1 Metody hodowli zarodków bydlęcych

Do dnia dzisiejszego nie znaleziono idealnego płynu do hodowli zarodków, wszystkie płyny są modyfikacją płynów. Wszystkie płyny są modyfikacją płynów przeznaczonych do hodowli kom. Som. Od lat uniwersalnym płynem do hodowli, wypłukiwania i konserwacji 2,8 dniowych zarodków jest PBS – płyn fizjologiczny Dulbeco. Stosowany jest do hodowli zarodków z dodatkiem surowicy płodowej lub wołowej – ilość 20%. Surowicę tę dodaje się do PBS – bezpośrednio przed użyciem . Do PBS dodaje się też : streptomycynę. penicylinę, zw.p-grzybiczy, glukozę, pirogronian sodu. Inne pożywki o bardzie skomplikowanym składzie HAMS- F10 lub Menezo B2. Najlepsze warunki do rozwoju wczesnych zarodków stwarza pożywka opracowana na bazie środowiska jajowodu owcy – SOF. Dodatni wpływ na rozwój zarodka mają : kom. Trofoblastu 13 -14 dniowych zarodków, kom.fibroblastu z macicy, kom. Nabłonka jajowodu, kom. Granulozy pęcherzyków jajnikowych, kom. Wątrobowe. Eksperymentalnie zarodki są przenoszone do jajowodów królicy lub owcy gdzie rozwijają się przez kilka dni.

2 Opisz sposób konserwacji zarodków przez WITRYFIKACJĘ

Witryfikacja to metoda szybkiego zamarzania. Polega na wywołaniu jednorodnego szklistego stanu ( bez kryształków lodu) substancji o wysokiej lepkości. Stan nitryfikacji można uzyskać przez ultra szybkie ochłodzenie lub przez dodanie środków osłaniających w wysokich stężeniach do pożywek zawierających zarodki. Praktycznie używa się kombinacji tych 2 metod.

3 Różnice w inseminacji klaczy nasieniem świeżym i mrożonym.

MROŻONE – konfekcjonowane w słomkach 0,25 ml w ciekłym azocie , dawka ins. 8 słom.,do ciepłej wody, osuszyć, przelać do strzykawki i podłączyć strzykawkę do pipety inseminacyjnej, dodać rozrzedzalnik do nasienia, zwykle do objętości 15 cm. Gdy mniej niż 300 ml w 1 ml nie unasieniać. Unasieniać od 6 h przed owulacją do 6h po owulacji.

CHŁODZONE – najczęstsza met. Przechowywane w temp 4 C, do 72 h od pobrania nasienia, nasienie transportować w lodówce, d inseminacyjna 20 cm, 300-500 mln plemników w dawce. Niższe koszty zabiegu, wyższe efekty niż nasieniem mrożonym, obj. Mn 10 mln

ŚWIEŻE – na 1 ogiera 3 klacze, dawkę nasienia rozdziela się na 3, bez żadnych dodatków, 200 mln w dawce. Unasieniamy od 72 h przed owulacją do 6 h po. Dawka kilka, kilkanaście ml.

3 Przygotowanie dawczyń i biorczyń do transformacji zarodków

DAWCZYNIE - wybór dawczyń uwzględniamy cechy kliniczne i fizyczne: krowa zdrowa, regularne cykle, po pierwszym wycieleniu, inseminowana przedtem tylko 2 razy, brak ciężkich porodów i powikłań, wiek 3 – 10 lat, szczepienia zgodne z wymogami. Dawczynię przygotować do pozyskania zarodków poprzez superowulację. Dochodzi do rui i owulacji kilkunastu pęcherzyków , taką krowę inseminujemy dobrym buhajem. Zarodki uzyskujemy w 6-8 dniach po inseminacji, bo 6 dniowe zarodki są w jajowodzie, po 6 dniu w macicy, a w 8 traci osłonkę przejrzystą, która chroni go przed czynnikami zewnętrznymi. Uspokoić krowę ksylazyną 1, 1,5 ml/zwierzę, znieczulenie nadoponowe polokaina 2 % w ilości 6-8 ml/ zwierzę

BIORCZYNIE – wykonuje się synchronizację rui ( w tym samym dniu co dawczynie 12-tym) PGF 2alfa 12 -18 h przed dawczynią zarodków, ruja biorczyń następuje po 1,5 – 2,5 dnia. Czynności wstępne polegają na umieszczeniu w poskromie krowy biorczyni, usunięciu z prostnicy kału oraz zbadaniu jajników m. In na obecność ciałek żółtych. Znieczulenie nadoponowe, mycie sromu i krocza.

