Intronów jest dużo i mają one duże znaczenie.

Każdy z intronów musi być precyzyjnie wycięty.

Proces wycinania intronów jest bardzo złożony, nie ma wspólnego mechanizmu dla wszystkich intronów, ponieważ jest wiele typów intronów.

Intron GU-AG w eukariotycznym pre-mRNA

Intron – sekwencja, która w mRNA jest wycinana, nie koduje informacji o białku.

Sekwencja intronowi jest kodowana przez specyficzne sekwencje w DNA.

Jak to jest w GU-AG?

- na końcu 5’ mRNA na granicy z egzonem ciąg 2 reszt GU (miejsce 5’ splajsingu) – określa ona koniec 5’ intronu – inaczej miejsce donorowe

- po stronie 3’ – na granicy intronu i egzonu (miejsce akceptorowe, miejsce 3’-splajsingowe) kończy się ona ciągiem reszt AG

W ten sposób wyznaczone są granice intronów.

Są jeszcze inne sekwencje, ale nie występują u wszystkich eukariotów.

- trakt polipirymidynowy – jest umieszczony bezpośrednio przed końcem 3’

- występuje często u drożdży – sekwencja UACUAAC – znajduje się 18-140 nukleotydów od miejsca 3’, u wyższych eukariotów tak sekwencja nie występuje.

Jak te sekwencje pełnią funkcję podczas wycinania intronów?

Wycinanie intronu GU-AG można podzielić na 2 etapy:

Oba etapy to 2 reakcje transestryfikacji:

1. Pierwsza reakcja zachodzi po stronie 5’ intronu, zależy od grupy hydroksylowej z pozycji 2’ nukleotydu adeninowego, reszta A prowadzi atak nukleofilowy – przecina się wiązanie fosfodiestrowe po 5’ stronie intronu, powstaje wiązanie pomiędzy 5’ w reszcie G, a 2’ w reszcie A i zamyka się struktura. Powstaje pętla na strukturze intronowej.

2. 2 reakcja dotyczy miejsca 3’ na intronie, towarzyszy 1 reakcji, zachodzą one prawie równocześnie, zachodzi przy udziale grupy 3’-OH, atakuje ona egzon następny (wiązanie fosfodiestrowe dokładnie) i w ten sposób intron jest uwalniany. W ten sposób egzony łączą się ze sobą.

W obu typach reakcji nie ma reakcji hydrolizy.

Intron w postaci lassa opuszcza układ i ulega degradacji.

Ale występują różnego rodzaju problemy topologiczne, między innymi pominięcie intronu. Albo ukryte sekwencje – kryptyczne miejsce składania.

Aparat, który składa tranksyrpt musi te kryptyczne introny ignorować. Centralnymi składnikami tego aparatu są snRNA – małe jądrowe RNA.

Jest ich - np.: U1-snRNA.

Są krótkimi cząsteczkami RNA, mają długość od 106-185 nukleotydów. Tworzą one kompleksy z białkami – maja jądrowa rybo nukleoproteina – snRNP.

Połączone z innymi cząsteczkami tworzą serię kompleksów, które wszystkie składają się na kompleks składania RNA – splajsosom.

Jest on w pełni aktywną formą kompleksu i jest zdolny do wycinania intronów.

Tworzenie splajsosomu

Jest to proces wieloetapowy. Najpierw powstaje kompleks angażujący, który zawiera U1-snRNP, który przyłącza się w miejscu 5’ składania. Jest to możliwe dzięki komplementarnemu wiązaniu RNA. Oprócz tego z intronem wiążą się SF1 i U2AF (2 białka). W miejscu rozgałęzienia (to miejsce, gdzie jest reszta A) wiąże się czynnik białkowy SF1 (wyznacza on miejsce rozgałęzienia). Na odcinku traktu polipirymidynowego wiąże się U2AF³⁵, apo stronie 3’ intronu U2AF⁶⁵.

Wstępny kompleks składania – różni się tym od tego 1, że dołącza się U2-snRNP. Wiąże się w miejscu rozgałęzienia. Dochodzi do oddziaływania U1-snRNP i U2-snRNP. Dochodzi do zbliżenia miejsca 5’ i miejsca rozgałęzienia. Dalej kompleks powiększa się o U4-snRNP i U6-snRNP (występują razem w kompleksie) i jeszcze wiąże się U5-snRNP. Włączenie tych 3 powoduje powstanie aktywnego splajsosomu. Kompleks ten charakteryzuje się tym, że wszystkie 3 pozycje są blisko siebie i dzięki temu mogą zachodzić oddziaływania pomiędzy tymi miejscami.

Dlaczego egzony nie są gubione?

Nie wiadomo do końca dlaczego.

Ważną rolę podczas określania precyzyjności składania spełniają białka SR, ponieważ domeny C-końcowe tych białek zawierają domeny bogate w Ser i Arg.

