WYKŁAD 1
Co to jest hodowla komórkowa?
Utrzymanie komórek poza organizmem w medium hodowlanym w ściśle określonych warunkach
Co to jest eksplantant?
Fragment tkanki
Co to są komórki dyspersyjne.
Wyizolowane z tkanek.
Czego modelem są hodowle komórkowe?
Hodowle komórkowe są modelem odzwierciedlającym patologiczne zmiany in vivo.
Co to jest monokultura?
Hodowla izolowanych komórek składająca komórek jednego typu, z jednej kultury komórek.
Co to jest kokultura?
Hodowle wyprowadzane ze znanej liczby komórek dwóch lub więcej typów.
Hodowla tkanek a hodowla komórek?
Hodowla tkanek powinna obejmować hodowle przestrzenne, narządowe, modele i konstrukcje tkanek i narządów, natomiast hodowla komórek powinna dotyczyć hodowli komórek dyspersyjnych (wyizolowanych z tkanek) zarówno pierwotnych jak i ustalonych ciągłych linii komórkowych.
Co oznacza termin asceptyka?
Jałowość
Komórka diploidalna?
Komórka diploidalna - komórka zawierająca podwójną liczbę chromosomów homologicznych (2n). Komórka diploidalna zawiera każdy chromosom w dwóch kopiach. Komórki somatyczne większości roślin i zwierząt są diploidalne.
Dlaczego komórki ustalone mogą dzielić się określoną liczbę razy?
Telomery skracają się przy każdym podziale komórkowym i komórka musi ulec degradacji.
Dlaczego komórki nowotworowe mogą dzielić się w sposób nieograniczony i nieokreślony?
Nieograniczony potencjał replikacyjny dzięki obecności telomerazy oraz zahamowanie procesu apoptozy.
Czym różni się hodowla pierwotna od hodowli wtórnej (linii ciągłej)?
Hodowla pierwotna wywodzi się z komórek wyizolowanych bezpośrednio z tkanek lub z narządów. Hodowle wtórne (hodowle ustalonych linii komórkowych i ciągłych(nieśmiertelne) linii komórkowych) są to hodowle pierwotne po pierwszym pasażowaniu.
Co oznacza termin proliferacja?
Zwiększenie liczby komórek w wyniku następujących po sobie podziałach.
Co to jest pasażowanie?
Enzymatyczne bądź mechaniczne odszczepienie komórek od podłoża i przeniesienie ich do innych podłóż zawierających i pozwalających na lepszy dostęp do składników.
Pasaż – rozdzielenie komórek konfluentnej hodowli na równe dwie lub wielokrotność części i przeniesienie ich do osobnych naczyń hodowlanych.
Pasażowanie – pozbycie się zużytego medium i przeniesienie komórek o mniejszej gęstości.
Co to są ciągłe linie komórkowe?
Inaczej stabilne linie komórkowe, są to komórki charakteryzujące się nieokreślonym czasem życia, najczęściej poliploidalne pochodzenia nowotworowego, co zapewnia im możliwość nieokreślonej liczby podziałów; nieśmiertelne. Można je także uzyskać z komórek prawidłowych w wyniku ich transformacji lub transfekcji, czyli zmiany materiału genetycznego.
Transformacja, transfekcja komórek?
Zmiana materiału genetycznego.
Co to jest klon komórkowy?
Populacja komórek wywodząca się z jednej komórki macierzystej i powstała na drodze jej wielokrotnych podziałów.
Co to jest hodowla konfluentna?
Hodowla, której komórki zajmują cała dostępną powierzchnię naczynia hodowlanego.
Jakie to są komórki adherentce?
Komórki wykazujące zdolność do adhezji (przylegania). Przyklejają się do powierzchni naczynia, dzielą się i rosną w postaci pojedynczej warstwy.
Są to komórki przyklejone do podłoża stałego w postaci monowarstwy, nie mogą przekraczać 70-80% konfluencji.
Źródło komórek zawiesinowych?
Komórki zawiesinowe pochodzą z krwi, głownie z limfocytów; nieadherujące.
Typy śmierci komórkowej?
Nekroza – śmierć przypadkowa, uszkodzenie mechaniczne (pęcznienie komórki)
Apoptoza – śmierć zaprogramowana, brak czynników promujących przeżycie (obkurczanie komórki)
Degradacja proteosomalna?
Białak cytozolowe znakowane są ubikwityną (poprzez Lys)
Co to są fibroblasty?
Fibroblasty – komórki występujące u zwierząt, wywodzące się z mezodermy, będące najliczniejszymi komórkami tkanki łącznej właściwej. Produkują m.in. kolagen.
Fibroblasty to komórki skóry właściwej odpowiedzialne za syntezę m.in. kolagenu i elastyny, czyli włókien podporowych zapewniających elastyczność skórze.
Wyjaśnij termin senescence?
Starzenie się komórek, zahamowanie proliferacji.
WYKŁAD 2
Pojęcie: replikometr?
