Sprawozdanie MOK cienie

Sprawozdanie

Molekularna organizacja komórki

III rok Biotechnologii

Cel: Izolacja „cieni” erytrocytów i selektywna ekstrakcja białek błon erytrocytów.

Kierownik ćwiczeń:
dr Agnieszka Biernatowska

Sprawozdanie wykonane przez:

Jakub Szymczyk

Kamil Senderowski

Natalia Domagała

Natalia Matczyńska

Weronika Gajdzik

Joanna Ligas

Joanna Lis

Agnieszka Kordylewska

Tomasz Kościelecki

  1. Wstęp teoretyczny

„Cienie” erytrocytów – błona erytrocytu oraz zawarty wewnątrz zrąb. Cienie erytrocytów stanowią ok 10% suchej masy erytrocytów.

  1. Postępowanie:

Preparacja „cieni” erytrocytów wykonana została w oparciu o instrukcję do ćwiczeń. Całość preparacji wykonywano na lodzie, z wykorzystaniem uprzednio schłodzonego szkła i odczynników.

  1. Preparacja „cieni” erytrocytów:

  1. Otrzymany od prowadzącego ekstrakt erytrocytów z ludzkiej krwi zawieszono w stosunku 1:1 w buforze fosforanowym (310mosM – zapewnia podobną wartość osmotyczną w stosunku do erytrocytów) i wirowany przez 10 minut w 4oC przy 2000rpm.

  2. Pobrano delikatnie supernatant, który odrzucono

  3. Osad zawieszono w 20mosM (20mosM – zapewnia hipotoniczne warunki względem erytrocytów powodując wnikanie buforu do wnętrza komórek, pękanie i wypływ organelli na zewnątrz) buforze fosforanowym z dodatkiem PMSF. Związek ten z grupy halogenków sulfonylowych jest inhibitorem proteaz serynowych. Zabezpiecza tym samym przed strawieniem białek.

  4. Zawieszony uprzednio osad rozdzielono na dwie probówki 500ml, dopełniono ww. buforem do ¾ objętości i zrównoważono.

  5. Wirowano przy 10 000*g, 25 min w T=4oC. Supernatant odrzucono, a osad ponownie zawieszono w 20moS buforze fosforanowym.

  6. Powtarzano wirowanie (10 000*g, 20 min w T=4oC) do uzyskania jasnego (prawie przeźroczystego) supernatantu.

  7. Gotowe preparaty połączono i zamrożono dla kolejnych grup.

  1. Izolacja „cieni” erytrocytów:

Otrzymany od poprzedniej grupy preparat „cieni” rozmrożono i zawieszono w stosunku 1:1 w wodzie destylowanej z dodatkiem 1mM PMSF, zwirowano (25000rpm, 15min), a otrzymany osad zawieszono w 5ml wody destylowanej – próbka 1.

  1. Ekstrakcja białek błonowych

Detergent 1% TRITON X-100

  1. „Cienie” pobrano, zawieszono w detergencie i inkubowano przez 40min na lodzie.

  2. Wirowano przez 25 minut przy 20000rpm

  3. Supernatant i osad zebrano i zachowano do dalszych analiz.

Roztwór o niskiej sile jonowej (0,1mM EDTA)

  1. Porcję „cieni” zawieszono w EDTA i inkubowano w bloku grzejnym nagrzanym do temp=37 oC

przez 30 minut.

  1. Wirowano przez 25 minut przy 20000rpm

  2. Supernatant i osad zebrano i zachowano do dalszych analiz.

Roztwór alkaliczny (0,1M NaOH schłodzony do 4oC)

  1. „Cienie” pobrano, umieszczo w schłodzonej probówce wirówkowej i wytrząsano na wytrząsarce z 7ml NaOH

  2. Wirowano przez 25 minut przy 20000rpm

  3. Supernatant zebrano i zachowano do dalszych analiz.

  4. Osad zawieszono w 1ml buforu fosforanowego 0,1M o pH=8.

W wyniku tak przeprowadzonej ekstrakcji białek, w poszczególnych frakcjach otrzymano:

