy = f(Cs)), które umieszczono na jednym wykresie pozwalającym porównać oba czasy.
Na podstawie analizy powyższego wykresu stwierdzono znaczną rozbieżność pomiędzy czasem eksperymentalnym a modelowym. Jest to jednoznaczne z występowaniem oporów reakcji i narzuca zastosowanie metody przemysłowej, gdyż regresja liniowa nie jest w stanie poprawnie opracować otrzymanych wyników. Kształt obu wykresów i znacznie większa odległość obu wykresów w początkowym fragmencie(w porównaniu do wykresu otrzymanego w wypadku inhibicji substratem), jak również fakt, iż w końcowym etapie oba wykres zbiegają się na znacznie dłuższym fragmencie, świadczy o inhibicji produktem.
Wyznaczenie parametrów kinetycznych metodą regresji nieliniowej za pomocą programu OriginPro, odznaczając przyjęcie stałej KM i Vmax, który posiadał wprowadzony następujący wzór:
$$t_{\text{modelowy}} = \frac{1}{V_{\max}} \bullet \left( K_{M} \bullet \left( \frac{1 + 30}{K_{M}} \right)\operatorname{\bullet ln}\frac{C_{s0}}{C_{s}} + \ \left( 1 - \frac{K_{M}}{K_{i}} \right) \bullet (C_{s0} - C_{s})\ \right)\ \ \lbrack 8\rbrack$$
| Parametr | Wartość | Błąd statystyczny |
|---|---|---|
| Vmax | 0,518 | 5,611*10-8 |
| KM | 0,198 | 3,662*10-10 |
| Kis | 0,773 | 8,491*10-8 |
Każda osoba w grupie otrzymała na tym etapie odrębne wyniki, co pozwala sądzić o ich niepoprawności.
Wyznaczenie parametrów kinetycznych metodą regresji nieliniowej za pomocą programu OriginPro, nakazując przyjęcie stałej KM i Vmax:
| Parametr | Wartość | Błąd statystyczny |
|---|---|---|
| Vmax | 0,600 | 0 |
| KM | 0,150 | 0 |
| Kis | 0,350 | 0,019 |
Zastosowanie stałych KM i Vmax, wyznaczonych w innym, niezależnym eksperymencie, było konieczne. Wprowadzone równanie do programu mogłoby okazać się niemożliwe do obliczenia za pomocą programu OriginPro, co skutkowałoby w błędnych i nadzwyczaj rozbieżnych wynikach (przykład powyżej, w którym odznaczono przyjęcie wartości stałych KM i Vmax).
Wnioski:
Celem doświadczenia było zapoznanie sie z metodami wyznaczania parametrów kinetycznych za pomocą programów Excel oraz OriginPro9, a także wykonanie odpowiednich obliczeń metodą biochemiczną oraz przemysłową. Wszystkie ujęte składowe celu doświadczenia zostały zrealizowane.