4 Metody pozyskiwania zarodków na przykładzie bydła

Dawczynię przygotować poprzez superowulację. Mamy ruję i owulację kilkunastu pęcherzyków i taką krowę inseminujemu dobrym buhajem. Zarodki uzyskujemy w 6-8 dniu.

Pozyskiwanie zarodków przebiega podobnie do kateteryzacji. Uspokajamy krowę. Do pozyskiwania służy katater Foleya – z 2 kanałami, wiotki i jeden koniec z uszczelnieniem. Wprowdzamy do 2/3 dł. Rogu macicy bo tam najwięcej zarodków, uszczelniamy po wyjęciu mandrynu i płuczemy. Do pozyskania używa się Roz. PBSu, na końcu katetera jest kilka otworów, wlewamy 40 ml PBSu , a następnie odzyskujemy płyn i oddajemy do laboratorium. Następnie ponownie wprowadzamy 20 ml płynu i potarzamy ten proces do chwili wprowadzenia ok. 500 – 800 ml. Już 60-80 ml wprowadzonego płynu daje nam możliwość pozyskania zarodków. Na 10 ciałek żółtych uzyskamy ok. 8zarodków, nigdy nie uzyskamy wszystkich, więc po uzyskaniu tych 8 płuczemy 2 róg.

Innym kateterem pozyskujemy zarodki poprzez ciągłe wypompowywanie płynu jednym kanałem, a drugim spływa on ciągle do naczynia., osadza się w ciągu 20 min., po czym odrzuca się supernatant. Zarodki można odzielać za pomocą siatki nylonowej o średnicy oczek 120um.

5 Superowulacja u bydła

Nie zwiększa liczby pęcherzyków na jajnikach, a stwarza dogodne warunki dla kontynuowania rozwoju pewnej liczby pęcherzyków która w normalnych warunkach cyklu uległaby atrezji.

Najbardziej optymalnym terminem do podania hormonów gonadotropowych jest połowa cyklu rujowego. Ro poczęcie stymulacji 9-10 dnia cyklu w fazie ciałka żółtego, więc podajemy też PGF2 alfa z reguły na 2 dzień od kiedy zaczęliśmy podawać FSH. Jest podstawową i niezbędną częścią w pozyskiwaniu zarodków.

METODY :

- Podawanie pojedynczej iniekcji PMSG 2500 j.m jest wystarczające do pobudzenia dodatkowego wzrostu pęcherzyków i owulacji na jajnikach, 14 dnia podaje się neutralne PMSG i.v , a 12 dnia PGF2alfa. PMSG ma długi okres póltrwania oraz powstają duże nie owulujące pęcherzyki. Aby temu zapobiec w dniu wystąpienia rui stosuje się przeciwciała anty- PMSG w formie iniekcji.

- Iniekcje HMG – b. drogi, raczej się nie stos.

- Podawanie FSH przez kolejne 4 dni w dawce malejącej. W celu synchronizacji rui # dnia należy podać PGF2 alfa. Pojedyńcze iniekcje FSH nie są stosowane, choć duże dawki mogą wywołać super owulację

- progestageny w formie implantów, superowulacja 6 – 7 dzień po wyjęciu implantu, implant usuwa się po ok. 60 h.