Supernatant – białka integralne

TRITON X-100

Osad – białka peryferyjne i fragmenty błon

Supernatant – białka peryferyjne (aktyna i spektryna)

EDTA

Osad – białka integralne np.BPA i fragmenty błon tzw. Odwrócone pęcherzyki

Supernatant – białka peryferyjne

NaOH

Osad – białka integralne i fragmenty błon

  1. Mikrobiuretowa metoda ilościowego oznaczania białka

  1. W celu oznaczenia ilości białka w preparatach sporządzono krzywą standardową według instrukcji do ćwiczeń

  2. Uzyskane dane:

Preparat Objętość dodawanego preparatu [µl] A330

Ilość białka w

dodawanej objętości preparatu [µg]

 Ilość białka [µg/ml]
Cienie erytrocytów 20 0,057 3,23 161,5
Osad po ekstrakcji cieni roztworem o niskiej sile jonowej (EDTA) 50 0,063 3,47 69,48
Supernatant po ekstrakcji cieni roztworem o niskiej sile jonowej 100 0,082 4,24 Średnia: 33,13
500 0,274 11,95
Osad po ekstrakcji cieni roztworem detergentu (Triton X-100) 50 0,021 1,79 35,74
Supernatant po ekstrakcji cieni roztworem detergentu 100 0,013 1,47 Średnia: 12,97
500 0,117 5,64
Osad po ekstrakcji cieni roztworem alkalicznym (NaOH) 50 0,030 2,15 Średnia: 42,97
Supernatant po ekstrakcji cieni roztworem alkalicznym 100 - - 6,06
500 0,052 3,03

  1. Przykład obliczenia preparatu cieni erytrocytów:

Równanie prostej regresji z krzywej standardowej:


y = 0, 0249x −  0, 0235


y = 0, 057


0, 057 = 0, 0249x − 0, 0235


x = 3, 23μg

3, 23μg ------------------------20μl

x------------------------1000μl


x = 161, 5μg  = >161, 5μg/ml

  1. Wnioski

Otrzymany od poprzedniej grupy preparat „cieni” rozmrożono i zawieszono w stosunku 1:1 w wodzie destylowanej z dodatkiem 1mM PMSF, zwirowano (25000rpm, 15min), a otrzymany osad zawieszono w 5ml wody destylowanej – próbka 1. Największą ilość białek zaobserwowano w preparacie cieni erytrocytów. Jest to wynik prawidłowy, gdyż był to preparat wyjściowy, w którym znajdowały się białka zarówno peryferyjne jak i integralne. Następnie dokonano ekstrakcji tych białek za pomocą różnych czynników. Wyniki uzyskane po ekstrakcji pokazują, że niska siła jonowa i detergent ekstrahują białka peryferyjne z podobną wydajnością. Natomiast ekstrakcja tych białek roztworem alkalicznym dała najniższy wynik, więc można stwierdzić, iż nie jest to odpowiedni czynnik do ekstrakcji tego typu białek.

Najlepszy wynik ekstrakcji białek integralnych uzyskano za pomocą niskiej siły jonowej, a nieco mniejszą wartość za pomocą roztworu alkalicznego. Bardzo małą ilość tych białek otrzymano z ekstrakcji za pomocą detergentu, chociaż wynik ten powinien być porównywalny lub wyższy od pozostałych. Możliwe, że detergent nie był dobrej jakości, dlatego mógł nie zadziałać prawidłowo. Z analizy wyników elektroforezy również obserwujemy brak białek integralnych na ścieżkach gdzie powinny się ujawnić, co również potwierdza hipotezę, że detergent nie zadziałał tak jak powinien.

