Diagnostyka molekularna sciaga

  1. DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA – HYBRYDYZACJA

GŁÓWNE KIERUNKI ANALIZY DNA:

-AMPLIFIKACJA DNA (AMPLIFIKACJA IN-VITRO, PCR)

-HYBRYDYZACJA MOLEKULARNA (SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT, DOT BLOT, DNA FINGERPRINTING)

HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH:

ZJAWISKO HYBRYDYZACJI UMOŻLIWIA TWORZENIE KOMPLEKSÓW RÓŻNYCH MOLEKUŁ ZWANYCH INACZEJ HYBRYDAMI:

STABILNOŚĆ WYŻEJ WYMIENIONYCH HYBRYDÓW JEST ZRÓŻNICOWANA:

RNA –RNA > DNA –RNA > DNA –DNA

  1. SONDY MOLEKULARNE

-W ANALITYCE MOLEKULARNEJ WYKORZYSTUJE SIĘ SONDY OLIGONUKLEOTYDOWE POCHODZENIA NATURALNEGO (KILKASET NUKLEOTYDÓW), KTÓRE MOŻNA OTRZYMAĆ PRZEZ OKREŚLONE ZABIEGI MOLEKULARNE NP. KLONOWANIE LUB SONDY SYNTETYZOWANE CHEMICZNIE (ZWYKLE O DŁUGOŚCI 10 – 50 NUKLEOTYDÓW)

-FRAGMENTY DNA O RÓŻNEJ DŁUGOŚCI OTRZYMANE DROGĄ:

- KLONOWANIA

-SYNTEZY CHEMICZNEJ

- NATURALNE LUB SYNTETYCZNE GENY I ICH FRAGMENTY

- CDNA

-SONDY ROZPOZNAJĄ SEKWENCJE MOGĄCE RÓŻNIĆ SIĘ ZALEDWIE JEDNYM LUB KILKOMA NUKLEOTYDAMI.

-SONDY TWORZĄ TRWAŁE WIĄZANIA TZW. HYBRYDY NA ZASADZIE KOMPLEMENTARNOŚCI.

-ZALETY SOND SYNTETYCZNYCH:

- STOSUNKOWO ŁATWA DOSTĘPNOŚĆ,

- MOŻLIWOŚĆ DOWOLNEGO PROGRAMOWANIA SEKWENCJI SOND,

- NIE MA POTRZEBY DENATURACJI, GDYŻ SONDA JEST JEDNONICIOWA,

- KRÓTKI CZAS HYBRYDYZACJI,

- WYSOKA SELEKTYWNOŚĆ.

-ZNAKOWANIE SOND MOLEKULARNYCH NAJCZĘŚCIEJ WYKONUJE SIĘ POPRZEZ WPROWADZENIE RADIOIZOTOPU 32P W MIEJSCE NIEPROMIENIOTWÓRCZYCH ATOMÓW FOSFORU

-MOŻNA TEGO DOKONAĆ POPRZEZ:

- PRZENIESIENIE Z UDZIAŁEM KINAZY POLINUKLEOTYDOWEJ RESZTY FOSFONOWEJ [Γ 32P] ZE ZNAKOWANEGO ATP NA KONIEC CZĄSTECZKI SONDY

LUB

- WBUDOWUJĄC W ŁAŃCUCH SONDY [Γ 32P] – DEOKSYFOSFONUKLEOZYDY W PROCESIE „NICK TRANSLATION” (UZUPEŁNIENIE PRZERW W DWUNICIOWEJ CZĄSTECZCE DNA, WYWOŁANYCH UPRZEDNIO PRZEZ ENDONUKLEAZĘ).

-W KORZYSTANIU Z TEGO TYPU SOND METODĄ WYKRYWANIA UTWORZONYCH STRUKTUR HYBRYDOWYCH JEST BEZPOŚREDNIA AUTORADIOGRAFIA.

-ZNAKOWANIE SOND MOLEKULARNYCH

-POWSZECHNIE STOSUJE SIĘ RÓWNIEŻ TECHNIKI NIEPROMIENIOTWÓRCZE W ZNAKOWANIU SOND MOLEKULARNYCH, POLEGAJĄCE NA DOŁĄCZANIU BIOTYNY LUB DIGOKSYGENINY. PRODUKTY HYBRYDYZACJI WYKRYWA SIĘ WÓWCZAS W PROCESACH DWUSTOPNIOWYCH:

ETAP I:

-UŻYCIE STREPTAWIDYNY WIĄŻĄCEJ SIĘ WYBIÓRCZO Z BIOTYNĄ LUB PRZECIWCIAŁ MONOKLONALNYCH SKIEROWANYCH PRZECIWKO BIOTYNIE CZY DIGOKSYGENINIE,

ETAP II:

-W/W ENZYMY W OBECNOŚCI ODPOWIEDNICH SUBSTRATÓW POWODUJĄ REAKCJE BARWNE LUB WYWOŁUJĄ ZJAWISKO CHEMILUMINESCENCJI.

  1. IZOLACJA MATERIAŁU GENETYCZNEGO KOMÓRKI

MATERIAŁ MUSI BYĆ WYSOKOCZĄSTECZKOWY, MIEĆ WYSOKI STOPIEŃ CZYSTOŚCI I NIE BYĆ POFRAGMENTOWANY.

ENZYMY RESTRYKCYJNE – ROZPOZNAJĄ PEWNE CHARAKTERYSTYCZNE SEKWENCJE NUKLEOTYDÓW DWUNICIOWEGO DNA I PRZECINAJĄ JE.

HYBRYDYZACJA:

1. KWAS NUKLEINOWY MUSI BYĆ JEDNONICIOWY.

2. CELEM HYBRYDYZACJI JEST WYKRYCIE FRAGMENTU, KTÓRY NAS INTERESUJE NP. Z MUTACJĄ. TRZEBA SPORZĄDZIĆ SONDĘ MOLEKULARNĄ.

SONDY – FRAGMENTY DNA O RÓŻNEJ DŁUGOŚCI OTRZYMANE DROGĄ:

- KLONOWANIA

-SYNTEZY CHEMICZNEJ

- NATURALNE LUB SYNTETYCZNE GENY I ICH FRAGMENTY

- CDNA

SONDY ROZPOZNAJĄ SEKWENCJE MOGĄCE RÓŻNIĆ SIĘ ZALEDWIE JEDNYM LUB KILKOMA NUKLEOTYDAMI.

SONDY TWORZĄ TRWAŁE WIĄZANIA TZW. HYBRYDY NA ZASADZIE KOMPLEMENTARNOŚCI.

ZNAKOWANIE SOND – NAJCZULSZA METODA: IZOTOPOWA NP. 35S, 35P.

DETEKCJĄ JEST AUTORADIOGRAFIA.

- METODY POŚREDNIE NP. BIOTYNA – POWINOWACTWO AWIDYNY, DIGOKSYGENINA

- METODY IMMUNOCHEMICZNE

METODY HYBRYDYZACJI:

- W ROZTWORACH – BADANIA NAD BUDOWĄ I STRUKTURĄ GENOMU

- NA NOŚNIKACH STAŁYCH NP. FOLIA NYLONOWA LUB NITROCELULOZOWA, DOT – BLOTTING, SOUTHERN – BLOTTING, NORTHERN – BLOTTING, DNA FINGERPRINTING

  1. SOUTHERN BLOTTING

-HYBRYDYZACJA MAJĄCA NA CELU IDENTYFIKACJĘ OKREŚLONEGO FRAGMENTU DNA,

-NAJCZĘŚCIEJ DOTYCZY HYBRYDYZACJI DNA – DNA,

ETAPY :

1. IZOLACJA I OCZYSZCZANIE DNA Z KOMÓREK LUB TKANEK.

2. TRAWIENIE DNA ODPOWIEDNIMI RESTRYKTAZAMI.
3. ROZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY FRAGMENTÓW DNA WEDŁUG WIELKOŚCI I ICH DENATURACJA IN SITU.

4. PRZENIESIENIE FRAGMENTÓW DNA Z ŻELU NA FILTR NITROCELULOZOWY LUB NYLONOWY.

5. ZWIĄZANIE DNA Z FILTREM: W TEMPERATURZE LUB POPRZEZ NAŚWIETLANIE UV.

6. HYBRYDYZACJA Z SONDĄ.

7. USTALENIE POŁOŻENIA FRAGMENTÓW , DO KTÓRYCH ZHYBRYDYZOWAŁA SONDA Z UŻYCIEM AUTORADIOGRAFII , REAKCJI BARWNYCH LUB FLUORESCENCJI.

HYBRYDYZACJĘ Z SONDĄ DZIELIMY NA TRZY ETAPY:

1. PREHYBRYDYZACJA:
- ELIMINACJA NIESPECYFICZNEGO TŁA POPRZEZ MOCZENIE FILTRU W ROZTWORZE, KTÓREGO SKŁADNIKI BLOKUJĄ MIEJSCA MOGĄCE ZWIĄZAĆ KWASY NUKLEINOWE NA FILTRZE,

- W CELU ZMINIMALIZOWANIA TŁA DODAJE SIĘ RÓWNIEŻ NIEHOMOLOGICZNE DNA NOŚNIKOWE.

