Aleksandra Cybulska
Analityka Medyczna, studia podyplomowe, rok I
Krew jako materiał kliniczny w kierunku diagnostyczny mikrobiologicznej zakażeń krwi oraz innych zakażeń ogólnoustrojowych i układowych
Badania mikrobiologiczne mają ogromne znaczenie w diagnostyce laboratoryjnej chorób. Wykorzystywane podczas diagnozy schorzeń niejednokrotnie przyczyniają się do bardziej efektywnego i krótszego leczenia. Przede wszystkim dlatego, że ich głównym celem jest identyfikacja etiologicznego czynnika zakażenia – wykrycie drobnoustroju chorobotwórczego w materiale klinicznym oraz jego izolacja i identyfikacja. Jest to podstawa wyboru leczenia, która przyczynia się do ograniczenia rozprzestrzeniania się mikroorganizmu oraz oceny rokowania leczenia. Kolejnym ważnym celem badan mikrobiologicznych jest określenie lekowrażliwości drobnoustroju, dzięki czemu trafniej można określić leczenie.
Krew jako materiał do badań mikrobiologicznych
Krew jest dobrym materiałem do badan mikrobiologicznych, ponieważ u zdrowych osób jest ona jałowa. Istnieją jednak wyjątki okresowych bakteriemii występujących u osób zdrowych, które dotyczą zazwyczaj bakterii komensalnych i z którymi organizm bardzo dobrze sobie radzi dzięki fagocytozie zachodzącej w śledzionie i wątrobie. Takie okresowe bakteriemie występują np.: po bronchoskopii, cewnikowaniu pęcherza lub po niektórych zabiegach chirurgicznych i stomatologicznych jak przykładowo ekstrakcja zęba.
Wiele typów zakażeń przebiega z wysiewem drobnoustrojów z ogniska zakażenia do krwi. Bakteriemię obserwujemy gdy bakterie chorobotwórcze dostają się okresowo do krwiobiegu, ale nie rozmnażają się we krwi oraz nie wywołują zmian toksycznych. Bakteriemia jest podstawą rozwoju posocznicy. Posocznica (inaczej sepsa) jest stanem, w którym wysoce zjadliwe bakterie i ich toksyny dostają się bezpośrednio lub drogą naczyń chłonnych do krwioobiegu, rozmnażając się jednocześnie we krwi. Inaczej mówiąc sepsa to bakteriemia z objawami klinicznymi ciężkiej infekcji, takimi jak: dreszcze, gorączka, złe samopoczucie i spadek ciśnienia tętniczego. Wstrząs to skrajna postać sepsy i może być wywołany toksynami produkowanymi przez Gram-ujemne pałeczki lub Gram-dodatnie ziarenkowce. Ważnym pojęciem jest również fungemia, która odnosi się do zakażenia krwi grzybami chorobotwórczymi.
Bakteriemię obserwujemy przy niektórych chorobach zakaźnych takich jak: bruceloza, leptospiroza czy dur brzuszny. W przypadku zapalenia wsierdzia, zakrzepowego zapalenia żył czy zakażonym tętniaku obserwujemy przewlekłą bakteriemię. Przejściową bakteriemię można zaobserwować w infekcjach takich jak: zapalenie stawów, zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy, zapalenie pęcherzyka żółciowego, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie szpiku, zapalenie nerek, zapalenie otrzewnej, odleżynach, zakażeniu ran czy po zabiegach chirurgicznych. Jednak jak już wcześniej wspomniano u zdrowych osób zazwyczaj ustępuje samoistnie. Bakteriemia może wystąpić w wyniku wprowadzenia mikroorganizmów drogą dożylną np.: przez cewnik, miejsce wkłucia czy podaż zakażonego płynu.
Najczęstszymi mikroorganizmami powodującymi zakażenia krwi są:
- mikroorganizmy Gram-ujemne takie jak: Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Bacteroides fragilis, Brucella spp.