  1. Oznaczanie aktywności esterazy acetylocholinowej w błonach erytrocytów.

Esteraza acetylocholiny jest enzymem rozkładającym wiązanie estrowe jednego z podstawowych neuroprzekaźników – acetylocholiny. Enzym ten znajduje się głównie w zakończeniu płytki motorycznej i w synapsach cholinergicznych w centralnym układzie nerwowym, a także jest enzymem markerowym błon erytrocytu, dlatego jej aktywność oznaczano na ćwiczeniach. W wykonanym doświadczeniu substratem dla tego enzymu był jodek acetylocholiny. W wyniku hydrolizy powstawał związek, który łączył się z kwasem dinitrobenzoesowym (DNTB) dając barwny produkt. Następnie otrzymany związek oznaczano spektrofotometrycznie przy długości fali wynoszącej 412 nm.

  1. Oznaczanie aktywności esterazy acetylocholinowej przeprowadzono zgodnie ze skryptem do ćwiczeń.

  2. Uzyskane wyniki:

Minuta Próba kontrolna Cienie Ekstrakcja białek błonowych detergentem Ekstrakcja białek błonowych roztworem o niskiej sile jonowej
Supernatant 100μl Osad 50μl
A 412 A412 ΔA A412
0 0,009 0,200 0,191 0,547
1 0,011 0,224 0,213 0,556
2 0,013 0,258 0,245 0,573
3 0,013 0,289 0,276 0,575
4 0,015 0,303 0,288 0,585
5 0,016 0,323 0,307 0,594
6 0,017 0,350 0,333 0,604
Średnia aktywność 0,265 0,563
Minuta Próba kontrolna Ekstrakcja białek błonowych roztworem alkalicznym 1:1 TRITON X-100 (20/20 µL)
Supernatant 100μl Osad 50μl
A 412 A412 ΔA
0 0,009 0,0161 0,152
1 0,011 0,174 0,163
2 0,013 0,167 0,154
3 0,013 0,174 0,161
4 0,015 0,179 0,164
5 0,016 0,183 0,167
6 0,017 0,192 0,175
Średnia aktywność 0,162 0,423

  1. Obliczenia

    1. Cienie erytrocytów


V = 0, 265/1, 36 * 104

V =  1, 95 * 10−5(mol/l/min)

  1. Ekstrakcja białek błonowych detergentem (1% TRITON X-100)

Supernatant: V =  4, 14 * 10 −5(mol/l/min)

Osad: V =  1, 08 * 10 −5(mol/l/min)

  1. Ekstrakcja białek błonowych roztworem o niskiej sile jonowej (EDTA)

Supernatant: V =  1, 01 * 10 −5(mol/l/min)

Osad: V =  3, 16 * 10 −5(mol/l/min)

  1. Ekstrakcja białek błonowych roztworem alkalicznym (NaOH)

Supernatant: V =  1, 19 * 10 −5(mol/l/min)

Osad: V =  3, 11 * 10 −5(mol/l/min)

  1. Cienie erytrocytów (rozcieńczenie 1:1)

V =  1, 32 * 10 −5(mol/l/min)

  1. Ekstrakcja białek błonowych detergentem (1% TRITON X-100)

V =  1, 7 * 10 −5(mol/l/min)

  1. Wnioski

Analizując poszczególne etapy ekstarkcji białek błon erytrocytarnych, zauważono, że preparat 1), powinien charakteryzować się najwyższą szybkością reakcji, natomiast orztrzymana wartość wskazuje najprawdopodobniej na błędy w pipetowaniu. W kolejnym etapie, w supernatancie preparatu 2) widzimy dość duży wzrost szybkości reakcji; spowodowane to jest przedostaniem się do supernatantu białek integralnych wykazujących wysoką aktywnośc acetynocholinesterazową. Natomiast w osadzie zauważono spadek szybkości reakcji, wskazuje to na obecność w nim białek peryferyjnych i fragmentów błon, odznaczających się niższą aktywnością acetylocholinesterazy. W preparacie 3) supernatant ma niższą szybkość reakcji, co zawdzięcza obecności białek peryferyjnych, natomiast osad bogaty jest w białka integralne i to zwiększa szybkość reakcji i aktywność. Podobna sytuacja jest w preparacie 4); supernatant charakteryzuje się spadkiem aktywności i szybkości reakcji = obecność białek peryferyjnych, natomiast osad wzrostem powyższych wartości = dzięki obecności białek integralnych. Cienie erytrocytarne traktowane Tritonem X 100 w stosunku 1:1, preparat 5) również wykazują niewielką szybkość reakcji, co także utożsamia je z obecnością białek peryferyjnych. Z kolei w preparacie 6) aby wykazać aktywność acetylocholinesterazową, należało uprzednio pęcherzyki zsolubilizować, po drodze straciliśmy najprawdopodobniej część białek integralnych, dlatego aktywność i szybkość reakcji także klasyfikują się w niskich wartościach.