2. WŁAŚCIWA HYBRYDYZACJA:

- WYZNAKOWANA SONDA WIĄŻE SIĘ Z UNIERUCHOMIONYMI NA FILTRZE KWASAMI NUKLEINOWYMI,

- WYSOKA HOMOLOGIA: TEMPERATURA (), MNIEJSZE STĘŻENIE SOLI, DODATEK FORMAMIDU,

- CZĘŚCIOWA HOMOLOGIA: TEMPERATURA () , WYŻSZE STĘŻENIE SOLI.

3. PŁUKANIE FILTRU:

- USUNIĘCIE NIEZHYBRYDYZOWANEJ SONDY – JEST TO WARUNEK SPECYFICZNEGO OBRAZU HYBRYDYZACJI.

HYBRYDYZACJA SOUTHERN UMOŻLIWIA:

- WYKRYCIE REARANŻACJI GENOWYCH (NP. DELECJE, INSERCJE) WIĘKSZYCH NIŻ 50 PZ,

- BADANIE POLIMORFIZMU DŁUGOŚCI FRAGMENTÓW RESTRYKCYJNYCH DNA – RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM).

POLIMORFIZM MOŻE MIEĆ CHARAKTER NATURALNY LUB MOŻE WYSTĄPIĆ W WYNIKU ZMIAN MUTACYJNYCH W DNA, KTÓRE POWODUJĄ ZANIKANIE BĄDŹ POJAWIANIE SIĘ MIEJSC RESTRYKCYJNYCH.

ANALIZA RFLP WYKORZYSTYWANA JEST M.IN. W BADANIACH DZIEDZICZNYCH UWARUNKOWAŃ CHORÓB JAK RÓWNIEŻ W WYKRYWANIU MUTACJI SOMATYCZNYCH W BADANYCH GENACH.

  1. NORTHERN BLOTTING

JEST TO METODA SŁUŻĄCA DETEKCJI KWASÓW RYBONUKLEINOWYCH (RNA).

NAJCZĘŚCIEJ STOSUJE SIĘ JĄ DO BADANIA AKTYWNOŚCI OKREŚLONYCH GENÓW (BADANIE EKSPRESJI GENÓW).

METODYKA ZBLIŻONA JEST DO HYBRYDYZACJI SOUTHERN:

- ROZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY RNA NA ŻELU W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH,

SONDA DAJE SYNGAŁ PROPORCJONALNY DO ILOŚCI RNA OBECNEGO NA MEMBRANIE, STĄD PO INTENSYWNOŚCI SYGNAŁU PO DETEKCJI MOŻNA ILOŚCIOWO OSZACOWAĆ POZIOM WYKRYTEGO RNA.

  1. HYBRYDYZACJA DOT BLOT

- METODA PÓŁILOŚCIOWA,

-NAJPROSTSZĄ METODA HYBRYDYZACJI. POLEGA NA UNIERUCHOMIENIU NA FILTRZE CAŁKOWITEGO WYIZOLOWANEGO Z KOMÓREK DNA LUB RNA I PODDANIU GO HYBRYDYZACJI Z SONDĄ MOLEKULARNĄ O OKREŚLONEJ SEKWENCJI. WYNIK OTRZYMYWANY JEST W POSTACI „PLAM” NA FILTRZE PODCZAS DETEKCJI. SYGNAŁ ŚWIADCZY O ROZPOZNANIU PRZEZ SONDĘ POSZUKIWANEJ SEKWENCJI NUKLEOTYDOWEJ.

METODA TA JEST RZADKO STOSOWANA W DIAGNOSTYCE ZE WZGLĘDU NA SWOJĄ NIEWYSTARCZAJĄCĄ CZUŁOŚĆ

-UMOŻLIWIA JEDNOCZESNE WYKRYWANIE I IDENTYFIKACJĘ WIELU PRÓBEK NA TYM SAMYM FILTRZE,

- POZWALA NA BEZPOŚREDNIE STOSOWANIE KOMÓREK HODOWANYCH IN VITRO LUB BAKTERII W MIEJSCE KWASÓW NUKLEINOWYCH,

- STOSOWANA DO WYKRYWANIA WIRUSÓW W DIAGNOSTYCE CHORÓB ZAKAŹNYCH ZWIERZĄT HODOWLANYCH.

-ETAPY:

- NA FOLIE SPUSZCZA SIĘ KROPLĘ DNA Z PIPETY

- UNIERUCHOMIENIE DNA (ZAPIEKA SIĘ W 80 ST C)

- DENATURACJA ALKALICZNA (ROZŁĄCZENIE NICI DNA)

- ZWINIĘCIE FOLII, UMIESZCZENIE W PROBÓWCE, ZALANIE ROZTWOREM SONDY I WŁOŻENIE DO PIECA HYBRYDYZACYJNEGO

- ODPŁUKIWANIE NIEZWIĄZANEJ SONDY

- DETEKCJA ZNACZNIKA – ZNACZNIK ZOSTAJE NA SONDZIE, KTÓRA ZHYBRYDYZOWAŁA

-TA METODA WYKRYWA JEDNĄ ZNANĄ MUTACJĘ.

  1. DNA FINGERPRINTING

-WYSTĘPOWANIE W EUKARIOTYCZNYM DNA SEKWENCJI POWTÓRZONYCH, CECHUJĄCYCH SIĘ DUŻĄ ZMIENNOŚCIĄ, NADAJE DNA POSZCZEGÓLNYCH OSOBNIKÓW CECHY INDYWIDUALNE.

-METODYKA:

- TRAWIENIE WYIZOLOWANEGO DNA ODPOWIEDNIMI ENZYMAMI RESTRYKCYJNYMI, KTÓRE TNĄ KWASY NUKLEINOWE W SPECYFICZNYCH MIEJSCACH,

- ROZDZIELENIE I SORTOWANIE POPRZEZ ROZDZIAŁ ELEKTROFORETECZNY POCIĘTE FRAGMENTY DNA,

- PRZENIESIENIE ROZDZIELONYCH FRAGMENTÓW DNA NA FILTR NITROCELULOZOWY I HYBRYDYZACJA Z WYZNAKOWANYMI SONDAMI,

- DETEKCJA.

W WYNIKU HYBRYDYZACJI VNTR Z SONDAMI MOLEKULARNYMI ROZPOZNAJACYMI JEDNOCZEŚNIE OD KILKUNASTU DO KILKUDZIESIĘCIU LOCI OTRZYMUJE SIĘ DLA KAŻDEGO OSOBNIKA CHARAKTERYSTYCZNY OBRAZ FRAGMENTÓW DNA TZW. DNA FINGERPRINT.

ZASTOSOWANIE:

- BADANIA MEDYCZNO – SĄDOWE,

- USTALANIE OJCOSTWA.

  1. REAKCJA ŁAŃCUCHOWEJ POLIMERAZY, PCR:

-UMOŻLIWIA SPECYFICZNĄ AMPLIFIKACJĘ (POWIELANIE) IN VITRO WYBRANYCH ODCINKÓW DNA I RNA (PRZEPISANYCH NA CDNA) DZIĘKI WYKORZYSTANIU DWÓCH STARTERÓW KOMPLEMENTARNYCH DO SEKWENCJI DOCELOWEJ

-STANOWI ODWZOROWANIE PROCESU REPLIKACJI DNA, PONIEWAŻ DOCHODZI DO SYNTEZY KOMPLEMENTARNEJ NICI DNA

-REAKCJA PCR SKŁADA SIĘ Z WIELOKROTNIE POWTARZANEGO CYKLU TRZECH ETAPÓW, KTÓRE ZACHODZĄ W ROŻNYCH TEMPERATURACH.

  1. DANATURACJA (94-95 ST. C) – ROZPLATANIE PODWÓJNEJ NICI DNA, PĘKAJĄ WIĄZANIA WODOROWE I PODWÓJNA HELISA DNA ROZDZIELA SIĘ NA DWA POJEDYNCZE ŁAŃCUCHY, CZAS OK. 30-60 S, TEMPERATURA DENATURACJI ZALEŻY OD SKŁADU ZASAD POWIELANEGO FRAGMENTU DNA (DUŻO GC=WYSOKA TEMP.), ORAZ ODPORNOŚCI POLIMERAZY NA WYSOKĄ TEMPERATURĘ (STANDARDOWO UŻYWANA POLIMERAZA TAQ)

  2. WIĄZANIE STARTERÓW, ANNEALING (40-65 ST. C) – PRZYŁĄCZANIE (HYBRYDYZACJA) STARTERÓW DO MATRYCY USTALANE DOŚWIADCZALNIE W ZALEŻNOŚCI OD SKŁADU NUKLEOTYDOWEGO STARTERÓW. ROZTWORY PRIMERÓW SĄ DODAWANE W DUŻYM NADMIARZE W STOSUNKU DO MATRYCY CZAS OK. 30-60 S NA ETAP TEN WPŁYW MA STĘŻENIE MATRYCY, STARTERA I TEMPERATURA (ZBYT WYSOKO=PRZYŁĄCZANIE PRIMERÓW NIEMOŻLIWE, ZBYT NISKA=NIESPECYFICZNE PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW)

  3. SYNTEZA NICI/ELONGACJA (72 ST. C) - NA TYM ETAPIE ZACHODZI WŁAŚCIWA SYNTEZA DNA I TYM SAMYM AMPLIFIKACJA POŻĄDANEGO GENU PRZEZ POLIMERAZĘ TAQ. OK. 30 S

    CZAS TRWANIA POLIMERYZACJI TO 20 SEKUND – DLA FRAGMENTÓW DO 500 PZ I 40 SEKUND DLA FRAGMENTÓW DO 1,2 KPZ; PROCES TEN KATALIZOWANY JEST PRZEZ POLIMERAZĘ DNA; SZYBKOŚĆ REAKCJI W OPTYMALNYCH WARUNKACH DLA POLIMERAZY TAQ WYNOSI OD 2000 NUKLEOTYDÓW/MIN; DLA CAŁKOWITEJ SYNTEZY BADANEGO FRAGMENTU CZAS TRWANIA TEGO ETAPU WYZNACZAMY ZAKŁADAJĄC POŁOWĘ OPTYMALNEJ PRĘDKOŚCI

-NASTĘPNIE CYKL POWTARZA SIĘ I W KOLEJNYM ETAPIE ANNEALINGU I ELONGACJI JAKO MATRYCA MOGĄ SŁUŻYĆ WSZYSTKIE ZSYNTETYZOWANE DOTYCHCZAS CZĄSTECZKI GENU. W TEN SPOSÓB REAKCJA, DOPÓKI SUBSTRATY I ENZYM SĄ W WYSTARCZAJĄCEJ ILOŚCI, ZACHODZI CORAZ SZYBCIEJ, POWODUJĄC CORAZ WIĘKSZY PRZYROST KOPII GENU NA ETAPIE ELONGACJI.

