Metody genetyki molekularnej.
Bibliotek genomowa – kolekcja fragmentów DNA danego gatunku, wprowadzona do określonego wektora i klonowana w komórkach gospodarza.
Etapy tworzenia biblioteki genomowej:
-izolacja DNA z komórek organizmu, dla którego będzie tworzona biblioteka
-trawienie wyizolowanego DNA i wybranego wektora enzymem restrykcyjnym
-utworzenie zrekombinowanych wektorów
-transformacja komórek gospodarza (bakterie, drożdże)
-wprowadzenie klonów.
Biblioteka BAC – psa:
Biblioteka genomowa – zbiór różnych sekwencji DNA organizmu, które zostały sklonowane w wektorze w celu łatwego przeszukiwania i analizy.
BAC – sztuczne.
Wykorzystanie biblioteki genomowej:
-poznawanie sekwencji genomu
-identyfikacja fragmentów DNA, które zawierają znane sekwencję DNA , np.:
*sekwencje powtarzalne – mikrosatelity
*sekwencję znanego markera genetycznego, który jest sprzężony z nieznanym, poszukiwanym genem
*mapowanie fizyczne sklonowanych insertów, o których wiadomo jaki gen zawierają.
Biblioteka cDNA:
Kolekcja cząsteczki cDNA zawierająca wszystkie cząsteczki mRNA, pochodzące z określonych komórek, przepisane przy pomocy odwrotnej transkryptazy na komplementarny DNA (cDNA).
Retrowirusy – wirusy, których genom zbudowany jest z RNA.
cDNA (komplementarny DNA):
*Enzym odwrotna transkryptaza występuje w genomie retrowirusów (RNA):
-przepisywanie RNA na sekwencjÄ™ jednoniciowego DNA
-dobudowanie komplementarnego łańcucha – powstanie dwuniciowego cDNA (enzym polimerazy DNA)
*W komórkach eukariotycznych na bazie matrycowego DNA (eksony + introny):
-powstaje dojrzały mRNA (zawiera jedynie eksony)
-na matrycy dojrzałego mRNA można zsyntetyzowań cDNA, który reprezentuje jedynie sekwencje eksonów.
cDNA – powstaje na matrycy mRNA, czyli opowiada tym fragmentom DNA, które podlegały transkrypcji w danej komórce, tkance lub organie.
Etapy tworzenia biblioteki cDNA:
-izolacja mRNA
-odwrotna transkrypcja i synteza dwuniciowych fragmentów cDNA
-utworzenie zrekombinowanych wektorów
-transformacja komórek gospodarza
-wyprowadzenie klonów.
Wykorzystanie biblioteki cDNA:
*Identyfikacja genów, których ekspresja ma kluczowe znaczenie dla danej komórki, tkanki lub organu
*Identyfikacja wariantów transkrypcyjnych określonego genu, będących efektem:
-alternatywnego wycinania intronów
-redagowanie mRNA.
Biblioteka genomowa i cDNA – porównanie:
*Biblioteka genomowa zawiera kolekcję fragmentów DNA, reprezentujących cały genom danego gatunku:
-geny (eksony, introny i sekwencje regulowane)
-sekwencje poza genowe
*Biblioteka cDNA zawiera kolekcję fragmentów DNA, która odzwierciedla aktywność transkrypcyjną w danej tkance, organie:
-geny (tylko eksony)
*Dla danego gatunku można stworzyć:
-jednÄ… bibliotekÄ™ genomowÄ…
-wiele bibliotek cDNA.
Analiza genomu przy pomocy technik hybrydyzacyjnych:
-Southern blotting
-Hybrydyzacja in situ
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych:
-utworzenie dwuniciowej hybrydy poprzez komplementarne połączenie dwóch polinukleotydów
-Zastosowanie: poszukiwanie określonej sekwencji przy pomocy sondy
-Sonda: sklonowany lub amplifikowany fragment DNA, który może być wykorzystywany do poszukiwania komplementarnego fragmentu, na drodze hybrydyzacji.
Hybrydyzacja DNA-DNA:
*Hybrydyzacja metodÄ… Southerna:
-wyizolowany DNA
*Hybrydyzacja in situ (inaczej: w miejscu):
-na preparatach cytogenetycznych (chromosomy, jÄ…dra interfazowe)
-na preparatach histologicznych.
Hybrydyzacja metoda Southerna:
*Poszukiwanie określonej sekwencji nukleotydowej przy pomocy wyznakowanej sondy w DNA (genomowym lub cDNA) poddanemu trawieniu endonukleazami i rozdzielonemu elektroforetycznie:
-DNA trawione jest enzymami, które nie przecinają sekwencji powtarzających się
Etapy hybrydyzacji metodÄ… Southerna:
-izolacja DNA
-trawienie enzymem restrykcyjnym
-elektroforeza
-przeniesienie rozdzielonego DNA na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy
-znakowanie sondy
-denaturacja DNA na filtrze i DNA sondy
-naniesienie sondy na filtr
-wypłukiwanie nadmiaru sondy
-nałożenie kliszy radiograficznej
-wywołanie kliszy – detekcja miejsc gdzie zaszła hybrydyzacja.
DNA fingerprinting:
*Hybrydyzacja metodÄ… Southerna z wykorzystywaniem sondy dla sekwencji powtarzajÄ…cych siÄ™ tandemowo:
-sondy Jeffreysa (1985):
*33,6 (AGGGCTGGAGG)3]18
*33,5 (GGGAGGTGGGCAGGAGG)14