- iniekcje syntetycznej somatotropiny rBST w połączeniu z FSH daje dobre efakty

- szczepionka przeciwko inhibinie zwiększajaca sekrecję FSH – na razie badania

6 Rola prostaglandyn w rozrodzie zwierząt

- synchronizacja rui u bydła

- przy przetrwałym c. ż

- przy mumifikacji płodu

- indukcja porodu

- torbielowatość jajników

7 Przebieg transplantacji zarodków

METODY CHIRURGICZNE :

1. Laparotomia w linii białej i zdeponowanie zarodków do rogu macicy po stronie ciałka żółtego .Ścianę rogu macicy przebija się tępą igłą w niewielkiej odległości od ujścia jajowodowo – macicznego. Przez tak wykonany otwór wprowadza się kaniulę zawierającą zarodek w 20um pożywki. Przed zdeponowaniem zarodka należy się upewnić czy kaniula jest w świetle macicy.

2. Laparotomia w dole głodowym. Cięcie powłok brzusznych wykonuje się po stronie ciałka żółtego, którego obecność należy sprawdzić Bad. Rektalnym przed rozp. Zabiegu. Zabieg wykonuje się na zwierzęciu stojącym, w poskromie, po zastosowaniu znieczulenia nadoponowego lub miejscowego. Pionowe cięcie skóry – 0 – 15 cm, przeprowadza się w dole w kierunku dogłowowym i poniżej guza biodrowego. Po przecięciu skóry mięśnie zostają rozdzielone na tepo, otrzewna przebita palcem. Po wprowadzeniu dłoni do jamy brzusznej i umiejscowieniu rogu macicznego zarodek deponuje się w sposób tak jak wyżej.

METODY NIE CHIRURGICZNE

Stosuje się pistolet Cassou używany powszechnie do inseminacji. Zarodek aspirowany jest do słomki inseminacyjnej 0, 25 ml w małej objętości pożywki i odzielony jest wewnątrz z obydwu stron pęcherzykami powietrza. Słomkę wprowadza się do pistoletu, po przygotowaniu biorczyni pistolet do szyjki macicznej, a następnie do rogu macicy możliwie na jak dalszą głębokość, gdzie deponuje się zarodek. Miejsce zdeponowania zarodka szybkość wykonania zabiegu mają decydujący wpływ na skuteczność zacieleń.

8 Właściwości kom. Jajowej krowy

- Wydalana z jajnika w czacie owulacji w stadium metafazy II

- Otoczona osłonką przejrzystą ( kom. Wieńca promienistego ulegają szybko zanikowi po owulacji)

- po owulacji zdolnośc do zapł 18- 20 h

- przesuwana przez rzęski jajowodu

- osłonka przejrzysta kom. Jajowej - bezkomórkowa otoczka, po zapłodnieniu pozostaje na zarodku do stadium blastocysty, jest wytworem oocytu. Osłonka w mikroskopie skaningowym – gąbczasta struktura złożona z kompleksu włóknistych nitek z licznymi porami między nimi w kształcie kraterów ( wielkość ich i zagęszczenie ulega zmianie wraz z rozwojem oocytu i zarodka). Skład osłonki : glukoza, galaktoza, fruktoza, kw. Sjalowy, białka glikoproteiny ZP1, ZP2, ZP3 , ZP2 I ZP3 w czasie zap. Receptory dla plemników, zmiany w strukturze ZP 2 – stwardnienie osłonki i przeciwdziałanie polispermii

9 Techniki i cele klonowania zarodków i dorosłych zwierząt

Klonowanie zwierząt polega na otrzymaniu identycznych genetycznie osobników wywodzących się z jednego zarodka. Dawca klonu może być cały zarodek lub pojedyńczy blastomer zarodka. Dotychczas udaje się pozyskać potomstwo z jądra 32 blasomerowego. Starsze zarodki są już zróżnicowane na węzeł zarodkowy i trofoblast. Jako dawcy jąder mogą służyć tylko komórki węzła. Etapu klonowania: 1 . izolacja jądra z kom. Dawcy, 2. Uzyskanie oocytu biorcy, 3. Przeszczepienie jędra do oocytu biorcy , 4. Aktywacja oocytu

Dzięki pobraniu jądra z zarodka myszy i wprowadzeniu go do jaja myszy, które zostało wcześniej uaktywnione przez zapładniający plemnik. Technika tego zabiegu polegała na wstrzyknięciu do ooplazmy jądra diploidalnego kom. Zarodkowej oraz na usunięciu tą samą pipetą haploidalnych przedjądrzy. Po transplantacji w ten sposób potraktowanych jaj i po transplantacji ich do biorczyń otrzymano myszy które były identyczne. Był to pierwszy przypadek rozklinowania organizmu ssaka.

