Podział metod chromatograficznych
Metody chromatograficzne klasyfikuje się według następujących kryteriów:
geometrii układu
rodzaju fazy stacjonarnej
rodzaju fazy ruchomej
Podział ze względu na rodzaj fazy ruchomej:
chromatografia gazowa- fazą ruchomą jest gaz
chromatografia cieczowa- fazą ruchomą jest ciecz
chromatografia nadkrytyczna- fazą ruchomą jest płyn w stanie nadkrytycznym
Podział ze względu na rodzaj fazy stacjonarnej:
chromatografia adsorpcyjna- fazą stacjonarną jest ciało stałe ( adsorbent)
chromatografia podziałowa- fazą stacjonarną jest ciecz naniesiona na nośnik
Podział ze względu na geometrię układu ( tylko w chromatografii cieczowej ):
chromatografia kolumnowa- faza stacjonarna znajduje się w rurce zwanej kolumną
chromatografia planarna- faza stacjonarna umieszczona jest na płaszczyźnie
Parametry retencyjne:
Czas retencji (tR) jest to czas przebywania substancji chromatografowanej w kolumnie, czyli czas od momentu jej zadozowania do kolumny do momentu zarejestrowania maksimum piku chromatograficznego odpowiadającego tej substancji. Nazywany jest także niepoprawionym lub całkowitym czasem retencji.
Czas retencji substancji nie zatrzymywanej lub czas martwy (tM) to czas przebywania w kolumnie substancji nieoddziałującej z wypełnieniem kolumny od momentu zadozowania tej substancji do momentu pojawienia się maksimum jej piku.
Zredukowany czas retencji (t’R) to czas związany z przebywaniem substancji w kolumnie tylko w wyniku oddziaływania tej substancji z wypełnieniem kolumny. t’R = tR - tM
Całkowita odległość retencji (lR) to odległość od miejsca odpowiadającego zadozowaniu substancji chromatografowanej do kolumny do maksimum jej piku.
Odpowiednio można oznaczyć także odległość retencji substancji nie zatrzymanej - lM i zredukowaną odległość retencji - l’R. l’R = lR – lM
Objętość retencji- W niektórych przypadkach korzystne jest posługiwanie się objętościami retencji. Otrzymuje się je mnożąc czas retencji przez objętościowe natężenie przepływu gazu nośnego w temperaturze kolumny (FC).
Całkowita objętość retencji: VR = tRFC
Objętość retencji substancji nie zatrzymanej: VM = tMFC
Zredukowana objętość retencji: V’R = VR - VM = t’RFC
Objętość retencji jest wielkością, która w odróżnieniu od czasu retencji nie zależy od liniowej prędkości przepływu fazy ruchomej.
Współczynnik retencji (k) jest inną miarą retencji. Jest to stosunek ilości substancji, wyrażonej w molach znajdującej się w fazie stacjonarnej do ilości substancji w fazie ruchomej.
Jak wyznaczyć czas retencji substancji nie zatrzymywanej na kolumnie:
Czas retencji substancji nie zatrzymywanej lub czas martwy (tM) to czas przebywania w kolumnie substancji nieoddziałującej z wypełnieniem kolumny od momentu zadozowania tej substancji do momentu pojawienia się maksimum jej piku.
Zredukowany czas retencji (t’R) to czas związany z przebywaniem substancji w kolumnie tylko w wyniku oddziaływania tej substancji z wypełnieniem kolumny
t’R = tR – tM tM= t’R-tR (zredukowany czas retencji – czas retencji)
Sprawność kolumny chromatograficznej mierzy się dla danej substancji liczbą półek teoretycznych N w kolumnie. Pod pojęciem półki teoretycznej należy rozumieć najmniejszą objętość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniem analitu w fazie ruchomej i stacjonarnej.
Wartość półek teoretycznych jest wyznaczona na podstawie poniższego wzoru przy założeniu, że pik pochodzący od substancji ma kształt krzywej Gaussa.
$N = 16{(\frac{t_{R}}{w})}^{2}$
N - liczba półek teoretycznych
tR - czas retencji
w - szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu)
Sprawność rozdzielania w kolumnie chromatograficznej zależy od:
- rozmiaru kolumny
- liczby półek
- rodzaju wypełnienia kolumny
- natężenia przepływu i rodzaju fazy ruchomej
- właściwości składników chromatografowanej mieszaniny
Wysokość równoważna półce teoretycznej WRPT to najmniejsza wysokość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniem substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i stacjonarnej.