Stymulują one działanie SF1 i U2AF. Na tych białkach budowany jest ten kompleks.

Białka SR rozpoznają sekwencje ESE (egzonowy wzmacniacz składania), które są położone w egzonie.

Białka SR oddziałują z kompleksem angażującym.

Bez tych białek formowanie kompleksu nie jest efektywne, czego dowodzi między innymi dystrofia mięśniowa – mutacja w genie kodującym ESE.

Sekwencje egzonowe są krótsze.

Niektóre białka SR (białka CASP – białka typu SR wiążące się z CTD) wiążą się z kompleksem preinicjacyjnym i transkrypcyjnym.

Dowodzi to tego, że transkrypcja i splajsing są procesami zależnymi od siebie.

Alternatywny splajsing.

Powstawanie różnych tran skryptów na podstawie tej samej informacji genetycznej.

Nie zachodzi on dla wszystkich genów

Im bardziej organizm jest złożony, tym jest on bardziej powszechny.

Daje on różne produkty białkowe przy tej samej informacji genetycznej.

W genomie człowieka ok. 35% genów podlega alternatywnewu splajsingowi.

Przykłady:

- proces determinacji płci u muszki owocowej.

Jest to proces wieloetapowy, pierwotnym genem jest gen sxl.

Gen ten może podlegać splajsingowi na 2 sposoby.

Egzon 3 może pozostać w dojrzałym transkrypcie wycięty na 2 sposoby:

Sex muchy jest określany przez splajsing alternatywny.

1. Egzon 3 nie jest usuwany – ślepa uliczka – samiec

2. Egzon 3 jest wycinany – powstaje białko SXL (noi samica powstaje)

Białko to wiąże się z intronem. Kiedy związany jest z transkryotem powoduje to wybór krytycznego miejsca składania. U2Af⁶⁵ wiąże się przez to nie w standardowym miejscu, tylko wiąże się w egzonie. Powstaje produkt TRA.

Funkcja TRA

Bierze udział w kolejnym alternatywnym splajsingu. Oddziałuje z białkami SR. Dalej potem to wszystko wiąże się z egzonem 4. To oddziaływanie powoduje wybór takiego miejsca składania, że transkrypt jest specyficznym tran skryptem dla samicy.

Powstaje białko DSX (zarówno u M, jak i K)

DSX – double sex.

- 2 przykład – dotyczy genu slo – koduje białko ludzkie występujące w błonie – odpowiedzialne za wpływ i wypływ jonów potasowych.

Gen ten ma 35 egzonów. W splajsingu alternatywnym bierze udział 8. Są tam różne kombinacje. Do tej pory stwierdzono, że może powstać 500 produktów. Te białka determinują właściwości słuchowe w uchu komórek włoskowych

Trans-spaljsing

U niektórych organizmów – splajsing RNA w układzie trans, sekwencje łączone ze sobą pochodzą z różnych RNA. Proces ten nie jest powszechny, zachodzi w chloroplastach, u C. elegant i w pasożytach kręgowców.

Krótki odcinek liderowy jest dołączany do 5’ końca tan skryptu, transkrypt dostarczający ten odcinek to transkrypt liderowy.

Proces ten jest podobny do procesowania GU-AG. Nie powstaje tu lasso, tylko struktura widełkowa.

Niektóre z tran skryptów zawierają więcej niż 1 gen – policistronowe mRNA.

SL RNA (liderowy RNA), gdy przyłącza się do genu A, to jest ok. ekspresjonowany, a gen B nie jest. I na odwrót.

Położenie tej sekwencji determinuje, który gen jest dostępny dla aparatu translacyjnego.

Introny AU-AC

Jest około 20 tych genów, występują u różnych organizmów eukariotycznych.

Mechanizm wycinania intronów jest podobny do tego 1.

Mamy znowu 2 reakcje transestryfikacji.

Czynniki zaangażowane w wycinanie intronów są inne.

Rolę U1 i U2 przejmuje inny kompleks.

Synteza i procesowanie funkcjonalnych RNA

Funkcjonale RNA to tRNA i rRNA.

Są syntezowane przez polimerazę I i II.

Synteza

Polimeraza I jest wolniejsza od II. Polimeraza I syntezuje 20 nukletoydów/min. Daje ona produkty, które nie posiadają modyfikacji na 5’ końcu – brak kapu. Wymaga czynników elongacyjnych, aby skutecznie prowadzić transkrypcję.

U polimerazy I i III nie występuje poliadenylacja.

Zamiast poliadenylacji i polimerazy I istotną rolę odgrywają białka (Reb1p – drożdże, TTF-I – muszka)

Przyłączają się one do sekwencji DNA i polimeraza I, transkrybująca gen, kiedy dojdzie do tego kompleksu kończy transkrypcję. Białko PTRF – czynnik uwalniający polimerazę I i transkrypt. Wiąże się ono z polimerazą, powoduje, że polimeraza opuszcza transkrypt.