Podłoża stosowane do hodowli drobnoustrojów

Hodowle grzybów można prowadzić w sposób okresowy lub ciągły. W przeciwieństwie do hodowli okresowej, w której prędkość wzrostu ulega zmianie, w hodowli ciągłej zachowywana jest stałą prędkość wzrostu i stałe warunki środowiska. W ciągłych metodach fermentacji najczęściej spotykane rozwiązania techniczno-technologiczne różnią się sposobem postępowania z nagromadzoną biomasą. Mogą być takie:

- w których mikroorganizmy są ciągle wydzielane wraz z płynem hodowlanym,

- albo zatrzymywane wewnątrz reaktora.

Wśród tych pierwszych rozwiązań wyróżniamy:

- systemy jednorodne - jednostopniowe (reaktor z mieszaniem, reaktor z powrotem i wielostopniowe), ciągi proste i ciągi z wielokrotnym dozowaniem substratu,

- systemy niejednorodne - jednofazowe (reaktor rurowy z zastosowaniem powrotu) i wielofazowe (reaktor kolumnowy wielofazowy),

- systemy mieszane (reaktor mieszadłowy z reaktorem rurowym),

Drugą grupę stanowią systemy fermentacyjne, w których mikroorganizmy są zatrzymywane wewnątrz reaktora (system zamknięty). W tej grupie rozwiązań konstrukcyjno-technologicznych wyróżniamy:

- systemy jednorodne - jednostopniowe (reaktor z rurą celofanową - i reaktor z całkowitym powrotem biomasy -

- systemy niejednorodne - jednofazowe (reaktor rurowy z zastosowaniem powrotu i zbiornik podzielony z zastosowaniem całkowitego powrotu - i wielofazowe (fermentacja membranowa i reaktor kolumnowy z wypełnieniem -

Reaktory przeznaczone do hodowli drobnoustrojów metodą ciągłą pracują na zasadzie chemostatu, tj. utrzymywania stężenia określonego substratu na stałym poziomie, lub turbidostatu - utrzymywania stałego zmętnienia pożywki lub gęstości optycznej mikroorganizmów.

Konstrukcje fermentorów są uwarunkowane przede wszystkim rodzajem drobnoustroju stosowanego w procesie i jego wymaganiami fizjologicznymi, głównie zapotrzebowaniem na światło słoneczne i tlen, rodzajem pożywki (substratu) i produktu końcowego oraz przyjętą metodą ich namnażania.

Najprostszymi rozwiązaniami konstrukcyjnymi charakteryzują się kadzie fermentacyjne stosowane w hodowlach wgłębnych (w pożywkach ciekłych) i tace - kuwety o niewielkiej głębokości, lecz dużej powierzchni (do hodowli powierzchniowych na pożywkach ciekłych, podłożach w postaci past, stałych lub sypkich.

Typowy fermentor jest zwykle cylindrycznym zbiornikiem wykonanym ze:

- szkła - w skali laboratoryjnej

- stali kwasoodpornej - w skali półtechnicznej i przemysłowej.

Fermentor zaopatrzony jest w urządzenia dozujące roztwory kwasów lub zasad (w celu utrzymania odpowiedniego zakresu pH), pożywkę lub jej składniki, środki odmieniające, sterylne powietrze i urządzenia odpowiednio je dyspergujące, elementy doprowadzające i odprowadzające czynnik grzejny i chłodzący, zawory umożliwiające okresowe pobieranie (w sposób jałowy) próbek, układ mieszający i pomiarowy, (CO2, O2, zmętnienie i inne parametry)

Oprócz wymienionych wyżej podziałów bioreaktorów często uwzględnia się również sposób doprowadzenia energii do reaktora, i na tej podstawie wyróżnia się następujące grupy:

- fermentory, do których energia jest doprowadzana z fazą gazową,

- fermentory, do których energia jest doprowadzana z fazą płynną,

- fermentory z kombinowanym doprowadzeniem energii (z fazą gazową i płynną).

Innym kryterium podziału reaktorów biochemicznych może być rodzaj prowadzonych w nich procesów technologicznych.