WRPT = H = L/N
L – długość kolumny [mm]
N – liczba półek teoretycznych
Im wartość WRP jest mniejsza, tym kolumna ma więcej półek i jest sprawniejsza.
Parametry charakteryzujące zależność rozdzielczą kolumny:
Współczynnik rozdzielania: Dla dwóch sąsiednich pików na chromatogramie, dla których
t’R2 > t’R1 możemy określić współczynnik rozdzielenia - α - jest miarą rozdzielenia dwóch sąsiednich pików na chromatogramie.
$$\alpha = \frac{k_{2}}{k_{1}} = \frac{K_{2}}{K_{1}} = \frac{t_{R2} - t_{0}}{t_{R1} - t_{0}}$$
Współczynnik rozdzielenia ma zawsze wartość większą od 1.
Jeżeli α = 1, piki mają tę samą retencję i koeluują.
Podział ze względu na rodzaj fazy stacjonarnej:
chromatografia adsorpcyjna- fazą stacjonarną jest ciało stałe ( adsorbent)
chromatografia podziałowa- fazą stacjonarną jest ciecz naniesiona na nośnik
Detektory w chromatografii cieczowej:
W HPLC używane są przede wszystkim detektory spektrofotometryczne lub elektrochemiczne. Ich zasada działania polega na rejestrowaniu różnicy określonej właściwości samego eluentu i roztworu substancji chromatografowanej w tym eluencie.
Najbardziej rozpowszechnionym detektorem w chromatografii cieczowej kolumnowej są detektory działające na zasadzie absorpcji światła nadfioletowego (UV) lub nadfioletowego i widzialnego (UV-Vis).
Najprostsze monochromatyczne detektory UV umożliwiają wykrywanie chromatografowanych substancji przy jednej długości fali – 254nm. Jest to długość fali światła pochłanianego przez większość substancji organicznych (65%), a jednocześnie łatwa do uzyskania technicznie za pomocą lampy rtęciowej.
Obecnie powszechnie stosowane są detektory spektrofotometryczne, w których możliwa jest płynna regulacja długości fali światła w całym zakresie nadfioletu i jego części widzialnej (190-600nm). Taki detektor po zatrzymaniu przepływu fazy ruchomej umożliwia rejestrację widma absorpcji substancji znajdującej się w detektorze i ustalenie długości fali, przy której występuje maksimum absorbancji, co pozwala na wykrycie substancji z maksymalną czułością. Aby detektor UV dobrze działał użyty eluent nie powinien absorbować światła przy zastosowanej długości fali.
Detektor UV jest niewrażliwy na zmiany przepływu fazy ruchomej i na zmiany temperatury.
Elucje:
Elucja izokratyczna- Skład mieszaniny jest jednakowy przez cały czas chromatografowania próbki (stała siła elucyjna)
Elucja gradientowa- W czasie rozdzielania składników jednej próbki skład eluentu zmienia się, a jego siła elucyjna się zwiększa, dlatego że po kolei wymywamy wszystkie składniki.
Chromatografia w normalnym i odwróconym układzie faz:
Chromatografia w normalnym układzie faz-fazy stacjonarne (np. żel krzemionkowy) i mniej polarne fazy ruchome (np. heksan, izooktan, chloroform, chlorek metylenu)
Chromatografia w odwróconym układzie faz -Faza stacjonarna słabo polarna lub niepolarna i bardziej polarna faza ruchoma (np. tetrahydrofuran, acetonitryl, metanol, woda)
Analiza jakościowa i ilościowa w chromatografii cieczowej:
analiza jakościowa -na podstawie czasu retencji
analiza ilościowa- na podstawie pola powierzchni pod analizowanym pikiem chromatogramu analizowanego związku
Metody kalibracji:
Metoda krzywej kalibracyjnej
Metoda wzorca wewnętrznego
Metoda normalizacji –uproszczona, ze współczynnikami kalibarcyjnymi
Metoda dodatku wzorca
Zależność wysokości półki teoretycznej H od prędkości fazy ruchomej w chromatografii gazowej i cieczowej:
Kształt piku a izotermy podziału
Przyczyny rozmycia pików chromatograficznych
Charakterystyka wypełnień mikroporowatych