Data wykonania ćwiczenia: 26.03.2013 r.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Enzymologia – laboratorium

Zapoznanie się z metodami określania N-końcowych reszt aminokwasowych w białkach

1. Wstęp.

Celem ćwiczenia było wykonanie reakcji dansylowania aminokwasów, a następnie peptydu, jako jednej z metod określania reszt aminokwasowych pochodzących z końca aminowego. Związkiem użytym do przeprowadzenia doświadczenia (znacznikiem) był chlorek dansylu (DNS-Cl), który reaguje z aminami pierwszo- i drugorzędowymi znajdującymi się na N-końcu, a także z grupami łańcuchów bocznych aminokwasów, takimi jak: sulfhydrylowa cysteiny, hydroksylowa tyrozyny, ε-aminowa lizyny, imidazolowa histydyny. W wyniku tej reakcji powstają (w obecności NaHCO₃) silnie fluoryzujące pochodne sulfonamidowe, podczas gdy sam DNS-Cl nie fluoryzuje. Właściwość ta ma zastosowanie przy uwidacznianiu aminokwasów po chromatografii cienkowarstwowej. Aby reakcja mogła zajść konieczne jest środowisko alkaliczne (pH ok. 9), ponieważ chlorek dansylu łączy się z grupami NH₂ (lub NH) a nie NH₃⁺. Poza tym pH nie może też być za wysokie, gdyż związek ten jest wrażliwy na hydrolizę przez jony hydroksylowe. Reakcja dansylowania przebiega zgodnie ze schematem:

Rys. 1. Schemat reakcji dansylowania peptydu[1].

Tak otrzymaną pochodną poddaje się hydrolizie używając stałowrzącego HCl, w wyniku której otrzymujemy: DNS-aminokwas + wolne aminokwasy, lub w przypadku Cys i His – DNS-OH + dany aminokwas (jeżeli ten występował w łańcuchu polipeptydowym), albo αDNS-Cys/αDNS-His (jeżeli aminokwas występował na N‑końcu).

Inne znane metody określania N-końcowych reszt aminokwasowych w białkach to:

• Znakowanie fluorodinitrobenzenem (odczynnikiem Sangera), który reaguje z grupami α-aminowymi bądź α-iminowymi peptydów tworząc dinitrofenolowe (DNP) pochodne. Podobnie jak w przypadku dansylowania z odczynnikiem tym reagują także grupy łańcuchów bocznch: histydyny, lizyny, cysteiny i tyrozyny. Przy czym dla N-końcowych reszt Lys, Cys, Tyr otrzymuje się di‑DNP pochodne aminokwasów. Produkty reakcji są hydrolizowane w stałowrzącym HCl pod próżnią w temperaturze 105ºC, w wyniku czego powstaje DNP-aminokwas + wolne aminokwasy.

• Degradacja Edmana – polega na znakowaniu reszty N-końcowej izotiocyjanianem fenylu (PITC), tworzy się pochodna fenylotiokarbomoilowa pochodna, która jest odcinana wraz z ostatnią resztą aminokwasową w kwaśnym środowisku. Następnie zachodzi jej konwersja do stabilniejszej tiohydantoinowej pochodnej, która to jest identyfikowana. Drugim produktem reakcji jest peptyd skrócony o jedną resztę aminokwasową.

Znakowanie odczynnikiem Sangera oraz reakcja dansylowania służą głównie do identyfikacji reszty aminokwasowej N-końcowej białek i peptydów. Z kolei degradacja Edmana jest przeważnie stosowana do określania sekwencji aminokwasowych peptydów nie przekraczających długości 50 reszt.

1. Metodyka i przebieg doświadczenia.

1. Dansylowanie aminokwasów.

Do 3 czystych probówek Eppendorfa nałożono na dno, przy pomocy pipety po 50 μl 5 mM roztworów aminokwasów (w 0,01 M HCl) – proliny, argininy i glicyny. Następnie zawartość probówek odparowywano pod próżnią w wirówce próżniowej CentriVap DNA, przez 20 min. w temperaturze 65ºC. Otrzymano suchą pozostałość, którą rozpuszczono w 0,5 ml 0,1 M NaHCO₃, celem usunięcia śladowych ilości NH₄⁺ jakie mogły się znajdować w próbce. Do probówek dodano po 0,25 ml roztworu chlorku dansylu o stężeniu 5 mg/ml w acetonie, po czym je zamknięto i umieszczono w łaźni wodnej o temp. 37ºC. W wyniku inkubacji trwającej 51 min., otrzymano lekko odbarwione roztwory aminokwasów (wcześniej roztwór miał barwę żółtą). Po wyjęciu probówek z łaźni dodano do nich po 25 μl 85% kwasu mrówkowego, aby przerwać reakcję dansylowania.