  1. SKŁAD MIESZANINY REAKCYJNEJ PCR:

    • MATRYCA (DNA, CDNA)

    • POLIMERAZA TAQ

    • BUFOR

    • WODA

    • JONY MG2+

    • STARTERY

    • NUKLEOTYDY (DNTP)

  1. CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA REAKCJĘ PCR

-TEMPERATURA I CZAS POSZCZEGÓLNYCH ETAPÓW, ILOŚĆ CYKLI,

-SKŁADNIKI MIESZANINY REAKCYJNEJ:

  1. STĘŻENIE POLIMERAZY DNA, JAKOŚĆ ENZYMU

  2. STĘŻENIE BUFORU REAKCYJNEGO

  3. STĘŻENIE DNTP

  4. STĘŻENIE JONÓW MG

  5. STĘŻENIA I JAKOŚĆ MATRYCY

-WYPOSAŻENIE NP. TYP TERMOCYKLERA, TYP PROBÓWKI REAKCYJNEJ

-PRIMERY – PARA SYNTETYCZNYCH OLIGONUKLEOTYDÓW SŁUŻĄCYCH JAKO STARTERY SYNTEZY DNA

-OBJĘTOŚĆ PRÓBKI REAKCYJNEJ

-WIELKOŚĆ I STRUKTURA AMPLIFIKOWANEGO PRODUKTU

  1. OGÓLNE ZASADY PRZYGOTOWANIA REAKCJI PCR

-ZACHOWYWANIE OSTROŻNOŚCI W STOSUNKU DO WSZELKIEGO RODZAJU ZANIECZYSZCZEŃ (BO REAKCJA PCR JEST BARDZO CZUŁA)

-WYDZIELENIE FIZYCZNEGO REJONU W LABORATORIUM PRZEZNACZONEGO TYLKO DO DOŚWIADCZEŃ Z PCR

-UŻYWANIE TYLKO OSOBISTYCH ZESTAWÓW ODCZYNNIKÓW I PIPET

-UŻYWANIE RĘKAWICZEK DO WSZYSTKICH OPERACJI ZWIĄZANYCH Z REAKCJĄ

-UŻYWANIE MATERIAŁÓW, BUTELEK I PROBÓWEK JEDNORAZOWEGO UŻYTKU

-UŻYWANIE ODDZIELNYCH ZESTAWÓW PIPET DO ODCZYNNIKÓW PROBÓWEK DNA

-Z POWODU NIEZWYKŁEJ CZUŁOŚCI PCR KONIECZNE JEST (SZCZEGÓLNIE W PROBÓWKACH DIAGNOSTYCZNYCH!!!) STAŁE KONTROLOWANIE WYKONYWANYCH EKSPERYMENTÓW

-STOSUJE SIĘ SPECJALNIE PRZYGOTOWANE PRÓBKI KONTROLNE KTÓRE W RUTYNOWYCH REAKCJACH PCR POWINNY BYĆ TAK ZAPROJEKTOWANE, ABY WYKRYWAĆ KONTAMINACJĘ NIEPOŻĄDANYCH FRAGMENTÓW -DNA LUB PRODUKTÓW PCR

-ŹRÓDŁA KONTAMINACJI (ZANIECZYSZCZEŃ) MOŻNA PODZIELIĆ NA DWA TYPY:

-ZACHODZĄCE PRZED REAKCJĄ PCR NP. W CZASIE DOSTARCZANIA PRÓBEK OD PACJENTÓW DO LABORATORIUM; NOSZĄ NAZWĘ PRE-PCR

-ZACHODZĄCE W WYNIKU CZYNNOŚCI LABORATORYJNYCH, ZACHODZĄCYCH PO REAKCJI PCR, CZYLI POST-PCR

  1. ANALIZA PRODUKTÓW PCR

-TECHNIKI ELEKTROFORETYCZNE WYKORZYSTUJĄ ZDOLNOŚĆ MIGRACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH W ŻELACH

-DNA I RNA MAJĄ SILNY ŁADUNEK UJEMNY, WOBEC CZEGO W POLU ELEKTRYCZNYM PRZEMIESZCZAJĄ SIĘ W KIERUNKU OD ANODY DO KATODY

-STOSOWANE W BADANIACH ŻELE STANOWIĄ WŁÓKNISTĄ SIEĆ, KTÓRA OGRANICZA SWOBODNĄ MIGRACJĘ

-SZYBKOŚĆ PRZEMIESZCZANIA SIĘ KWASÓW Z ŻELU ZALEŻY OD WIELKOŚCI I KSZTAŁTU CZĄSTECZEK, NAJSZYBCIEJ PORUSZAJĄ SIĘ CZĄSTECZKI MAŁE I NIEROZGAŁĘZIONE

-W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU ZASTOSOWANEGO ŻELU I JEGO STĘŻENIA ZMIENIA SIĘ ZAKRES RODZAJU CZĄSTEK, KTÓRE MOŻNA ROZDZIELIĆ

-ŻEL AGAROZOWY:

-METODA BARDZO SZYBKA

-SIŁA ROZDZIAŁU JEST STOSUNKOWO NISKA

-MOŻNA ROZDZIELIĆ CZĄSTECZKI O WIELKOŚCI 100-5000 PZ

-PRACA Z ŻELEM JEST PROSTSZA, ŻEL DŁUŻEJ POLIMERYZUJE I JEST STOSUNKOWO GRUBSZY

-ŻEL POLIAKRYLAMIDOWY

-METODA WYMAGAJĄCA DUŻO CZASU

-WYSOKA ROZDZIELCZOŚĆ

-MOŻNA ROZDZIELIĆ CZĄSTECZKI O WIELKOŚCI 5-1500 PZ

-ŻELE SĄ CIEŃSZE I SZYBCIEJ POLIMERYZUJĄ, PRACA JEST TRUDNIEJSZA

-POLIAKRYLAMID TO ZWIĄZEK NEUROTOKSYCZNY

  1. ZASTOSOWANIE PCR CZ. 1

GŁÓWNE ZASTOSOWANIA:

-KLONOWANIE

-HYBRYDYZACJA

-AMPLIFIKACJA- CZYLI UZYSKANIE ZWIĘKSZONEJ ILOŚCI FRAGMENTU DNA, W KTÓRYM WYSTĘPUJE MUTACJA LUB POLIMORFIZM, A NASTĘPNIE JEGO DALSZA ANALIZA

-SEKWENCJONOWANIE

-PRZYDATNA W DIAGNOSTYCE WIELU CHORÓB

-WYKORZYSTYWANA W CELU POTWIERDZENIA/WYKLUCZENIA OJCOSTWA

-ZNAJDUJE ZASTOSOWANIE W KRYMINALISTYCE

-IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJÓW CHOROBOTWÓRCZYCH I WIELU INNYCH

-RT-PCR - BADANIE EKSPRESJI GENÓW.

-PCR MULTIPLEKS - JEDNOCZESNA AMPLIFIKACJA KILKU REGIONÓW JEDNEGO LUB KILKU GENÓW.

-PCR-RFLP - WYKRYWANIE ZNANYCH MUTACJI/POLIMORFIZMÓW. ANALIZA BEZPOŚREDNIA – MUTACJE. ANALIZA POŚREDNIA – POLIMORFIZMY

-REAL TIME PCR - POMIAR LICZBY CZĄSTECZEK WIRUSÓW LUB BAKTERII W MATERIAŁACH KLINICZNYCH. UMOŻLIWIA MONITOROWANIE POSTĘPÓW LECZENIA (OKREŚLENIE WYJŚCIOWEGO POZIOMU WIREMII LUB BAKTERIEMII JEST WSKAZANIEM KONIECZNYM DO ROZPOCZĘCIA WŁAŚCIWEGO LECZENIA).

-NESTED PCR - SZYBKA DIAGNOSTYKA ZAKAŻEŃ WIRUSOWYCH.

-RAPD PCR - OKREŚLENIE ZMIENNOŚCI GENETYCZNEJ BEZ INFORMACJI O SEKWENCJI ANALIZOWANEGO DNA

-RACE-PCR - KLONOWANIE CDNA.