- mikroorganizmy Gram-dodatnie takie jak: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, α-Hemolizujące (zieleniejące paciorkowce), Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis (grupa D), Streptococcus pyogenes (grupa A), Streptococcus agalactiae (grupa B), Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Peptostreptococcus spp., Candida albicans i inne drożdżopodobne grzyby (np. Cryptococcus neoformans).
Pobieranie próbek krwi
Próbkę krwi należy pobrać przed zastosowaniem antybiotykoterapii. Jeżeli nie jest to możliwe, próbkę krwi należy pobrać tuż przed podaniem kolejnej dawki antybiotyku. Najlepiej jest pobrać próbkę na 30 minut przed spodziewanym szczytem gorączki lub wystąpieniem dreszczy. Powinno się to odbywać w warunkach aseptycznych (jałowe rękawiczki, dezynfekcja miejsca wkłucia) ze świeżego wkłucia. Zaleca się pobranie kilku próbek (zazwyczaj dwóch lub trzech). Zaletą takiego działania jest: zmniejszone prawdopodobieństwo przeoczenia bakteriemii przejściowej oraz potwierdzenie patogennej roli ,,saprofitycznych” organizmów (np.: S. epidermidis) przez wykazanie ich obecności
w próbkach z kilku wkłuć.
Liczba pobieranych prób zależy od wcześniejszego rozpoznania. Przykładowo:
- w gorączce z objawami SIRS pobiera się 2-3 próbki z różnych wkłuć w ciągu 10 minut;
- w przypadku ostrego zapalenia wsierdzia pobiera się 3 próbki z różnych wkłuć w ciągu
1-2 godzin;
- w przypadku podostrego zapalenia wsierdzia pobiera się 3 próbki pobrane z różnych wkłuć w ciągu doby;
- w przypadku gorączki o nieustalonej etiologii pobiera się 2-3 próbki z różnych wkłuć
w odstępie 1 godziny; jeżeli wynik posiewu po 24 godzinach jest ujemny należy pobrać
2-3 nowe próbki;
- w przypadku podejrzenia zakażenia o etiologii grzybiczej pobiera się 3 próbki z różnych wkłuć pobrane co 30 minut. Krew pobierana jest także w grzybiczych zakażeniach ośrodkowego układu nerwowego, dróg oddechowych, moczowych i zakażeniach gałki ocznej.
Przed pobraniem krwi skórę pacjenta należy odpowiednio zdezynfekować. Stosowane są następujące preparaty bakteriobójcze: 70% alkohol, 2% roztwór jodyny, 10% roztwór poliwidonu jodyny, lub 0,5% roztwór chlorheksydyny w 70% alkoholu. Należy zadbać o to, aby przed pobraniem środek dezynfekujący odparował z powierzchni skóry. Czasem jednak nawet po starannej dezynfekcji skóry niektóre bakterie mogę przetrwać i przedostać się do krwi (S. epidermidis, przetrwalniki Clostridium). Pseudobakteriemie czyli fałszywie dodatnie hodowle z krwi, mogą być wynikiem użycia skażonych roztworów dezynfekujących, strzykawek lub igieł.
Istnieje cała gama podłoży stosowanych do posiewów krwi. Są to płynnym podłożem namnażającym o bogatym składzie, które pozwalają szybko wykryć bakterie tlenowe, beztlenowe i grzyby. W przypadku posiewów krwi o hodowli drobnoustrojów tlenowych często stosowane są: bulion tryptozowo-sojowy (TSB), bulion z wyciągiem mózgowo-sercowym. Z kolei do hodowli bakterii beztlenowych stosowane są: podłoże płynne tioglikolanowe, bulion Schaedlera lub bulion beztlenowy Wilkins-Chalgrena. Po uzyskaniu hodowli drobnoustrojów, mikroorganizmy przesiewa się na odpowiednie podłoża do izolacji: agar z krwią, agar czekoladowy i agar MacConkeya. U noworodków i małych dzieci należy stosować odpowiednie podłoża pediatryczne, pozwalające na pobranie odpowiednio mniejszej ilości krwi. W przypadku gdy u chorego została wdrożona antybiotykoterapia, należy pamiętać o tym, aby wybierać podłoża, które zawierają inhibitor antybiotyków.