1. Dansylowanie peptydu.

Do 2 czystych probówek Eppendorfa nałożono na dno, używając pipety po 10 μl roztworu peptydu oznaczonego symbolem P-1. Taką mieszaninę odparowywano w wirówce próżniowej, w temp. 65ºC przez 20 min. (równolegle z roztworami aminokwasów z podpunktu a)). Do suchej pozostałości dodano 20 μl 0,2 M NaHCO₃, w celu usunięcia śladów NH₄⁺, po czym ponownie odparowano zawartość probówek w wirówce przy takich samych parametrach czasu i temperatury. Przy pomocy kapilary naniesiono na dno probówek po 20 μl wody dejonizowanej. Ta samą kapilarą sprawdzono pH mieszaniny, poprzez dotknięcie końcówką papierka uniwersalnego. Papierek zabarwił się na kolor ciemnozielony co oznaczało pH ok. 8,5 a więc takie, w którym może zachodzić reakcja dansylowania. Następnie dodano pipetą po 20 μl chlorku dansylu o stężeniu 5 mg/ml w acetonie i umieszczono probówki w łaźni wodnej nastawionej na temp. 37ºC. Roztwory inkubowano przez 53 min., co doprowadziło do zmiany zabarwienia z żółtego w bezbarwne. Zawartości probówek raz jeszcze poddano wirowaniu, tym razem przez 10 min. w temp. 65ºC. Po odparowaniu dodano po 50 μl stałowrzącego HCl. Posługując się kapilarą na 100 μl przeniesiono całą zawartość roztworów z probówek Eppendorfa do odpowiednio opisanych ampułek, które zatopiono nad palnikiem. Tak sporządzone próbki poddano hydrolizie wiązań peptydowych przez czas 18 godzin, w temperaturze 105ºC.

1. Wnioski.

Roztwór chlorku dansylu znajduje się w acetonie, ponieważ jest on najlepszym rozpuszczalnikiem dla DNS-Cl, pozwalając na jego przechowywanie przez długi okres czasu, bez pogorszenia właściwości związku. Poza tym do osiągnięcia wymaganego stężenia chlorku dansylu oraz wydajnego znakowania potrzebne jest mieszane środowisko wodno organiczne.

Ważne jest też pH środowiska, w którym prowadzimy reakcję; powinno się ono zawierać w przedziale 8 do 9 jednostek (przed dodaniem DNS-Cl), jeżeli jest poniżej 7,5 należy wówczas dodać wody, która działa jako zasada. Po dodaniu DNS-Cl znoszony jest efekt jonizacji wodorowęglanu sodu, co powoduje wzrost pH do wartości około 10. Jest to optymalne pH dla procesu dansylowania.

W przypadku aminokwasów przerwano dansylowanie przy użyciu kwasu mrówkowego. Wykorzystuje się ten związek, gdyż jest on dogodnym rozpuszczalnikiem dla DNS-aminokwasów (produktów reakcji), dzięki czemu będą one mogły zostać uwidocznione po przeprowadzeniu chromatografii cienkowarstwowej.

Z kolei podczas dansylowania peptydu, do mieszaniny dodano stałowrzący HCl. Umożliwa on odłączenie się ostatniego aminokwasu z końca N białka (który związał się z DNS) od reszty peptydu. Kwas solny jest stałowrzący co oznacza, że jego stężenie (6,1 M) zarówno w fazie ciekłej, jak i gazowej jest zachowane – nie zmienia się. Można zatem prowadzić reakcję hydrolizy w temperaturze 105ºC mając ciągle te same warunki. Związek ten uzyskuje się przez rozcieńczenie stężonego HCl w wodzie w stosunku 1:1, a następnie poddaje się taką mieszaninę destylacji w atmosferze azotowej pod ciśnieniem 101,3 kPa[2].

1. Bibliografia.

[1] http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/148/Instrukcje/cwiczenie_5/cwiczenie_5.pdf

[2] http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/148/Instrukcje/cwiczenie_5/Gray_Methods_in_Enzymology_25.pdf

[3] http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/148/Instrukcje/cwiczenie_5/labeling-table.pdf