-ASA-PCR - WYKRYWANIE ZNANYCH MUTACJI.

-COMPETITIVE PCR - OCENA ILOŚCIOWA PRODUKTU.

  1. ZASTOSOWANIE PCR CZ. 2

  1. MATERIAŁ DO BADAŃ MOLEKULARNYCH PRZYKŁADY

  1. IZOLACJA DNA:

ETAPY:

W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU I POCHODZENIA MATERIAŁU WSTĘPNE PRZYGOTOWANIE MOŻE OBEJMOWAĆ OCZYSZCZENIE Z RÓŻNEGO RODZAJU ZANIECZYSZCZEŃ ZEWNĘTRZNYCH, POŻYWKI I POZOSTAŁOŚCI INNYCH KOMÓREK, A NASTĘPNIE ROZDROBNIENIE, HOMOGENIZACJĘ, PÓŹNIEJ ZAWIESZENIE JEDNOLITEJ MASY W ODPOWIEDNIM BUFORZE

LIZĘ KOMÓREK PROWADZI SIĘ W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU KOMÓREK I TKANEK NP. POPRZEZ: HOMOGENIZACJĘ (MIĘKKIE TK. ZWIERZĘCE), ROZCIERANIE (TK. ROŚLINNE, KOM. BAKTERYJNE), LIZĘ DETERGENTAMI (KOMÓRKI Z HODOWLI KOMÓRKOWYCH, KREW), LIZĘ ENZYMATYCZNĄ (KOMÓRKI BAKTERYJNE, DROŻDŻOWE, KREW). DESTRUKCJI BŁONY TOWARZYSZY UWOLNIENIE DNA I INNYCH KOMPONENTÓW KOMÓRKOWYCH DO ROZTWORU.

W TYM CELU STOSUJE SIĘ M.IN. SOLE (SDS), KTÓRE DEGRADUJĄ BIAŁKA (TAKŻE BIAŁKA HISTONOWE). WIĄŻE SIĘ ONA Z BIAŁKAMI I NADAJE IM SILNIE ANIONOWY CHARAKTER, A TAKŻE DZIAŁA JAKO CZYNNIK DENATURUJĄCY DEOKSYRYBONUKLEAZY I INNE BIAŁKA. ŁAGODNIE ALKALICZNE ŚRODOWISKO (PH=8,0) ZMNIEJSZA ODDZIAŁYWANIA ELEKTROSTATYCZNE POMIĘDZY DNA A ZASADOWYMI HISTONAMI I POLIKATIONOWYMI AMINAMI.

STANDARDOWE METODY IZOLACJI DNA:

OGÓLNA PROCEDURA IZOLACJI DNA

ETAPY IZOLACJI DNA

W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU, JAK I POCHODZENIA MATERIAŁU, WSTĘPNE PRZYGOTOWANIE MOŻE OBEJMOWAĆ OCZYSZCZENIE Z RÓŻNEGO RODZAJU ZANIECZYSZCZEŃ ZEWNĘTRZNYCH, POŻYWKI I POZOSTAŁOŚCI INNYCH KOMÓREK, ROZDROBNIENIE I HOMOGENIZACJĘ, A NASTĘPNIE ZAWIESZENIE JEDNOLITEJ MASY KOMÓRKOWEJ W ODPOWIEDNIM BUFORZE.

2. DEZINTEGRACJA I LIZA KOMÓREK

DEZINTEGRACJE KOMÓREK PROWADZI SIĘ W ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU KOMÓREK I TKANEK, NP. - POPRZEZ HOMOGENIZACJĘ (MIĘKKIE TKANKI ZWIERZĘCE),

- SONIFIKACJĘ (ZAWIESINY KOMÓREK),

- ROZCIERANIE (KOMÓRKI ROŚLINNE, BAKTERYJNE),

- LIZĘ DETERGENTAMI (KOMÓRKI Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ),

- LIZĘ ENZYMATYCZNĄ (KOMÓRKI BAKTERYJNE, DROŻDŻOWE).

DESTRUKCJI BŁON ZEWNĘTRZNYCH TOWARZYSZY UWOLNIENIE DNA ORAZ INNYCH KOMPONENTÓW WEWNĄTRZKOMÓRKOWYCH DO ROZTWORU.

3. INAKTYWACJA NUKLEAZ KOMÓRKOWYCH W CELU ZABEZPIECZENIE DNA PRZED ENZYMAMI NUKLEOLITYCZNYMI

UWALNIAJACY SIĘ Z KOMÓRKI KWAS NULKEINOWY NARAŻONY JEST NA DEGRADUJACE DZIAŁANIE NUKLEAZ – ENZYMÓW KATALIZUJACYCH HYDROLIZĘ 1- I 2-NICIOWYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH (ENDO -, EGZO -, DEOKSY -, RYBONUKLEAZY I IN.), PRZECINAJĄCYCH WIĄZANIA FOSFODIESTROWE. UNIECZYNNIENIE ICH PROWADZI SIĘ SILNYMI ENZYMAMI PROTEOLITYCZNYMI (NP. PROTEINAZĄ K).

4. ODDZIELENIE KWASU NUKLEINOWEGO OD POZOSTAŁYCH KOMPONENTÓW KOMÓRKOWYCH

CELEM ZNIESIENIA ODDZIAŁYWAŃ JONOWYCH POMIĘDZY NAŁADOWANYMI DODATNIO HISTONAMI I INNYMI BIAŁKAMI A UJEMNIE NAŁADOWANYM SZKIELETEM DNA STOSUJE SIĘ RÓŻNEGO RODZAJU DETERGENTY ORAZ SOLE, M.IN.: SÓL SODOWĄ SIARCZANU DODECYLU (SDS). WIĄŻE SIĘ ONA Z BIAŁKAMI I NADAJE IM SILNIE ANIONOWY CHARAKTER, A TAKŻE DZIAŁA JAKO CZYNNIK DENATURUJĄCY DEOKSYRYBONUKLEAZY I INNE BIAŁKA. ŁAGODNIE ALKALICZNE ŚRODOWISKO (PH=8,0) ZMNIEJSZA ODDZIAŁYWANIA ELEKTROSTATYCZNE POMIĘDZY DNA A ZASADOWYMI HISTONAMI I POLIKATIONOWYMI AMINAMI.

CAŁKOWITE ODBIAŁCZANIE ROZTWORU, PRZED WYTRĄCENIEM DNA, PRZEPROWADZA SIĘ POPRZEZ EKSTRAKCJE ROZPUSZCZALNIKAMI ORGANICZNYMI, NP. DZIAŁANIEM MIESZANINY:

- FENOLU (POWODUJE DENATURACJĘ BIAŁEK),

- CHLOROFORMU (POWODUJE POWIERZCHNIOWĄ DENATURACJĘ BIAŁEK I STABILIZUJE GRANICĘ FAZOWA, GDZIE KONCENTRUJE SIĘ BIAŁKO)

- ALKOHOLU IZOAMYLOWEGO (ZAPOBIEGA PAROWANIU CHLOROFORMU), A NASTĘPNIE ODWIROWANIE.

5. ZAGĘSZCZENIE PREPARATU DNA I USUNIĘCIE ZANIECZYSZCZEŃ MAŁOCZĄSTECZKOWYCH CELEM UZYSKANIE ROZTWORU DNA O POŻĄDANEJ CZYSTOŚCI I GĘSTOŚCI

PO EKSTRAKCJI KWASY NUKLEINOWE ZNAJDUJĄ SIĘ W FAZIE WODNEJ, ZANIECZYSZCZONEJ MAŁOCZĄSTECZKOWYMI ZWIĄZKAMI. DODAJĄC ROZPUSZCZALNIK ORGANICZNY (NP. ETANOL LUB IZOPROPANOL) ZMNIEJSZA SIĘ POLARNOŚĆ ŚRODOWISKA, CO POWODUJE ZMNIEJSZENIE ROZPUSZCZALNOŚCI DNA, POSIADAJĄCEGO STRUKTURĘ JONOWĄ I DNA TWORZY NITKOWATE OSADY, KTÓRE MOŻNA ZEBRAĆ PRZEZ ODWIROWANIE.

EFEKTYWNOŚĆ WYTRĄCANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH ZWIĘKSZA SIĘ POPRZEZ DODATEK SOLI (NP. NACL, CH₃COOH, LICL, MGCL, CH₃COONH₄).

  1. IZOLOWANIE DNA METODĄ EKSTRAKCJA FENOLOWEJ

PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU:

- TKANKĘ STAŁĄ ROZDROBNIĆ I HOMOGENIZOWAĆ W HOMOGENIZATORZE NOŻOWYM W TEMP. 0°C,

- KREW POBRANĄ NA ANTYKOAGULANT ODWIROWAĆ, USUNĄĆ SUPERNATANT, ZEBRAĆ WARSTWĘ INTERFAZOWĄ ZAWIERAJĄCĄ KRWINKI BIAŁE, PRZENIEŚĆ JĄ DO ŚWIEŻEJ PROBÓWKI I ZWIROWAĆ. PONOWNIE ZEBRAĆ WARSTWĘ INTERFAZOWĄ.

EKSTRAKCJA DNA:

1.DO PROBÓWKI ZAWIERAJĄCEJ ROZDROBNIONĄ TKANKĘ STAŁĄ LUB ZAWIESINĘ INTERFAZOWĄ DODAĆ BUFOR EKSTRAKCYJNY (EDTA, TRIS/HCL, SDS).