10 Zapłodnienie wspomagane

- Zapłodnienie In vitro polega na ułatwieniu pokonania bariery jaką stanowi dla plemników osłonka przejrzysta, częściowe nadtrawienie osłonki enzymami

- przerwanie ciągłości osłonki, nakłucie lub nawiercenie, plemniki muszą być po kapacytacji, reakcji akrosomalnej

- wstrzyknięcie plemnika pod słonkę przejrzystą . Sub Zonal Injection SUZI

- Wstrzyknięcie plemnika do cytoplazmy oocytu. IntraCytoplasmic Sperm Injection ICSI - ta metoda ma przyszłość dla osobników wybitnych z zaburzeniami rozrodu i gat. Na wymarciu. Każdy rodzaj plemników może być użyty

SUZI – wstrzyknięcie jednego lub kilku plemników pod osłonkę przejrzystą - metoda nadaje się do wykorzystania plemników o małej ruchliwości lub nawet nieruchomych - plemniki powinny być wcześnie kapa cytowane i wykazywać reakcję akrosomalną

ICSI – wstrzyknięcie plemnika do cytoplazmy oocytu – tutaj może być użyty każdy rodzaj plemnika – główki, nieruchome, martwe, morfologiczne zmienione , nie jest konieczna ani kapacytacja ani reakcja akrosomalna.

11 Metody konserwacji nasienia

KONSERWACJA NASIENIA: nasienie można konserwować w stanie płynnym lub mrożonym. Na co dzień sztuczne unasiennianie wykonuje się nasieniem świeżym- nie traci właściwości jeżeli zdeponujemy je w ciągu 10 min do dróg rodnych. Każda manipulacja z nasieniem osłabia jego płodność.

KONSERWACJA NASIENIA W STANIE PŁYNNYM –zmieszanie nasienia z rozrzedzalnikiem przedłużającym jego żywotność i obniżeniu temp., do 4 C. Umożliwia to transport i przechowywanie nasienia do 4 dni oraz wykorzystanie go w tym czasie do sztucznej inseminacji. Wskazania do schładzania : przedłużenie żywotności, możliwość transportu, ograniczenie przenoszenia chorób droga płciową, ograniczenie inbredu, wykorzystanie nasienia tuż po śmierci reproduktora( pobranie z najądrzy)

- nasienie rozrzedzamy w stosunku od 1:3 do 1:8 w temp 30 -55C, dawka inseminacyjna taka jak w nasieniu Świerzym, schładzanie do temp. 4C, przechowywanie od 48h do 72 h

-Nasienie rozrzedzamy, dodając stopniowo do nasienia Roz., zawsze temp. Obu płynów powinny być wyrównane, zawsze rozrzedzać tylko 2 frakcje po ewentualnym odwirowaniu przez 10 min.

Rozrzedzalniki np. 2% mleko UHT, a komercyjne TRIS, Triadyl, CLONE

KONSERWACJA NASIENIA W NISKICH TEMP. - korzyści płynące z tej formy przechowywania: transport daleko, wieloletnie przechowywani, wyeliminowanie krycia swobodnego w miejscach o niskiej populacji danej rasy, podtrzymanie hodowli rzadkich zwierząt, banki nasienia cennych reproduktorów, graniczenie kosztów , WADY – zmniejszenie zdolności zapładniających nasienia po rozmeożeniu w stosunku do nasienia pobranego, krótki okres wykorzystania nasienia po rozmrożeniu, konieczność inseminacj domacicznej

NASIENIE MROŻONE- nasienie b. dobrej jakości , 80% plemników o ruchu postępowym, o wirowaniu koncentracja 200 – 300 mln, powolne obniżanie temp. Do – 196C, dawka inseminacyjna od 150 do 200 mln plemników o ruchu postępowym., zdolność nasienia do zapładniania w drogach rodnych samicy 24 – 48 h

Składniki podstawowe różnych rorzedzalników: laktoza, kw. Cytrynowy, Tris, cytrynian sou, glukoza, fruktoza, żółtko jaja kurzego, glicerol

