Temat: Cechy dobrego wektora. Klonowanie DNA.
Wektorami najcz臋艣ciej s膮 wirusy lub plazmidy, czyli koliste cz膮steczki DNA w kom贸rce bakteryjnej, kt贸re nie zawieraj膮 g艂贸wnej informacji genetycznej tylko informacj臋 dodatkow膮, kt贸ra u艂atwia prze偶ycie w okre艣lonym 艣rodowisku.
Wektor musi mie膰 odpowiedni膮 pojemno艣膰 genetyczn膮 zw艂aszcza dotyczy to wektor贸w przenosz膮cych geny ludzkie, kt贸re s膮 bardzo d艂ugie. Czasem wielko艣膰 takiego genu jest wi臋ksza od cz膮steczki plazmidu lub DNAfaga i w贸wczas stosuje si臋 sztuczne chromosomy bakteryjne nazywane baci i sztuczne chromosomy nazywane yoci. Dodatkowo mog膮 mie膰 tylko jedno miejsce, kt贸re jest rozpoznawane i rozcinane przez restryktaz臋, t臋 sam膮, kt贸ra rozci臋艂a materia艂 genetyczny dawcy. Je艣li takich miejsc jest wi臋cej to w贸wczas DNA wektora zostaje poci臋te i jest bezu偶yteczne. R贸wnie偶 gdy nie ma polindromu rozpoznawanego przez restryktaz臋, wektor jest bezu偶yteczny.
Wektor musi mie膰 tak偶e marker, kt贸ry umo偶liwi jego ujawnienie si臋 w kom贸rce gospodarza. Czasem specjalnie znakuje si臋 wektory aby oznaczy膰 w 艂atwy spos贸b w jakich kom贸rkach si臋 znalaz艂y (pierwiastkami promieniotw贸rczymi lub fluorescencj膮). Je偶eli w贸wczas z bakterii do kt贸rych wprowadzono wektor wyhodujemy kolonie to w odpowiednim 艣wietle promieniowa膰 b臋d膮 te, kt贸re wch艂on臋艂y i wykorzysta艂y wektor.
Wektor nie mo偶e by膰 zjadliwy, czyli nie mo偶e w powa偶ny spos贸b uszkadza膰 materia艂y genetycznego kom贸rki lub powodowa膰 jej wymierania.
Jako wektory stosujemy tylko dagi 艂agodne, kt贸re opuszczaj膮 kom贸rk臋 bez jej zniszczenia.
Aby zachowa膰 informacje genetyczn膮 organizm贸w zw艂aszcza zagro偶onych i gin膮cych gatunk贸w stosuje si臋 bibliotek臋 DNA. Materia艂 genetyczny dawcy tnie si臋 na drobne fragmenty za pomoc膮 restryktaz i nast臋pnie ka偶dy z otrzymanych fragment贸w wprowadza do kom贸rki bakteryjnej. W ten spos贸b uzyskujemy bibliotek臋 DNA tego organizmu. Stanowi膮 go wszystkie bakterie maj膮ce w sobie fragment jego genomu.
Poniewa偶 kom贸rki eukariotyczne maj膮 ponad 80% intron贸w, czyli materia艂y genetycznego kt贸ry nie koduje informacji genetycznej. Cz臋sto DNA przepisuje si臋 na mRNA, a potem z powrotem na DNA. Otrzymujemy w贸wczas cDNA, kt贸ry zawiera tylko fragmenty koduj膮ce. Wowczas, gdy wprowadzamy go do kom贸rki bakteryjnej, otrzymujemy znacznie mniejsz膮 ilo艣膰 bakterii stanowi膮cych bibliotek臋.
Czasem do bada艅 niezb臋dne jest wielokrotne namna偶anie cz膮steczki DNA. Je艣li np. na miejscu zbrodni zostanie zabezpieczona tylko jedna cz膮steczka to nie mo偶na jej wykorzysta膰 jako dowodu, bo badania musz膮 by膰 wykorzystane niezale偶nie przez prokuratora, obro艅c臋 i niezale偶ne laboratorium. W贸wczas konieczne jest zwielokrotnienie liczby cz膮stek i dokonuje si臋 tego in vitro oraz in vivo.
Metoda In Vivo polega na wprowadzeniu DNA do kom贸wki bakteryjnej i namna偶a si臋 ono razem z ni膮, tak偶e w ka偶dej kom贸rce potomnej znajdzie si臋 ta cz膮steczka a bakterie namna偶amy tak d艂ugo ile potrzebujemy cz膮steczek. Nast臋pnie izolujemy interesuj膮ce nas DNA od reszty kom贸rki bakteryjnej.
Metoda In Vitro to technika PCR. najpierw nic DNA umieszczamy w wysokiej temperaturze i w obrebie czasteczkirozrywane zostaja wiazania wodorowe. nastepnie obnizamy temperature do okolo 70 stopni i dolaczamy sztucznie zsyntetyzowane startery. nastepnie wykorzystujemy polimeraze pozyskiwana z bakteri zyjacych w goracych zrodlach np. w parku Jellowstone Thermobacillus aquaticus, bakterie te normalnie metabolizuja w temperaturze ok 100 stopni a ich bialka nie podlegaja denaturacji, polimeraza ma optimum swojej aktywnosci w 70 stopniach. pozyskana w ten sposob czasteczka polimerazydolaczana jest do startera i doklada nukleotydy komplementarne dowolnej nici DNA w ten sposob po koleinym obnizaniu temperatury mozemy dolaczyc ligaze, ktora syntetyzuje wiazania fosfodiestrowe pomiedzy nukleotydami. Powstaja dwie czasteczki identyczne jak czasteczka maciezysta. proces mozna powtarzac wielokrotnie pozyskujac potrzebna liczbe czasteczek.