Temat: Cechy dobrego wektora. Klonowanie DNA.

1. Wektorami najczęściej są wirusy lub plazmidy, czyli koliste cząsteczki DNA w komórce bakteryjnej, które nie zawierają głównej informacji genetycznej tylko informację dodatkową, która ułatwia przeżycie w określonym środowisku.

Wektor musi mieć odpowiednią pojemność genetyczną zwłaszcza dotyczy to wektorów przenoszących geny ludzkie, które są bardzo długie. Czasem wielkość takiego genu jest większa od cząsteczki plazmidu lub DNAfaga i wówczas stosuje się sztuczne chromosomy bakteryjne nazywane baci i sztuczne chromosomy nazywane yoci. Dodatkowo mogą mieć tylko jedno miejsce, które jest rozpoznawane i rozcinane przez restryktazę, tę samą, która rozcięła materiał genetyczny dawcy. Jeśli takich miejsc jest więcej to wówczas DNA wektora zostaje pocięte i jest bezużyteczne. Również gdy nie ma polindromu rozpoznawanego przez restryktazę, wektor jest bezużyteczny.

Wektor musi mieć także marker, który umożliwi jego ujawnienie się w komórce gospodarza. Czasem specjalnie znakuje się wektory aby oznaczyć w łatwy sposób w jakich komórkach się znalazły (pierwiastkami promieniotwórczymi lub fluorescencją). Jeżeli wówczas z bakterii do których wprowadzono wektor wyhodujemy kolonie to w odpowiednim świetle promieniować będą te, które wchłonęły i wykorzystały wektor.

Wektor nie może być zjadliwy, czyli nie może w poważny sposób uszkadzać materiały genetycznego komórki lub powodować jej wymierania.

Jako wektory stosujemy tylko dagi łagodne, które opuszczają komórkę bez jej zniszczenia.

1. Aby zachować informacje genetyczną organizmów zwłaszcza zagrożonych i ginących gatunków stosuje się bibliotekę DNA. Materiał genetyczny dawcy tnie się na drobne fragmenty za pomocą restryktaz i następnie każdy z otrzymanych fragmentów wprowadza do komórki bakteryjnej. W ten sposób uzyskujemy bibliotekę DNA tego organizmu. Stanowią go wszystkie bakterie mające w sobie fragment jego genomu.

Ponieważ komórki eukariotyczne mają ponad 80% intronów, czyli materiały genetycznego który nie koduje informacji genetycznej. Często DNA przepisuje się na mRNA, a potem z powrotem na DNA. Otrzymujemy wówczas cDNA, który zawiera tylko fragmenty kodujące. Wowczas, gdy wprowadzamy go do komórki bakteryjnej, otrzymujemy znacznie mniejszą ilość bakterii stanowiących bibliotekę.

1. Czasem do badań niezbędne jest wielokrotne namnażanie cząsteczki DNA. Jeśli np. na miejscu zbrodni zostanie zabezpieczona tylko jedna cząsteczka to nie można jej wykorzystać jako dowodu, bo badania muszą być wykorzystane niezależnie przez prokuratora, obrońcę i niezależne laboratorium. Wówczas konieczne jest zwielokrotnienie liczby cząstek i dokonuje się tego in vitro oraz in vivo.

2. Metoda In Vivo polega na wprowadzeniu DNA do komówki bakteryjnej i namnaża się ono razem z nią, także w każdej komórce potomnej znajdzie się ta cząsteczka a bakterie namnażamy tak długo ile potrzebujemy cząsteczek. Następnie izolujemy interesujące nas DNA od reszty komórki bakteryjnej.

3. Metoda In Vitro to technika PCR. najpierw nic DNA umieszczamy w wysokiej temperaturze i w obrebie czasteczkirozrywane zostaja wiazania wodorowe. nastepnie obnizamy temperature do okolo 70 stopni i dolaczamy sztucznie zsyntetyzowane startery. nastepnie wykorzystujemy polimeraze pozyskiwana z bakteri zyjacych w goracych zrodlach np. w parku Jellowstone Thermobacillus aquaticus, bakterie te normalnie metabolizuja w temperaturze ok 100 stopni a ich bialka nie podlegaja denaturacji, polimeraza ma optimum swojej aktywnosci w 70 stopniach. pozyskana w ten sposob czasteczka polimerazydolaczana jest do startera i doklada nukleotydy komplementarne dowolnej nici DNA w ten sposob po koleinym obnizaniu temperatury mozemy dolaczyc ligaze, ktora syntetyzuje wiazania fosfodiestrowe pomiedzy nukleotydami. Powstaja dwie czasteczki identyczne jak czasteczka maciezysta. proces mozna powtarzac wielokrotnie pozyskujac potrzebna liczbe czasteczek.