  1. Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących.

  1. Procedura elektroforezy wraz z przygotowaniem żelu została przeprowadzona zgodnie z instrukcjami zawartymi w skrypcie.

  2. Sposób przygotowania próbek na elektroforezę przedstawia poniższa tabela.

Frakcja badana Odczynnik redukujący [ul] Próbka [ul]
Cienie lub osad [nr. 1,2,4,6] 6 20
Supernatant [nr.3,5,7] 18 80

  1. Kolejność nakładania prób na elektroforezę:

    1. Cienie erytrocytów

    2. Osad po ekstrakcji roztworem o niskiej sile jonowej (EDTA)

    3. Supernatant po ekstrakcji cieni roztworem o niskiej sile jonowej (EDTA)

    4. Osad po ekstrakcji cieni roztworem detergentu (TRITON X-100)

    5. Supernatant po ekstrakcji cieni detergentu (TRITON X-100)

    6. Osad po ekstrakcji cieni roztworem alkalicznym (NaOH)

    7. Supernatant po ekstrakcji cieni roztworem alkalicznym (NaOH)

  2. Schemat prawidłowego rozdziału elektroforetycznego białek cieni erytrocytów w żelu poliakryloamidowym, względem którego ocenialiśmy poprawność wyników naszego doświadczenia.

  1. Żel otrzymany po wybarwieniu roztworem Coomasie Blue. 

  1. Wnioski

Rozdział elektroforetyczny przeprowadzono w celu identyfikacji białek zawartych w preparacie „cieni” erytrocytów oraz w otrzymanych osadach i frakcjach supernatantu po ekstrakcji białek błonowych trzema rodzajami detergentów ( EDTA, NaOH, Triton X-100).

W wyniku ekstrakcji roztworem Tritonu X-100 oczekiwaliśmy pojawienia się białek peryferyjnych w osadzie(4), natomiast integralnych w supernatancie (5).

Dwa pozostałe detergenty (EDTA oraz NaOH) powinny doprowadzić do pojawienia się białek integralnych w osadzie(2 oraz 6), z kolei w supernatancie powinny znaleźć się białka peryferyjne( 3 oraz 7).

Rozdział na białka integralne i peryferyjne jest możliwe dzięki temu, że detergenty powodują częściową solubilizację błony. Skutkiem jest ekstrakcja białek związanych z błoną do roztworu.

Niestety w naszym przypadku jedynie po ekstrakcji roztworem alkalicznym na wybarwionym żelu widoczny jest typowy rozdział na białka integralne i peryferyjne (6 i 7). Ekstrakcja innymi detergentami okazała się na tyle nieskuteczna, że ostatecznie brak jest jakiejkolwiek selektywnej ekstrakcji - wszystkie nasze białka znalazły się w osadzie. Niepowodzenie w przypadku dwóch pozostałych detergentów mogło być spowodowane różnymi czynnikami, m.in. nieprawidłową inkubacją próbek z detergentem lub nieaktywnym detergentem w wyniku czego nie nastąpiła solubilizacja błony, w konsekwencji czego białka nie zostały wyekstrahowane z błon i ostatecznie znalazły się razem z nimi w osadzie. Problem można również wytłumaczyć nieprawidłowym odwirowaniem próbek po ekstrakcji.


Wyszukiwarka