Katarzyna Kornacka
Biotechnologia III rok
Enzymy o kinetyce allosterycznej.
Enzymy allosteryczne posiadają budowe podjednostkową, so powoduje że nie działają zgodnie z kinetyką opisaną przez Michaelisa Mentena. Krzywa zależności szybkości od stężenia substratu ma postać sigmoidalną. Związanie substratu w jednym miejscu powoduje zmianę właściowości drugiego miejsca wiążącego substrat.
Miara kooperatywności- współczynnik Hilla jest to zależność między połowicznym wysyceniem miejsc aktywnych a ilością podjednostek.
Enzymem wykorzystanym w doświadczeniu jest dehydrogenaza izocytrynianowa, katalizująca przekształcanie izocytrynianu do α-ketoglutaranu w cyklu kwasu cytrynowego:
L-izocytrynian + NAD+ α-ketoglutaran + NADH + H+ + CO2
| stężenie S (L) | stężenie substratu [S] | czas reakcji | A0 | ϪA | Aktywność [μmole/min/ml | 1/V | 1/S | Log[S] | Log[v/(v-v) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0,05 | 0,1 | 0 | 0,302 | 0,602 | 0,521733 | 1,916688 | 10 | -1 | 0,32253 |
| 1 | 0,689 | ||||||||
| 2 | 0,82 | ||||||||
| 3 | 0,904 | ||||||||
| 0,1 | 0,2 | 0 | 0,235 | 0,559 | 0,484467 | 2,064125 | 5 | -0,7 | 0,229607 |
| 1 | 0,597 | ||||||||
| 2 | 0,718 | ||||||||
| 3 | 0,794 | ||||||||
| 0,2 | 0,4 | 0 | 0,483 | 0,602 | 0,521733 | 1,916688 | 2,5 | -0,4 | 0,32253 |
| 1 | 0,994 | ||||||||
| 2 | 1,017 | ||||||||
| 3 | 1,085 | ||||||||
| 0,3 | 0,6 | 0 | 0,292 | 0,619 | 0,536467 | 1,864049 | 1,666667 | -0,22 | 0,361194 |
| 1 | 0,648 | ||||||||
| 2 | 0,749 | ||||||||
| 3 | 0,911 | ||||||||
| 0,4 | 0,8 | 0 | 0,214 | 0,56 | 0,485333 | 2,06044 | 1,25 | -0,097 | -0,2317 |
| 1 | 0,636 | ||||||||
| 2 | 0,727 | ||||||||
| 3 | 0,774 | ||||||||
| 0,5 | 1 | 0 | 0,711 | 0,529 | 0,458467 | 2,181184 | 1 | 0 | 0,167803 |
| 1 | 1,13 | ||||||||
| 2 | 1,198 | ||||||||
| 3 | 1,24 | ||||||||
| 0,6 | 1,2 | 0 | 0,265 | 0,807 | 0,6994 | 1,429797 | 0,833333 | 0,079 | 0,995921 |
| 1 | 0,915 | ||||||||
| 2 | 1,023 | ||||||||
| 3 | 1,072 |
Prędkość max= 0,770
Obliczanie aktywności enzymu
Współczynnik absorbancji molowej dla NADH: ε = 6,22 · 103 l/mol/cm = 6,22 µmol/ml
A = v · l · ε
v = ∆A / l · ε
uwzględniając czas inkubacji i rozcieńczenia:
v = [∆A · R · (V / vE) / (tink · l · ε)
grubość kuwety: l = 1 cm
rozcieńczenie wyjściowe enzymu: R = 1
rozcieńczenie enzymu w próbie: V/vE = 3,25 / 0,2 = 16,25
v = (∆A · 1 · 16,25) / (tink · 1 · 6,22) = (∆A · 2,6) / tink
Dla stężenia DL-izocytrynianu [S] = 0,1 mM:
v = 0,602 · 2,6 / 3 = 0,5217µmol/min/ml
Aktywność enzymu dla pozostałych stężeń substratu obliczano w analogiczny sposób.
Oznaczanie zawartości białka metodą Bradford
| A1 | A2 | A3 | Ā |
|---|---|---|---|
| 0,860 | 0,9349 | 1,1621 | 0,985 |
k = 37 µg/100ml
rozcieńczenie enzymu: R = 50
c = (Ā · k · R)
c = 0,985· 37 · 50 = 1822,25 µg/100ml 182,225 mg/ml
Obliczanie aktywności właściwej dehydrogenazy izocytrynianowej
Dla stężenia substratu [S] = 0,1 mM:
v/c = 0,521/ 182,225 = 0,002859 µmol/min/mg = U/mg
Dla pozostałych stężeń substratu.
| [S] [mM] |
v [µmol/min/ml] | c [mg/ml] | v/c [U/mg] |
|---|---|---|---|
| 0,1 | 0,521733 | 182,225 mg/ml | 0,002859 |
| 0,2 | 0,484467 | 0,002659 | |
| 0,4 | 0,521733 | 0,002859 | |
| 0,6 | 0,536467 | 0,002944 | |
| 0,8 | 0,485333 | 0,002663 | |
| 1,0 | 0,458467 | 0,002516 | |
| 1,2 | 0,6994 | 0,003838 |
wyniki z wykresów:
vmax=0,770
n=0,1
Połowiczne wysycenie miejsc aktywnych: [S]50 = 0,67608 mM
-logk= 0,17
k= 10 -0,17 =0,67608 mM
stała K to takie stężenie substratu przy którym enzym uzyskuje 50% swojej aktywności