2.DODAĆ PROTEINAZĘ K I MIESZAĆ PRZEZ POWOLNE OBRACANIE PROBÓWKI A NASTĘPNIE INKUBOWAĆ W 55°C PRZEZ 12 GODZIN.

3.DODAĆ MIESZANINĘ FENOL/CHLOROFORM/ALKOHOL IZOAMYLOWY.

4.MIESZAĆ ŁAGODNIE ZAWARTOŚĆ PROBÓWKI DO CHWILI POWSTANIA EMULSJI A NASTĘPNIE ZWIROWAĆ.

- POLARNE GRUPY FOSFOROWE SZKIELETU CUKROWO-FOSFOROWEGO DNA PROMUJĄ UMIEJSCOWIENIE DNA W FAZIE WODNEJ,

- HYDROFOBOWE LIPIDY UMIEJSCAWIAJĄ SIĘ W FAZIE ORGANICZNEJ,

- BIAŁKA TWORZĄ INTERFAZĘ NA STYKU FAZ: ORGANICZNEJ I WODNEJ.

PRZENIEŚĆ FAZĘ WODNĄ DO CZYSTEJ PROBÓWKI.

6.DODAĆ ETANOL LUB IZOPROPANOL I UMIEŚCIĆ NA LODZIE NA 30 MIN.

7.ODWIROWAĆ I USUNĄĆ SUPERNATANT Z PROBÓWKI.

8.DODAĆ ROZTWÓR ETANOLU I MIESZAĆ PRZEZ ŁAGODNE OBRACANIE PROBÓWKI. ODWIROWAĆ.

9.USUNĄĆ SUPERNATANT Z PROBÓWKI I PRZEPŁUKAĆ DNA.

10.SUSZYĆ OSAD DNA.

11.ROZPUŚCIĆ OSAD DNA.

  1. IZOLOWANIE DNA Z PEŁNEJ KRWI Z UŻYCIEM NADCHLORANU SODOWEGO ZAMIAST FENOLU

1.DO KRWI POBRANEJ NA ANTYKOAGULANT DODAĆ BUFOR DO LIZY KOMÓREK (SACHAROZA, TRIS/HCL, MGCL₂, TRITON X-100) I INKUBOWAĆ W LODZIE PRZEZ 10 MIN. ODWIROWAĆ.

2.OTRZYMANY OSAD JADER KOMÓRKOWYCH ZAWIESIĆ W BUFORZE DO LIZY JĄDER (NACL, EDTA,TRIS/HCL).

3.DODAĆ ROZTWÓR RNAZY I INKUBOWAĆ W 37°C PRZEZ 30 MIN.

4.DODAĆ SDS I INKUBOWAĆ W 60 °C PRZEZ 10 MIN.

5.PO INKUBACJI DODAĆ NACLO₄ I DELIKATNIE ZAMIESZAĆ.

6.WPROWADZIĆ MIESZANINĘ CHLOROFORM/ALKOHOL IZOAMYLOWY I EKSTRAHOWAĆ DNA POD WYCIĄGIEM PRZEZ 30 MIN. ODWIROWAĆ.

7.PRZENIEŚĆ FAZĘ WODNĄ DO CZYSTEJ PROBÓWKI.

8.WYTRĄCIĆ DNA ALKOHOLEM ETYLOWYM I PRZEPŁUKAĆ DNA.

9.SUSZYĆ OSAD DNA.

10.ROZPUŚCIĆ OSAD DNA.

  1. AUTOMATYCZNA IZOLACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH

OBECNIE NA RYNKU DOSTĘPNE SĄ M.IN.:

  1. OBLICZANIE STĘŻENIA I STOPNIA CZYSTOŚCI DNA

- ADENINA POCHŁANIA PROMIENIE O DŁUGOŚCI 265,5 NM,

- GUANINA – 249 NM,

- TYMINA – 265 NM,

- CYTOZYNA – 276 NM.

C(ΜG/ML)= A260 X 50 X ROZCIEŃCZENIE (R)

1 OD (JEDNOSTKA OPTYCZNA) DLA DWUNICIOWEGO DNA=50

- WARTOŚĆ WSPÓŁCZYNNIKA A260/A280 MIĘDZY 1.7 - 2.0 OZNACZA, ŻE PREPARATY SĄ WYSTARCZAJĄCO OCZYSZCZONE,

- WARTOŚĆ RÓWNA 1.5 OZNACZA, ŻE W MIERZONYM PREPARACIE JEST 50% DNA I 50% BIAŁKA.

  1. OCENA JAKOŚCI DNA

- KRZEMIONKOWY

- DEKSTRANOWY

- AGAROWY

- SKROBIOWY

- AGAROZOWY

- POLIAKRYLAMIDOWY

- BROMEK ETYDYNY,

- ORANŻ AKRYDYNOWY,

- PIRONINA Y,

- JODEK PROPIDYNY.

  1. METODA PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (REAL TIME PCR, RT-PCR):

  1. BARWNIKI REAL TIME PCR

    1. NIESPECYFICZNE:

      1. BROMEK ETYDYNY, JODEK PROPIDYNY, CZY NAJBARDZIEJ POPULARNY: SYBR GREEK

      2. EMITUJĄ ONE ŚWIATŁO O OKREŚLONEJ DŁOGOŚCI PO ZWIĄZANIU SIĘ Z DWUNICIOWYM DNA, A AMPLIFIKACJA DOCELOWEJ SEKWENCJI ZACHODZI JEDYNIE DZIĘKI OBECNOŚCI SPECYFICZNYCH STARTERÓW FORWARD I REVERSE.

    2. SPECYFICZNE:

      1. SPECJALNIE ZAPROJEKTOWANE I ZSYNTETYZOWANE DLA DANEJ SEKWENCJI

      2. SONDY WYZNAKOWANE SĄ FLUORESCENCYJNIE

      3. PODCZAS REAKCJI DOCHODZI DO PRZENIESIENIA ENERGII ZAABSORBOWANEJ PRZEZ JEDEN FLUOROCHROM (REPORTER) NA DRUGI, KTÓRY EMITUJE ŚWIATŁO O INNEJ DŁUGOŚCI (NP. HYBPROBES) LUB DOCHODZI DO WYGASZENIA EMISJI FLUOROCHROMU PRZEZ ZWIĄZEK WYGASZAJĄCY (NP. TAQMAN)

  1. NESTED-PCR (PCR GNIAZDOWY)

STOSOWANE SĄ DWIE PARY STARTERÓW: ZEWNĘTRZNA (KOMPLEMENTARNA DO KOŃCÓW POSZUKIWANEJ SEKWENCJI) I WEWNĘTRZNA (PRZYŁĄCZA SIĘ PRZYŚRODKOWO W STOSUNKU DO PIERWSZEJ PARY STARTERÓW). PRODUKT POWSTAŁY PO AMPLIFIKACJI Z PIERWSZĄ PARĄ STARTERÓW PODDAJE SIĘ KOLEJNEJ AMPLIFIKACJI Z DRUGA PARĄ. ZAPEWNIA TO WIĘKSZĄ SPECYFICZNOŚĆ METODY. REAKCJA AMPLIFIKACJI ODBYWA SIĘ W DWÓCH ETAPACH:

  1. PIERWSZA AMPLIFIKACJA Z ZASTOSOWANIEM PIERWSZEJ PARY STARTERÓW (POŁOŻONYCH BARDZIEJ ZEWNĘTRZNIE)

  2. PRODUKTY POWSTAŁE W FAZIE PIERWSZEJ (PREEGZYSTUJĄCE PRODUKTY AMPLIFIKACJI), STAJĄ SIĘ NASTĘPNIE MATRYCĄ DLA WEWNĘTRZNEJ PARY PRIMERÓW (POŁOŻONEJ BARDZIEJ WEWNĘTRZNIE – INTERNAL PRIMERS).

W PRZYPADKU, GDY NIEMOŻLIWE JEST ZASTOSOWANIE DWÓCH RÓŻNYCH PAR STARTERÓW SPECYFICZNOŚĆ I WRAŻLIWOŚĆ REAKCJI MOŻNA SPRAWDZIĆ POPRZEZ PRZEPROWADZENIE TZN. SEMI-NESTED PCR. METODA TA POLEGA NA UŻYCI JEDNEGO PRIMERA WEWNĘTRZNEGO; WSPÓŁDZIAŁAJĄCEGO ZE STARTEREM CHARAKTERYSTYCZNYM DLA PIERWSZEGO ETAPU. ZWIĘKSZA TO WRAŻLIWOŚĆ METODY I JEDNOCZEŚNIE NIE OBNIŻA JEJ SPECYFICZNOŚĆI.

ZASTOSOWANIE: SZYBKA DIAGNOSTYKA ZAKAŻEŃ WIRUSOWYCH. KONTROLA SPECYFICZNOŚCI AMPLIFIKACJI MATRYCY. DUŻA CZUŁOŚĆ METODY WYKORZYSTYWANA JEST W MONITOROWANIU CHOROBY RESZTKOWEJ W DIAGNOSTYCE BIAŁACZEK (RT-PCR)

  1. PCR MULTIPLEKS

    METODA POLEGA NA JEDNOCZESNEJ AMPLIFIKACJI KILKU FRAGMENTÓW DNA, RÓŻNIĄCYCH SIĘ WIELKOŚCIĄ, CO W PRAKTYCE POLEGA NA UŻYCIU W JEDNEJ MIESZANINIE REAKCYJNEJ KILKU PAR STARTERÓW.