Tabela 1. Przykładowe podłoża do posiewów wykorzystywane w laboratorium mikrobiologicznym
| NAZWA PODŁOŻA | ZASTOSOWANIE |
|---|---|
| Bactec aerobic standard | Hodowla bakterii tlenowych, gdy pacjent jest przed wdrożeniem antybiotykoterapii |
| Bactec anaerobic standard | Hodowla bakterii beztlenowych, gdy pacjent jest przed wdrożeniem antybiotykoterapii |
| Bactec aerobic plus | Hodowla bakterii tlenowych z inhibitorem antybiotyków, gdy pacjent jest w trakcie antybiotykoterapii |
| Bactec anaerobic plus | Hodowla bakterii beztlenowych z inhibitorem antybiotyków, gdy pacjent jest w trakcie antybiotykoterapii |
| Bactec PED plus | Podłoże pediatryczne wykorzystywane szczególnie u noworodków i dzieci małych, do posiewów małej ilości krwi i PMR |
| Bactec LYTIC | Podłoże lityczne beztlenowe wykorzystywane do hodowli bakterii namnażających się wewnątrzkomórkowo np. Listeria |
| Bactec MYCOSIS | Podłoże do hodowli grzybów |
| Bactec MYCO/lytic | Podłoże do hodowli prątków kwasoopornych z krwi |
Krew zawsze należy pobrać ze świeżego wkłucia. Przed pobraniem krwi butelki
z podłożem należy ogrzać do temperatury 35-37°C, gdyż ma to znaczenie dla przetrwania drobnoustrojów wrażliwych na wahania temperatury (S. pneumoniae, H. influenzae). Należy pamiętać, aby korek butelki do której będzie wprowadzana krew zdezynfekować w ten sam sposób, co skórę pacjenta. Pozwala to uniknąć zanieczyszczenia próby. Podczas pobierania zaleca się używane igieł dwustronnych, które pozwalają na pobranie krwi bezpośrednio do butelki z podłożem. Krew należy pobrać do odpowiedniej objętości podłoża płynnego (zwykle w stosunku krew/podłoże 1:10 lub 1:20). Podczas pobierania krwi od dziecka, należy stosować odpowiednie podłoża pediatryczne, wymagające mniejszej ilości materiału. U osób dorosłych z wkłucia pobiera się ok. 10 ml krwi, u dzieci 2-5 ml mogą być wystarczające,
u niemowląt i noworodków zazwyczaj można uzyskać 1-2 ml krwi. Każda z próbek powinna być posiana do dwóch butelek. Materiał należy pobrać w odpowiedniej kolejności: najpierw wprowadza się krew do butelki przeznaczonej do hodowli szczepów beztlenowych (należy uważać aby zachować środowisko beztlenowe!), a następnie do butelki przeznaczonej do hodowli ściśle tlenowych mikroorganizmów. Po wyjęciu igły z butelki, korek należy przykryć jałowym gazikiem i zabezpieczyć, tak aby nie uległ on przesunięciu. Następnie należy wymieszać krew z podłożem tak aby nie powstały skrzepy. Materiał należy przetransportować do laboratorium w jak najkrótszym czasie bez schłodzenia próby.
W przypadku braku możliwości dostarczenia materiału do laboratorium należy go przechować w cieplarce w temperaturze 35-37°C.