W tym ujęciu wyróżnia się bioreaktory:

- tlenowe (aerobowe), beztlenowe (anaerobowe);

- okresowe, półciągłe, ciągłe (z zasilaniem, z odpływem i inne);

- sterylne, względnie sterylne, nie sterylne;

- przeznaczone do nagromadzenia biomasy drobnoustrojów, do otrzymywania produktów endo- i egzogennych;

- wgłębne, powierzchniowe (na pożywkach płynnych, w postaci past i na podłożach stałych), reaktory biokataliczne, w których wykorzystuje się unieruchomione komórki, ich elementy lub enzymy;

- idealnego wymieszania, częściowego wymieszania, przepływu tłokowego, pracujących w układzie reaktora pojedynczego, sekcyjnego lub w postaci odpowiedniego zestawu bioreaktorów - baterii;

- wgłębne z substratami rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi (płynnymi, w postaci past lub stałymi, mineralnymi i organicznymi);

- wgłębne z udziałem różnych grup drobnoustrojów (bakterii, drożdży, grzybów mikroskopowych, glonów) lub z wykorzystaniem komórek lub tkanek (zwierzęcych lub roślinnych);

- laboratoryjne (badawcze), pilotowe (ćwierć- i półtechniczne), przemysłowe.

Oprócz najbardziej rozpowszechnionych fermentorów zbiornikowych z mieszaniem mechanicznym coraz częściej w przemyśle stosuje się fermentory bezmieszadłowe. W tej grupie aparatów dużym zainteresowaniem cieszą się wieżowe bioreaktory cyrkulacyjne typu air-lift, w których, niezależnie od różnic konstrukcyjnych, efekt mieszania i cyrkulacji podłoża osiąga się wyłącznie dzięki odpowiedniemu napowietrzaniu cieczy.

Znaczne zainteresowanie stosowaniem reaktorów wieżowych bez mechanicznego mieszania wynika z licznych zalet tych aparatów. Jednak uzyskanie w nich odpowiednio wysokiej produktywności biomasy wymaga, zapewnienia właściwej dla danego procesu i drobnoustroju, szybkości dostarczania tlenu do fazy ciekłej. Ze względu na małą rozpuszczalność tlenu w roztworach wodnych 5-7 mg/l zwykle nie jest to zadanie łatwe. Taka zawartość tlenu w podłożu może być wykorzystana przez drobnoustroje w ciągu kilkudziesięciu sekund. Na szybkość transportu tlenu z fazy gazowej do ciekłej można wpływać zmieniając wartość siły napędowej tego procesu lub wartości współczynnika przenikania. Przeprowadzono badania stosując cztery warianty konstrukcyjne fermentora wieżowego z cyrkulacją:

- wewnętrzną, bez wkładek;

- wewnętrzną, z mieszadłami statycznymi;

- zewnętrzną, bez wkładek;

- zewnętrzną, z przegrodami perforowanymi.

Najwyższe wartości współczynnika wnikania tlenu do cieczy uzyskano w fermentorze z cyrkulacją zewnętrzną i przegrodami perforowanymi (fermentor wielosekcyjny).

Podczas hodowli Aspergillus niger w fermentorze wieżowym typu air-lift każdorazowo prowadzono fermentację przez około 168 godzin.

Podłoże hodowlane

Pożywka bakteryjna (zwana czasem podłożem bakteryjnym lub pożywką) to mieszanina związków chemicznych umożliwiających hodowlę bakterii lub grzybów. Po raz pierwszy bulionu odżywczego użył w 1877 roku Ludwik Pasteur. Oprócz tego Robert Koch używał pożywek zestalanych żelatyną, które udoskonalił za radą żony swego współpracownika, pani Hesse, używając agaru.

Pożywki mikrobiologiczne są również wykorzystywane w procesach biotechnologicznych do otrzymywania biomasy oraz określonych produktów metabolizmu mikroorganizmów. Tak też hodowle na pożywkach stanowią podstawę nieomal każdego zabiegu w bakteriologii i mikologii oraz dziedzinach na nich opartych.