ETAPY MROŻENIA NASIENIA:pobranie nasienia i ocena wstępna, rozrzedzenie wstępne ( bez glicerolu), ekwilibracja( schłodzenie wstępne), rozrzedzenie wyrównawcze i ostateczne( z glicerolem), 10 min. Adaptacji wtemp. Pokojowej., napełnianie pojemników, mrożenie w parach azotu (- 140 C) lub ciekłym azocie ( - 196), rozmrażanie

PRZYGOTOWANIE NASIENIA MROŻONEGO :po wyjęciu słomki trzeba odczekać aż odparuje ciekły azot, zanurzyć słomkę do łażni wodnej o temp. 75C na 6 sek.,przełożyć słomkę do łaźni wodnej temp. 75C na 30 sek – słomki 0,25 ml, 6o sek – 0,5 ml, przy użyciu specjalnego pistoletu pasującego so słomek – unasieniać bezpośrednio ze słomeki ( dawka 500 – 800 mln plemnikow), Przy braku sprzętu zmieszać zawartość słmek z rozrzedzalnikem o tym samym składzie bez glicerolu. Każda zamrożona słomka powinna mieć instrukcję rozmrażania.

12 Regulacja hormonalna u samców

Komórki Leydiga – testosteron, Kom. Sertliego –inhibina, GnRH wydzielane w podwzgórzu –działa na przysadkę, pobudza uwalnianie FSH i LH, pulsacyjne wydzielanie u buhaja i psa ok. 5 wylewów dziennie. U ogiera znacznie rzadziej i dłuższe odstępy. FSH( ANALOG ECG) – z przysadki gruczołowej –działa na kom Sertoliego – steruje spermatogenezą i sekrecją białek wiążących androgeny, inhibinę, aromatyzacja androgenów do estrogenów. LH ( analog HCG) z przysadki gr. – na kom Leydiga, pobudza proliferacją i różnicowanie, produkcję i sekrecję androgenów i estrogenów. Obie te gonadotropiny działanie synergistyczne.

Oksytocyna – podwzgórze, cz, nerwowa przysadki – na mięśniówke gładką, przesuwa nasienie w drogach wyprowadzających

Testosteron – jądro kom. Lydiga – zachowanie samca, I i II rzędowe cechy płciowe, spermatogeneza, Ponadto: IGF I - kom Ser. I Ley, TGF b taz kom s i L, EGF, Inhibina i Activina – kom Sert,

Badania stęż testosteronu mało wiarygodne bo duże wahania dobowe. Usamców stęż. Estrogenów wysokie , wytwarzane w dużych ilościach w jadrach. U płodu androgeny odpowiadają za zejście jąder i różnicowanie dróg wyprowadzających. Androgeny odpowiadają za funkcję gr. Dodatkowych płc. Testosteron jest najważniejszym androgenem działa nie tylko endokrynnie ale też park rynnie.

13 Zaburzenia płodności u ogierów

Etiologia zaburzeń rozrodu: 1 wady anatomiczne i czynnościowe narządów rozrodczych, często wrodzone i dziedziczne, prowadzą do eliminacji z rozrodu. 2 zmiany chorobowe w narządach rozrodczych, nabyte – działanie czynników patologicznych. 3 Zmiany atroficzne u starych osobników

Zaburzenie libido : ważny problem, zaburzenia endokrynowe, choroby narządów wewnętrznych, schorzenia ogólne, brutalne postępowanie ze zwierzęciem,pozorne zaburzenia popędu u młodych mogą przemijać, Leczenie – podłoże endokrynnogene analogi GnRH – brak pewności sukcesu

Zaburzenia odruchów płciowych : zaburzenia erekcji –opaska ucciskowa na trzon prącia, Zaburzenia ejakulacji – pozorne odruchy oddawania nasienaia, niepełna ejakulacja, urospermia. Przyczyny dysregulacja na poziomie nerwowym. Próby leczenia B blokerami.