    ZASTOSOWANIE: JEDNOCZESNA AMPLIFIKACJA KILKU REGIONÓW JEDNEGO LUB KILKU GENÓW. W JEDNEJ REAKCJI UZYSKAĆ MOŻNA NAWET 13 AMPLIKONÓW. WYKRYWANIE DELECJI POWODUJĄCYCH WYSTĘPOWANIE CHORÓB DZIEDZICZNYCH ZWIĄZANYCH Z CHROMOSOMEM X (DMD, BMD). ANALIZA WYSTĘPOWANIA I ROZRÓŻNIANIA PATOGENÓW CHOROBOTWÓRCZYCH. CZĘSTO W DIAGNOSTYCE CHORÓB GENETYCZNYCH I NOWOTWORÓW „MULTIPLET PCR” JEST PIERWSZYM ETAPEM DALSZYCH BADAŃ, TAKICH JAK MULTIPLET HD CZY MULTIPLET SSCP.

  2. PCR-RFLP (ANG. RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM PCR)

POŁĄCZENIE REAKCJI PCR Z ANALIZĄ RESTRYKCYJNĄ. PRODUKTY AMPLIFIKACJI PODDAJE SIĘ DZIAŁANIU ENZYMU RESTRYKCYJNEGO I PORÓWNUJE WZÓR POWSTAŁYCH PRĄŻKÓW.

ZASTOSOWANIE: WYKRYWANIE ZNANYCH MUTACJI/POLIMORFIZMÓW. ANALIZA BEZPOŚREDNIA – MUTACJE. ANALIZA POŚREDNIA – POLIMORFIZMY

  1. RAPD-PCR (ANG. RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)

WYKORZYSTYWANA, GDY NIEZNANE SĄ SEKWENCJE SPECYFICZNE. STOSUJE SIĘ KRÓTKIE UNIWERSALNE STARTERY, KTÓRYMI AMPLIFIKUJE SIĘ ZBIÓR PRODUKTÓW, A ICH LICZBA I DŁUGOŚĆ SĄ ZALEŻNE OD SEKWENCJI NUKLEOTYDOWEJ MATRYCY ORAZ WARUNKÓW REAKCJI.

ZASTOSOWANIE: OKREŚLENIE ZMIENNOŚCI GENETYCZNEJ BEZ INFORMACJI O SEKWENCJI ANALIZOWANEGO DNA

  1. RACE-PCR (ANG. RAPID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS)

TECHNIKA UMOŻLIWIAJĄCA OTRZYMANIE PEŁNEJ DŁUGOŚCI SEKWENCJI GDY ZNANY JEST TYLKO FRAGMENT.

ZASTOSOWANIE: KLONOWANIE CDNA.

  1. ASA-PCR(ANG. ALLELE SPECIFIC AMPLIFICATION)

-TECHNIKA UMOŻLIWIAJĄCA WYKRYWANIE MUTACJI PRZY POMOCY SPECYFICZNYCH OLIGONUKLEOTYDÓW. OPRÓCZ STARTERÓW FLANKUJĄCYCH STOSUJE SIĘ STARTER W PEŁNI KOMPLEMENTARNY DO ALLELA Z MUTACJĄ LUB STARTERY, Z KÓRYCH JEDEN JEST W PEŁNI KOMPLEMENTARNY DO ALLELA Z MUTACJĄ A DRUGI DO ALLELA NIEZMUTOWANEGO. STARTERY SĄ TAK ZLOKALIZOWANE, ŻE W WYNIKU PCR POWSTAJĄ PRODUKTY RÓŻNIĄCE SIĘ DŁUGOŚCIĄ W ZALEŻNOŚCI OD GENOTYPU UŻYTEJ PRÓBKI DNA.

-AMPLIFIKACJA ALLELO-SPECYFICZNA JEST METODĄ WYKORZYSTYWANĄ DO WYKRYWANIA POLIMORFIZMU ALLELI ORAZ ISTNIENIA PUNKTOWYCH MUTACJI.

-PODSTAWĄ TEJ TECHNIKI JEST ZAŁOŻENIE, ŻE NIE KOMPLEMENTARNOŚĆ NUKLEOTYDÓW PRZY KOŃCU 3’ JEDNEGO LUB OBU STOSOWANYCH PRIMERÓW ZAPOBIEGA ELONGACJI KOŃCA 3’ STARTERA PRZEZ POLIMERAZĘ TAQ.

-WYDAJNA INICJACJA SYNTEZY DNA W TAKIM PCR JEST DETERMINOWANA PRZEZ SEKWENCJĘ OSTATNIEGO LUB DWÓCH OSTATNICH NUKLEOTYDÓW NA KOŃCU 3’.

-JEŚLI SĄ ONE KOMPLEMENTARNE DO MATRYCY, TO BADANE ALLELE SĄ WYDAJNIE AMPLIFIKOWANE, A PRZY BRAKU KOMPLEMENTARNOŚCI DLA INNYCH ALLELI, AMPLIFIKACJA ICH JEST ZAHAMOWANA.

-ZASTOSOWANIE: WYKRYWANIE ZNANYCH MUTACJI. WYKRYWANIE SPRZĘŻONYCH Z CHOROBĄ GENÓW NP. W NOWOTWORACH UKŁADU KRWIOTWÓRCZEGO:

-W DIAGNOSTYCE MASTOCYTOZY, AML ORAZ GIST (MUTACJE PUNKTOWE W GENIE C-KIT)

-W NOWOTWORACH MIELOPROLIFERACYJNYCH (MUTACJE W GENACH MPL ORAZ JAK2)

-BADANIA ZASAD POWSTAWANIA OPORNOŚCI PRZECIW CHEMIOTERAPEUTYKOM U MIKROORGANIZMÓW,

-BADANIA POWIĄZAŃ GENETYCZNYCH,

-WYJAŚNIENIA MECHANIZMU BADANEJ CHOROBY.

  1. COMPETITIVE-PCR (PCR KONKURUJĄCY)

W MIESZANINIE REAKCYJNEJ UMIESZCZA SIĘ DNA BADANE ORAZ DNA KONTROLNE O ZNANYM STĘŻENIU. W WYNIKU KONKUROWANIA O REAGENTY ILOŚĆ PRODUKTU DNA KONTROLNEGO BĘDZIE ODWROTNIE PROPORCJONALNA DO ILOŚCI DNA BADANEGO W PROBÓWCE.

ZASTOSOWANIE: OCENA ILOŚCIOWA PRODUKTU.

  1. SEKWENCJONOWANIE DNA

SEKWENCJONOWANIE DNA: TECHNIKA UMOŻLIWIAJĄCA USTALENIE SEKWENCJI (KOLEJNOŚCI ZASAD) W DNA, OBECNIE JEST TO ZLOTY STANDARD; NAJCZĘŚCIEJ SEKWENCJONOWANIE WYKONUJE SIĘ TECHNIKĄ SANGERA (DIDEOKSY)

METODA „DIDEOKSY” JEST ENZYMATYCZNĄ REAKCJĄ UŻYWANĄ W ODCZYTYWANIU SEKWENCJI NUKLEOTYDOWEJ DNA UPRZEDNIO SKLONOWANEGO. ISTOTĄ TEJ METODY JEST ZASTOSOWANIE POLIMERAZY DNA I TRIFOSFORANÓW DIDEOKSYRYBONUKLEOTYDÓW (DDNTP), KTÓRE NIE POSIADAJĄ GRUPY HYDROKSYLOWEJ W POZYCJI 3’RYBOZY, CO UNIEMOŻLIWIA PRZYŁĄCZENIE DO SYNTETYZOWANEGO ŁAŃCUCHA DNA NASTĘPNEGO NUKLEOTYDU. REPLIKACJI ENZYMATYCZNEJ ULEGA JEDNONICIOWE DNA (MATRYCA) DO KTÓREGO NA POCZĄTKU ŁĄCZY SIĘ STARTER A W KOŃCOWYM ETAPIE WBUDOWYWANY JEST JEDEN DDNTP (ZNAKOWANY RADIOIZOTOPEM LUB FLUOROCHROMEM).

UZYSKANE PRODUKTY MOŻNA UWIDOCZNIĆ NA KLISZY RENTGENOWSKIEJ PO AUTORADIOGRAFII ŻELU, BĄDŹ PRZY UŻYCIU AUTOMATYCZNEGO ODCZYTU SEKWENCJI DNA Z ZASTOSOWANIEM SEKWENATORÓW.