Podczas zajęć zapoznaliśmy się z programem OriginPro9, który jest bardzo wygodny i prosty w obsłudze. Posłużył on wyznaczeniu parametrów kinetycznych za pomocą regresji nieliniowej. Drugi użytkowany podczas zajęć program to znany wszystkim Microsoft Excel, który został wykorzystany jako narzędzie konieczne do wyznaczenia parametrów kinetycznych za pomocą regresji liniowej. W naszej subiektywnej ocenie program OriginPro jest znacznie wygodniejszy, wynika to przede wszystkim z możliwości wprowadzenia odpowiednich równań pod określonymi nazwami bez konieczności ponownego ich wprowadzania przy następnym uruchomieniu programu. Excel niestety nie posiada opcji wbudowania równania do pamięci programu, dlatego też kopiowanie poszczególnych komórek pomiędzy arkuszami jest kłopotliwe, zwłaszcza gdy równanie zawiera unieruchomioną komórkę (za pomocą znaku $) lub też odnosi się do określonej komórki, która nie istnieje w drugim arkuszu. Należy także, zwrócić uwagę na dużą dokładność wyznaczonych parametrów za pomocą programu OriginPro. W momencie kiedy dokonamy sprawdzenia na trzech etapach kontroli poprawności (m.in sprawdzenie rzędu otrzymanego błędu statystycznego) możemy być pewni w 95% poprawności wyznaczonych stałych. [8]
Na podstawie przeprowadzonych ćwiczeń zapoznaliśmy sie z metodami wyznaczania parametrów kinetycznych. Dowiedzieliśmy sie, iż regresja liniowa, wykorzystywana w metodzie biochemicznej jest metodą dokładniejszą, a jednocześnie nie nadającą się do obliczeń w wypadku procesu inhibicji. W takim przypadku bardziej przydatna okaże sie metoda przemysłowa, wykorzystywana na szeroką skalę w przemyśle. Należy jednak pamiętać, że program OriginPro9, użyty do obliczeń metodą przemysłową, podobnie jak regresja liniowa, nie jest w stanie podać poprawnych wyników w przypadku inhibicji produktem ze względu na zbyt dużą ilość niewiadomych. W przypadku inhibicji substratem, program sprawdza się doskonale, a dodatkowo umożliwia obliczenie stałej inhibicji. [8]
Wybór metody jest zależny głównie od oczekiwanej dokładności wyników, a także ich późniejszego wykorzystania. Należy pamiętać, iż metoda poprawna biochemicznie posiada większe walory naukowe, natomiast metoda przemysłowa pozwala na otrzymanie nieco praktyczniejszych wyników, których znajomość następnie jest wykorzystywana do intensyfikacji procesu produkcji. [8]
Literatura:
[1] - "Wyznaczanie parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej", dostępny w internecie: http://www.chem.uw.edu.pl/people/WAugustyniak/Data/Files/A1instruction.pdf, data: 6.04.2014r, godzina 19.54,
[2] - http://www.prochembio.pwr.wroc.pl/profil.html, data: 6.04.2014r, godzina 20.05,
[3] - Maria Bełtowska-Brzezinska, Karolina Michalska - "Kinetyka reakcji enzymatycznych", Wydział Chemii UAM, Poznań 2010, dostępny w internecie: http://www.wbc.poznan.pl/Content/151316/ENZYMY+.pdf, data: 6.04.2014r, godzina 20.09,
[4] - Instrukcja do laboratorium Biochemii I, "Ćwiczenie A", Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny, Zakład Biochemii,
[5] - "Badanie kinetyki enzymów - część II", dostępny w internecie: http://29eps.chem.univ.gda.pl/instrukcje/biochemia_cw_4.pdf, data: 6.04.2014r, godzina 21.34,
[6] - Małgorzata Brindell, Moduł Chemia organiczna i biologiczna; kurs Chemia biologiczna - laboratorium, "Kinetyka reakcji enzymatycznych", dostępny w internecie: http://www2.chemia.uj.edu.pl/dydaktyka/Kinetyka_reakcji_enzymatycznych.pdf, data: 6.04.2014r, godzina 22.56,
[7] - Maria Bełtowska-Brzezinska, skrypt do wykładów "Podstawy kinetyki chemicznej", Wydział Chemii UAM, Poznań 2009, dostępny w internecie: www.wbc.poznan.pl/publication/116021,
data: 7.04.2014r, godzina 00:20. [8] - Notatki własne z zajęć komputerowych, Laboratorium Inżynierii bioreaktorów, prowadzący: prof.dr.hab.inż. Jolanta Bryjak.
[9] - Bolesław Tabiś, "Zasady inżynierii reaktorów chemicznych", Wydawnictwo Naukowo Techniczne, Warszawa,
[10] - - Notatki własne, Inżynieria bioreaktorów - wykład prowadzony przez prof. Andrzeja Noworytę,
[11] - Krzysztof W. Szewczyk, "Technologia biochemiczna", Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, Warszawa 2003.
Wyszukiwarka