Czasem zalecane jest użycie antykoagulantu, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów. Często stosowany jest polianetosulfonianu sodu (SPS), gdyż hamuje on jednocześnie aktywność przeciwbakteryjną osocza i fagocytów. Zastosowanie antykoagulantu nie jest konieczne, w przypadku gdy krew zaraz po pobraniu zostanie dokładnie wymieszana
w odpowiedniej ilości bulionu. W przypadku gdy nie są dostępne butelki z podłożem płynnym, krew należy pobrać do probówki zawierającej sterylny roztwór antykoagulantu (SPS, cytrynian lub heparyna). Następnie po dostarczeniu do laboratorium próbka
w warunkach sterylnych powinna zostać przeniesiona do butelki z butelki z bulionem. Jeżeli krew jest pobrana do probówki bez antykoagulantu, w laboratorium skrzep przenosi się
w sterylnych warunkach do butelki z bulionem. Surowicę, z kolei, można wykorzystać do wykonania niektórych testów serologicznych (np. odczynu Widala).
Interpretacja wyników
Wynik dodatni uzyskujemy, gdy ten sam gatunek mikroorganizmu zostanie wyhodowany w przynajmniej dwóch próbkach krwi. Zazwyczaj wzrost obserwowany jest
w przeciągu 24-48 godzin od czasu rozpoczęcia inkubacji próby. Niektóre gatunki bakterii, prątki i grzyby wymagają dłuższego czasu inkubacji. Po otrzymaniu wyniku dodatniego określa się lekowrażliwość drobnoustrojów, aby lepiej dobrać leczenie pacjenta. Lekarze
w trakcie oczekiwana na wynik bardzo często podają pacjentowi antybiotyk o szerokim spektrum działania, tak aby ograniczyć infekcję, następnie po otrzymaniu wyników badań mikrobiologicznych wdrażają antybiotyk odpowiedni dla danego drobnoustroju.
Gdy z pobranych próbek kilkukrotnie zostaną wyizolowane bakterie należące do fizjologicznej floty człowieka, wynik taki można uznać za dodatni, szczególnie u osób w fazie immunosupresji, po wszczepieniach protez czy też z poważną chorobą podstawową.
Jeżeli wzrost drobnoustrojów otrzymamy tylko w jednej próbce po kilku dniach inkubacji, a wyhodowane mikroorganizmy wchodzą w skład fizjologicznej flory skórnej
(np. Bacillus subtilis, gatunki z rodzaju Propionibacterum lub Corynebacterium) wynik taki przyjmujemy za fałszywie dodatni. Wynik taki jest rezultatem zanieczyszczenia próbki.
Wynik ujemny otrzymujemy gdy po kilku dniach hodowli nie uzyskujemy wzrostu żadnych drobnoustrojów. Oznacza to, że prawdopodobieństwo zakażenia krwi drobnoustrojami jest bardzo małe, jednak wynik taki nie daje stuprocentowej pewności, że zakażenie krwi jest wykluczone. Należy pamiętać o tym, że niektóre mikroorganizmy rosną na pożywkach hodowlanych bardzo długo.
Gdy pobrana próbka krwi do badań mikrobiologicznych była źle pobrana, nieodpowiednio transportowana, pobrano za małą ilość krwi czy też próbę pobierano niedługo po podaniu antybiotyku wynik badania uznajemy za fałszywie ujemny i należy badanie powtórzyć, dokładnie dbając o zachowanie norm pobierania krwi do badań mikrobiologicznych.
Bibliografia:
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 21 stycznia 2009 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych ;
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 3 listopada 2004 r.
w sprawie wykazu zabiegów i czynności polegających na pobraniu od pacjenta materiału do badań laboratoryjnych
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 marca 2006 r. w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych
Ustawa z dnia 5 grudnia 2008 r. o zapobieganiu oraz zwalczaniu zakażeń i chorób zakaźnych u ludzi
Podstawowe procedury laboratoryjne w bakteriologii klinicznej. PZWL, 2003
Olszańska D. Badanie mikrobiologiczne płynów z jam ciała. Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej i Immunologii Infekcyjnej USK w Białymstoku
Procedura pobierania materiałów do badań mikrobiologicznych - Wojewódzki Szpital Specjalistyczny w Legnicy