METODĄ DIDEOKSY MOŻNA SEKWENCJONOWAĆ FRAGMENTY DNA:

-KLONOWANE W WEKTORACH FAGOWYCH, KOSMIDOWYCH, PLAZMIDOWYCH

-PRODUKTY PCR

-BEZPOŚREDNIE SEKWENCJE GENOMOWEGO DNA

NGS (NEXT GENERATIONS SEQUENCING) – W POLSCE ANALIZY CAŁEGO GENOMU JESZCZE NIE PRZEPROWADZA, KOSZT 1,5 TYS $, CZAS 1 TYDZIEŃ, PROBLEMEM JEST TYLKO ODCZYT WYNIKÓW ZA WZGLĘDU NA OGROMNĄ ILOŚĆ POLIMORFIZMÓW W OBRĘBIE JEDNEGO GENU; NGS JEST TO SZYBKA, TANIA I WYDAJNA METODA, MAŁO PRECYZYJNA W PORÓWNANIU Z SANGEREM. ZASTOSOWANIE: SEKWENCJONOWANIE CAŁYCH GENÓW, SEKWENCJONOWANIE WYŁĄCZNIE EKSONÓW

  1. ETAPY SEKWENCJONOWANIA

    1. PCR PREPARATYWNY – NAMNOŻENIE WYBRANEGO FRAGMENTU GENU PRZY UŻYCIU PARY SPECYFICZNYCH STARTERÓW

    2. OCZYSZCZANIE PCR PREPARATYWNEGO – WYCIĘCIE PRĄŻKA Z ŻELU

    3. PCR SEKWENCYJNY/ASYMETRYCZNY – Z JEDNYM ZE STARTERÓW Z ZASTOSOWANIEM DIDEOKSYNUKLEOTYDÓW

    4. OCZYSZCZANIE PCR SEKWENCYJNEGO

    5. ROZDZIAŁ OTRZYMANYCH FRAGMENTÓW DNA – ELEKTROFOREZA KAPILARNA I ANALIZA WYNIKÓW

  2. SKŁAD MIESZANINY REAKCYJNEJ PCR SEKWENCYJNEGO

-OCZYSZCZONA MATRYCA PO PCR PREPARATYWNYM, NIE MOŻE BYĆ ZDEGRADOWANA, ANI ZANIECZYSZCZONE BIAŁKAMI, INHIBITORAMI ENZYMÓW

-JEDEN STARTER ZAPEWNIA SPECYFICZNOŚĆ REAKCJI; KOMPLEMENTARNY DO MATRYCY;

-MIESZANINA DNTP I DDNTP ZNAKOWANYCH FLUORESCENCYJNIE, W KOŃCOWYM ETAPIE REPLIKACJI WBUDOWYWANY JEST JEDEN DDNTP ZNAKOWANY RADIOIZOTOPEM LUB FLUOROCHROMEM

-POLIMERAZA GŁÓWNY ENZYM, PRZEPROWADZA REPLIKACJĘ

-BUFOR ZAPEWNIA ODPOWIEDNIE WARUNKI DO DZIAŁANIA POLIMERAZY (PH 8,3-8,8), JEST DOSTARCZANY PRZEZ PRODUCENTA DO POLIMERAZY

-H2O – ŚRODOWISKO REAKCJI

ZASTOSOWANIE SEKWENCJONOWANIA

-UMOŻLIWIA BEZPOŚREDNIE SZUKANIE MUTACJI:

-SUBSTYTUCJI

-MAŁYCH INSERCJI

-MAŁYCH DELECJI

-DOSTARCZA WIELU CENNYCH INFORMACJI O STRUKTURZE I FUNKCJI GENÓW

-ZNAJOMOŚĆ PEŁNEJ SEKWENCJI DNA BADANYCH ORGANIZMÓW UMOŻLIWIA ZROZUMIENIE MOLEKULARNYCH MECHANIZMÓW ICH FUNKCJONOWANIA I EWOLUCJI

  1. PIROSEKWENCJONOWANIE

-METODA SEKWENCJONOWANIA DNA W CZASIE RZECZYWISTYM. GŁÓWNĄ ZASADĄ METODY JEST WYKORZYSTANIE PIROFOSFORANU (PPI) UWALNIANEGO PODCZAS SYNTEZY DNA. W WYNIKU KASKADY REAKCJI ENZYMATYCZNYCH DOCHODZI DO EMISJI ŚWIATŁA, KTÓREGO INTENSYWNOŚĆ ZALEŻY OD ILOŚCI UWOLNIONEGO PIROFOSFORANU, A TYM SAMYM LICZBY WBUDOWANYCH NUKLEOTYDÓW.

-PCR PREPARATYWNY – JEDEN STARTER ZNAKOWANY BIOTYNĄ

-PCR SEKWENCYJNY ZACHODZI JUŻ W PIROSEKWENATORZE

-W METODZIE TEJ WYKORZYSTANO JEDNOCZEŚNIE DZIAŁANIE CZTERECH ENZYMÓW, SĄ TO:

-POLIMERAZA DNA UWALNIA PIROFOSFORAN (PPI) PODCZAS WSTAWIANIA KOLEJNYCH NUKLEOTYDÓW DO SYNTETYZOWANEJ NICI.

-SULFURYLAZA PRZEKSZTAŁCA UWOLNIONY PIROFOSFORAN W ATP Z WYKORZYSTANIEM ADENOZYNO-5’-FOSFOSIARCZANU (APS)

-LUCYFERAZA KATALIZUJE REAKCJĘ PRZEMIANY LUCYFERYNY (PRZY UDZIALE TLENU I ATP) DAJĄC OXYLUCYFERYNĘ, CO2, AMP, PPI I ŚWIATŁO, KTÓREGO NATĘŻENIE JEST REJESTROWANE

-APIRAZA ROZKŁADA DNTP DO DNDP, DNMP I FOSFORANU. W TEJ REAKCJI NIE MA SUBSTRATU ŻADNEGO INNEGO OPRÓCZ DNTP.

ZALETY:

-SZYBKOŚĆ

-WYDAJNOŚĆ

-POWTARZALNOŚĆ

WADY:

-WYSOKIE KOSZTY APARATURY

-WYSOKIE KOSZTY ODCZYNNIKÓW

-BRAK MOŻLIWOŚCI ANALIZY DŁUGICH SEKWENCJI GENOMOWYCH

WYKORZYSTANIE:

-GENOTYPOWANIE POWSTAŁYCH WCZEŚNIEJ POLIMORFIZMÓW (GŁÓWNIE SNP)

-OZNACZANIE PATOGENÓW

-WYKRYWANIE I CHARAKTERYZOWANIE MUTACJI

-OZNACZANIA METYZACJI MIEJSC CPG

-PRZESZUKIWANIE I CHARAKTERYZOWANIE BIBLIOTEK CDNA

  1. NGS (NEXT GENERATIONS SEGUENCING)

-SEKWENCJONOWANIE NOWEJ GENERACJI ZREWOLUCJONIZOWAŁO ANALIZĘ DNA

-NGS OPIERA SIĘ NA RESEKWENCJONOWANIU

-ODCZYTANE FRAGMENTY SEKWENCJI NUKLEOTYDÓW SKŁADA SIĘ W JEDNĄ CAŁOŚĆ I PORÓWNUJE SIĘ DO SEKWENCJI WZORCOWEJ

-W PIERWSZYM ETAPIE ANALIZOWANY DNA PODDAJE SIĘ FRAGMENTACJI A DO POWSTAŁYCH FRAGMENTÓW PRZYŁĄCZA SIĘ KRÓTKIE ZNAKOWANE ADAPTORY.

-ZMODYFIKOWANE FRAGMENTY DNA SĄ UNIERUCHOMIONE NA SPECYFICZNYM NOŚNIKU.

-KOLEJNYM ETAPEM JEST POWIELANIE DNA I WŁAŚCIWE SEKWENCJONOWANIE Z ZASTOSOWANIEM REAKCJI POLIMERAZY, PIROSEKWENCJONOWANIA LUB REAKCJI LIGAZY W ZALEŻNOŚCI OD WYBRANEJ PLATFORMY NSG

-METODA WYDAJNA, SZYBKA I RELATYWNIE TANIA W PORÓWNANIU Z SEKWENCJONOWANIEM SANGERA, NIESTETY MAŁO PRECYZYJNA!

-ZASADNICZO NGS W NAUCE I DIAGNOSTYCE ZNAJDUJE ZASTOSOWANIE DO:

-SEKWENCJONOWANIA CAŁYCH GENOMÓW

-SEKWENCJONOWANIA WYŁĄCZNIE EKSONÓW

  1. MLPA

-METODA MOLEKULARNA OPARTA NA LIGACJI I REAKCJI PCR

-BARDZO ELASTYCZNA TECHNIKA POZWALAJĄCA NA ANALIZĘ ZARÓWNO NA POZIOMIE MOLEKULARNYM JAK RÓWNIEŻ CYTOGENETYCZNYM

-MOŻLIWA JEST WZGLĘDNA ILOŚCIOWA OCENA RÓWNOCZEŚNIE 40-45 RÓŻNYCH SEKWENCJI NUKLEOTYDOWYCH W JEDNEJ REAKCJI

-UMOŻLIWIA WYKRYWANIE:

-DELECJI, DUPLIKACJI I AMPLIFIKACJI POJEDYNCZYCH EGZONÓW

-OCENĘ METYZACJI BADANYCH FRAGMENTÓW,

-BADANIE POZIOMU MRNA

-BADANIE ZMIAN POJEDYNCZYCH NUKLEOTYDÓW

-REAKCJA MLPA DZIELI SIĘ NA PIĘĆ GŁÓWNYCH ETAPÓW:

-DENATURACJA DNA I HYBRYDYZACJA SOND MLPA

-DENATURACJA GENOMOWEGO DNA (98 ºC)

-HYBRYDYZACJA MATRYCY Z SONDAMI (54 ºC) PRZEZ CAŁĄ NOC.