Wady wrodzone : Wnętrostwo, Skręcenie jąder – często bez wpływu na jakość nasienia, Nidorozwój jąder i najądrzy – oraz braki odcinkowe, niedorozwój narządu kopulacyjnego rzadko u koni.

Wady wrodzone i schorzenia dodatkowych gr. Płciowych : aplasia segmentalis ductus Wolffi –rzadko u ogiera, -

Zapalenie jąder i najądrzy : dość często u ogierów, pogorszenie jakości nasienia, zmiany zwyrodnieniowe i zanikowe jąder, Czynnik etiologiczny zapalenia jąder :B- hemolityczne paciorkowce, hemolityczne gronkowce, Actinobacillus, Salmonella abortus equi, wirus arteritis, wirus otretu, wirus anemi zakaźnej , Leczenie – antybiotyki , przeciwzapalne

Nowotwory j jąder u starszych ogierów, głównie nasieniaki ale też inne

14 Specyficzne i nie specyficzne choroby przenoszone przez ogiera

Bakteryjne : Taylorella equigenitalia – CEM, zapalenie pochwy i macicy – paciorkowce, gronkowce, Pseudomonas, E.coli, Salmonella AE, Klebsiella

Wirosowe – otręt , EAV – toga wirus

Grzybicze – różne zapalenie łożyska i macicy

15 Etapy aktu płciowego u buhaja

- pobudzenie płciowe –excitatio sexualis

- wzwód prącia – erectio penis

- wspięcie z ufiksowaniem

- odruch szukania

- wprowadzenie prącia

- odruchy kopulacyjne

- zejście z partnera

Zaburzenia zachowania i odruchów płciowych : -z zaburzenia popędu płciowego, obniżenie popędu u starszych , trudnoci we wspięciu, zaburzenie odruch szukania, wysuwania prącia , brak odruchu dobicia

Choroby aparatu ruchu – bardzo wa żne, zmiany w odcinku lędźwiowo krzyzowym, paraliż zadu, pionizowane tylne kończyny,

16 Zaburzenia płodności u buhajów

WRODZONE WADY NARZĄDU KOPULACYJNEGO : Phimosis, Hypospadiasis, Hypoplasia penis, nieprawidłowości glans penis, Frenulum peristens, dysfunkcja m. cofacza prącia, Diphalia

ZMIANY NABYTE – Phimosis, Paraphismisis, Balanoposthitis, Prolapsus penis, ropień napletka, guzy napletka , krwiak prącia, złamanie prącia, zmiany wytworcz e- brodawczaki i włókniaki

Patologia dodatkowych gr. Pł -: wady wrodzone wynikają z aplazji odcinkowej przewodów Wolffa. Nabyte ; Vesiculus seminalis, Ampulitis, chorobygr. Opuszkowo cewkowych oraz prostaty.

Patologia jąder, najądrzy i moszny : JĄDRA : wady wrodzone : wnętrostwo, brak jąder, nidoroawój, obojnactwo, WADY NABYTE : zap. I zwyrodnienie jąder, atrofia jąder, zwłokniennie jąder, guzy jąder połączone ze złą jakością nasienia . NAJĄDRZA – aplasia segmentalis ductus Wolffi a nabyte torbiele i zapalenie, KRWIAKI MOSZNY

17 Cechy nasienia kura

K nur osiąga stabilizację produkcji plemników w wieku ok. 7 mie, jądra rosną do ok. 3 Lat

FRAKCE NASIENIA : 1 FAZA WSTĘPNA – frakcja przednasienna gł. Z gr op- cewk, obj 5 -15 ml, 2 -10% obj ejakulatu ., 2 pierwsza faza gł. Ejakulacji – mleczno – wodnista do szaro – białej, Wysoka koncentracja plemników do 400 tyś w 1 um, zawiera wydzielinę prostaty i gr. Pęcherzykowych, obj – 120 – 350 ml, 40 60 % obj ejakulatu. 3 Faza Główna ejakulacji – szarobiała wydzielina, zawiera soczewkowate, galeretowate twory , bardzo uboga w plemniki, wydz gr. Pęcherzyk. I opuszkowo- cewkowych , 50 #00 ml, 20 40 % ejakulatu

Pobieranie nasienia u knura : na rękę metodą japońską