Właściwości [edytuj]

W skład pożywek wchodzi woda destylowana (nie może zawierać domieszek metali) oraz sole w stężeniu zapewniającym izotoniczność środowiska. pH musi być odpowiednie dla wzrostu, ponieważ bakterie są wrażliwe na jego wahania. Najczęściej stosowaną dziś pożywką jest bulion odżywczy, który składa się z peptonu, wodnego wyciągu mięsnego oraz soli kuchennej, umożliwiającej zachowanie izotoniczności podłoża w stosunku do wnętrza komórek bakteryjnych. Niektórym samożywnym (autotroficznym) bakteriom obecność związków organicznych może zaszkodzić. Z tego powodu podłoża przeznaczone do ich hodowli zestala się krzemionką, tworząc dość twardy i elastyczny żel. Po przygotowaniu pożywkę wyjaławia się w wysokiej temperaturze.

Podział [edytuj]

Podłoża mogą być dzielone na wiele sposobów. Dzieli się je ze względu na stan na stałe (zestalone agarem określa się agarem odżywczym a żelatyną - żelatyną odżywczą), półpłynne i płynne (zwykły bulion odżywczy). Oprócz tego ze względu na pochodzenie wyróżniamy podłoża naturalne, półsyntetyczne i sztuczne. Naturalne wykonywane są z surowców pochodzenia naturalnego, które mogą zostać poddane jedynie niewielkiej ingerencji. Aktualnie używa się ich bardzo rzadko, wyłącznie w specjalnych celach badawczych. Można je uzyskać z jabłek, mleka, jajek, otrębów (dla grzybów) i innych roślin. Podłoża sztuczne stanowią mieszaninę wybranych związków chemicznych. Oprócz tego istnieją także pożywki półsyntetyczne. Najczęściej jednak podział dotyczy jakości składników.

Pożywki minimalne [edytuj]

Zawierają one wyłącznie te składniki, które są niezbędne do podtrzymania funkcji życiowych danego mikroba lub badanej funkcji mikroorganizmu.

Pożywki proste [edytuj]

Na tych pożywkach mogą wzrastać jedynie najmniej wymagające drobnoustroje. Składnikiem jest bulion i pepton, a w przypadku podłoża stałego agar i żelatyna.

Przykłady: pożywka LB, pożywka YPD.

Pożywki wzbogacone [edytuj]

Większość chorobotwórczych bakterii wzrasta właśnie na tych pożywkach. Poza standardowymi składnikami, znajduje się tu jeszcze dodatkowy czynnik - krew barania, glukoza, witaminy etc.

Przykłady: agar z krwią, agar Brauna.

Pożywki wybiórczo-namnażające (selekcyjne) [edytuj]

Są to pożywki, na których rośnie ograniczona ilość bakterii, a wzrost innych jest hamowany. Wykorzystywane są w nich cechy charakterystyczne szukanego szczepu: jeśli na przykład gatunek X rośnie przy wysokim stężeniu jakieś substancji, których dla innych gatunków jest śmiertelny, można zastosować pożywkę z daną substancją. W większości wypadków nie da się ograniczyć wzrostu tylko do jednego szczepu, można jednak znacznie zawęzić zakres.

Przykłady: bulion z żółcią, pożywka SF, pożywka Müllera i Kauffmanna.

Pożywki wybiórczo-różnicujące (elekcyjne) [edytuj]

Są to podłoża, na których różnicuje się bakterie ze względu na ich metabolizm. Jeżeli jeden z gatunków wytwarza enzym, którego nie wytwarza inny szczep rosnący na danym podłożu, można je zróżnicować ze względu na obecność (lub brak) katalizowania reakcji przez ten enzym. Jeśli wyników reakcji nie widać gołym okiem, stosowany jest dodatkowo wskaźnik informujący o zajściu przemiany chemicznej. Bardzo często dane podłoże jest równocześnie pożywką wybiórczo-namnażającą.

Przykłady: pożywka Levinea, agar SS, pożywka Chapmana, pożywka MacConkeya, pożywka Wilsona-Blaira, pożywka Endo, pożywka Krumwielda, podłoże Kliglera.

Pożywki specjalne [edytuj]

Stosowane do hodowli szczególnie wymagających szczepów bakterii.

Przykłady: pożywka Löfflera, pożywka Tarroziego-Wrzoska, agar czekoladowy, pożywka Clauberga, pożywka z tioglikolanem sodu, pożywka Levinthala, podłoże Löwensteina-Jensena.