-ZASTOSOWANE SĄ SONDY POŁÓWKOWE HYBRYDYZUJĄCE DO KOMPLEMENTARNYCH BADANYCH -ODCINKÓW DNA ULEGAJĄCE LIGACJI I NASTĘPNIE SŁUŻACE JAKO JEDNA MATRYCA DLA POLIMERAZY -DNA

-REAKCJA LIGACJI - JEST MOŻLIWA DZIĘKI ZASTOSOWANIU ENZYMU LIGAZY

-REAKCJA PCR

-UŻYTE SĄ DWA STARTERY WSPÓLNE DLA WSZYSTKICH SOND STOSOWANYCH W JEDNEJ REAKCJI. -JEDEN ZE STARTERÓW JEST WYZNAKOWANY FLUORESCENCYJNIE

-ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAŁ PRODUKTÓW PCR I ANALIZA DANYCH

-ELEKTROFOREZA ZACHODZI W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH W SEKWENATORZE KAPILARNYM

-MLPA UMOŻLIWIA DIAGNOSTYKĘ:

-CHORÓB UWARUNKOWANYCH DELECJAMI LUB AMPLIFIKACJAMI FRAGMENTÓW GENÓW

-NOWOTWORÓW

-ZESPOŁÓW MIKRODELECYJNYCH

-ANEUPLOIDII

-ZMIAN W REJONACH SUBTELOMEROWYCH

  1. ZASTOSOWANIE BADAŃ MOLEKULARNYCH:

    • WYKRYWANIE MUTACJI ZWIĄZANYCH Z CHOROBAMI

    • MONITOROWANIE CHORÓB O PODŁOŻU GENETYCZNYM

    • ŚLEDZENIE SPOSOBU DZIEDZICZENIA MUTACJI GENETYCZNYCH W RODZINACH ORAZ USTALENIE NOSICIELSTWA CHORÓB GENETYCZNYCH

    • OKREŚLENIE EKSPRESJI GENÓW

    • IDENTYFIKACJA MUTACJI – OKREŚLENIE RODZAJU MUTACJI

    • W KRYMINALISTYCE DO IDENTYFIKACJI OSÓB, USTALENIA SPRAW PRZESTĘPSTW W OPARCIU O BADANIA SLADÓW BIOLOGICZNYCH

    • W DOCHODZENIU OJCOSTWA

  2. METODA DNA MICROARRAY (MIKROMACIERZE DNA, MIKROSIATKI DNA, MIKROMODUŁY DNA, MIKROPROCESORY DNA, CHIPY DNA)

PÓŁILOŚCIOWA METODA WYKRYWANIA

ORAZ PORÓWNANIA GENÓW NP. W CELU BADANIA ICH EWOLUCJI.

PRZY UŻYCIU ZESTAWU KILKISET LUB KILKU TYS. SOND OLIGONUKLEOTYDOWYCH, KTÓRE UMIESZCZONE SĄ W POSTACI PLAMEK NA JEDNAJ PŁYTCE O WIELKOŚCI MIKROSKOPOWEGO SZKIEŁKA NAKRYWKOWEGO TWORZĄC TZW. CHIPY GENOWE

DNA MICROARRAY – PŁYTKA SZKLANA LUB PLASTIKOWA Z NANIESIONYM W REGULARNYCH POZYCJACH MIKROSKOPOWEJ WIELKOŚCI POLAMI (ANG. SPOTS) ZAWIERAJĄCYM FRAGMENTY DNA RÓŻNIĄCE SIĘ OD SIEBIE SEKWENCJĄ NUKLEOTYDÓW. FRAGMENTY TE SĄ SONDAMI, KTÓRE WYKRYWAJĄ POPRZEZ HYBRYDYZACJĘ KOMPLEMENTARNE DO SIEBIE CZĄSTECZKI DNA LUB RNA. BARDZO CZUŁA METODA I MUSI BYĆ ZACHOWANA CZYSTOŚĆ. W TEJ TECHNICE SOND SIĘ NIE ZNAKUJE NP. MATERIAŁ BADANY FLUOROCHROMAMI

RODZAJE MACIERZY:

  1. ETAPY METODY MICROARRAY

1. SYNTEZA JEDNONICIOWYCH SOND DNA W MILIONACH KOPII KAŻDA UMIESZCZENIE W POSTACI PLAMEK NA JEDNAJ PŁYTCE I PRZYMOCOWANIE CHEMICZNE LUB ELEKTRYCZNE DO PODŁOŻA. WSZYSTKIE KOPIE UNIKALNEJ SONDY ZGROMADZONE SĄ W JEDNAJ PLAMCE O POWIERZCHNI OK. 90X90ΜM. PLAMKI UŁOŻONE SĄ W SIATCE , A ICH POZYCJE ODZNACZONE SĄ W OBU SIACH PŁYTKI

2. PRZYGOTOWANIE BADANEGO (JEDNONICIOWEGO) DNA LUB CDNA (PRZEPISANE Z MRNA) WYIZOLOWANEGO Z KOMÓRKI NP. NOWOTWORU

3. WYZNAKOWANIE FLUOROCHROMEM (NP. CY 3,CY 5) BADANEGO MATERIAŁU

4. WPROWADZENIE BADANEGO MATERIAŁU DO PLAMEK Z POSZCZEGÓLNYMI SONDAMI. DNA LUB CDNA JEST WIĄZANY DO SOND NA ZASADZIE KOMPLEMENTARNOŚCI ZASAD (HYBRYDYZACJA)

5. NIEZWIĄZANY LUB SŁABO ZWIĄZANY DNA LUB CDNA JEST USUWANY NA ETAPIE ODPŁUKIWANIA.

DETEKCJA

ANALIZA

MOŻE BYĆ WYKONYWANE DLA KAŻDEJ GRUPY SOND OSOBNO LUB ZA POMOCĄ GLOBALNEGO MODELU DLA CAŁEGO DOŚWIADCZENIA.

UMOŻLIWIA

OBAWY GENECHIP

  1. MUTACJE DNA

- MUTACJE SPONTANICZNE POWSTAŁE W TRAKCIE REPLIKACJI (POLIMERAZA DNA SYNTETYZUJE NOWĄ NIĆ Z PRĘDKOŚCIĄ OK. 1000 WIĄZAŃ NA SEKUNDĘ, KOREKTA BŁĘDÓW NASTĘPUJE DZIĘKI AKTYWNOŚCI EGZONUKLEAZOWEJ W KIERUNKU 3’→5’).

  1. MUTAGENY

- NIEKTÓRE DZIAŁAJĄ JAKO ANALOGI ZASAD I SĄ MYLNIE WYKORZYSTYWANE JAKO SUBSTRATY PODCZAS SYNTEZY NOWEGO DNA PODCZAS REPLIKACJI

- NIEKTÓRE REAGUJĄ BEZPOŚREDNIO Z DNA WYWOŁUJĄC ZMIANY STRUKTURALNE, KTÓRE PROWADZĄ DO BŁĘDNEGO KOPIOWANIA NICI MATRYCOWEJ PODCZAS REPLIKACJI DNA.

- NIEKTÓRE MUTAGENY DZIAŁAJĄ NA DNA POŚREDNIO. NIE WPŁYWAJĄ SAME NA STRUKTURĘ DNA, LECZ ZAMIAST TEGO POWODUJĄ WYTWARZANIE W KOMÓRCE ZWIĄZKÓW CHEMICZNYCH TAKICH JAK NADTLENKI, KTÓRE MAJĄ BEZPOŚREDNIE DZIAŁANIE MUTAGENNE.

- PROMIENIOWANIE NADFIOLETOWE (UV) INDUKUJE DIMERYZACJĘ SĄSIADUJĄCYCH ZE SOBĄ ZASAD. DIMERYZACJA WYWOŁANA PRZEZ UV Z REGUŁY POWODUJE DELECJĘ PODCZAS KOPIOWANIA ZMODYFIKOWANEJ NICI

- PROMIENIOWANIE JONIZUJĄCE WYWIERA RÓŻNY WPŁYW NA DNA ZALEŻNIE OD RODZAJU I NATĘŻENIA. MOGĄ WYSTĄPIĆ MUTACJE PUNKTOWE, DELECJE, INSERCJE. NIEKTÓRE RODZAJE PROMIENIOWANIA JONIZUJĄCEGO DZIAŁAJĄ BEZPOŚREDNIO NA DNA INNE MAJĄ POŚREDNI WPŁYW POPRZE STYMULACJĘ POWSTAWANIA W KOMÓRCE AKTYWNYCH CZĄSTECZEK TAKICH JAK NADTLENKI.

  1. SKUTKI MUTACJI

- MUTACJE SYNONIMICZNA GDY NOWY KODON KODUJE TEN SAM AMINOKWAS CO KODON NIEZMUTOWANY

- MUTACJA NIESYNONIMICZNA (MUTACJA ZMIANY SENSU) – MUTACJA POWODUJE, ŻE ZMUTOWANY KODON KODUJE INNY AMINOKWAS NIŻ KODON NIE ZMUTOWANY. JAKI MOŻE TO MIEĆ WPŁYW NA BIAŁKO?

- MUTACJE NONSENS – MUTACJA POWODUJE POWSTANIE KODONU STOP (UAA, UAG, UGA). WPŁYW NA BIAŁKO?

- MUTACJE ZMIENIAJĄCE KODON STOP NA KODON ODPOWIADAJĄCY ZA SYNTEZĘ DANEGO AMINOKWASU

SKUTKI MUTACJI


Wyszukiwarka