Komórki posiadają wskaźnik liczby podziałów: replikometr
Czy numer pasażu równa się numerowi podziału komórkowego.
Nie
Gdzie i kiedy jest czynna telomeraza?
orzęski, drożdże, ludzkie komórki pnia: komórki szpiku kostnego, komórki w kryptach jelita, komórki rozrodcze, komórki nowotworowe, myszy: we wszystkich tkankach
Mechanizm działania telomerazy
Po każdej replikacji chromosom ludzki ulega skróceniu o 50-100pz.
Pojęcia:
Komórki przyczepne – do przeżycia i wzrostu wymagają przyczepienia się do stałego substratu – dno naczynia hodowlanego.
Zahamowanie kontaktowe – zahamowanie ruchu i wzrostu komórek, wówczas gdy komórki stykają się ze sobą; zjawisko to poprzedza stan konfluencji.
Proliferacja – zwiększanie liczby komórek w wyniku następujących po sobie podziałów.
Czym różni się wzrost od proliferacji?
Wzrost – zwiększanie objętości. Proliferacja – zwiększenie liczby komórek
Czym różni się zahamowanie kontaktowe od zagęszczenia?
Zagęszczenie - spowodowane wzrostem, zahamowanie – komórki nie rosną na skutek dużego zagęszczenia.
Czym charakteryzuje się hodowla konfluentna?
Hodowla konfluentna – hodowla, której komórki zajmują całą dostępną powierzchnię wzrostu naczynia hodowlanego – substratu.
Scharakteryzuj czerwień fenolową?
Czerwień fenolowa – indykator pH występujący w podłożu. Nadaje pożywce określoną barwę w zależności od jej pH (barwa purpurowa – pH 7.8; czerwona – pH 7.4; pomarańczowa – pH 7.0; żółta – pH <6.5).
L-glutamina jako komponent pożywek hodowlanych?
L- glutamina
Kluczowy składnik medium będący źródłem energii dla komórek, zaangażowany w syntezę białek oraz metabolizmu kwasów nukleinowych. L- glutamina jest stabilna w postaci stałej in w postaci zmrożonego rr. W medium hodowlanych ulega szybkiej degradacji z wytworzeniem amoniaku.
WYKŁAD 3
Dlaczego musi być taka wielka wilgotność przy hodowli komórek?
Powietrze musi być przesycone, wtedy nic nie paruje.
Rola surowicy w pożywkach?
Surowica- większość pożywek stosowanych do hodowli komórek nowotworowych wzbogacona jest 5-10% (v/v) dodatkiem bydlęcej surowicy płodowej (FBS), która stanowi złożoną mieszaninę wielu mikro i makrobiocząsteczek. Neutralizuje ona efekty toksyczne, np. metali ciężkich, a także zapobiega zmianom środowiska, takim jak np. zmiana pH. Zawiera niezbędne do hodowli białka, czynniki wzrostu, hormony, kwasy tłuszczowe, transferrynę, czynniki adhezyjne, inhibitory proteaz.
Która surowica używana jest jako czynnik różnicujący?
Surowica końska – Horse serum – HoS czynnik różnicujący
Co determinuje występowanie białek komórkowych?
Translacja oraz degradacja.
Główne szlaki degradacji białek:
Degradacja lizosomalna – cząsteczki transbłonowe, białka pobrane na drodze endocytozy
Degradacja proteosomalna – białka cytozolowe znakowane ubikwityną (poprzez Lys)
W jaki sposób można przenieść informacje genetyczną?
DNA (RNA w przypadku niektórych wirusów)
Priony – funkcja?
Białkowych cząstki infekcyjnych, priony - mogą przekazywać informację pionowo oraz horyzontalnie poprzez infekcję innych osobników.
Hodowla w zawiesinie?
Są to hodowle, w których komórki aby proliferować nie muszą mieć kontaktu z podłożem (np. komórki hematopoetyczne);komórki rosną w postaci pojedynczych komórek ale mogą tworzyć się klony (grona) komórek.
Zadanie – zaprojektować linię.
Jeśli chcemy badać przeciwciała to stosujemy hodowle zawiesinowa, a jeśli wpływ toksyczności to komórki adherentne.
WYKŁAD 4
W której fazie czas adhezji?
Faza lag = faza opóźnienia
Co to jest glikokaliks?
Cienka warstwa na powierzchni komórek zwierzęcych, zbudowana z glikoproteidów i glikolipidów, w których reszty cukrowe są rozgałęzionymi oligosacharydami. Glikokaliks szczególnie dobrze jest rozwinięty w komórkach nabłonkowych jelita chroniąc je przed działaniem enzymów trawiennych. Odgrywa również rolę przy rozpoznawaniu własnych komórek i międzykomórkowej wymianie informacji.
Z której fazy wzrostu powinny być brane komórki do eksperymentu i uzasadnij swój wybór?
Z fazy logarytmicznej. Jest ich najwięcej, mają nieograniczoną liczbę podziałów, dużo składników odżywczych.
Czy można wyznaczyć czas generacji dla komórek nowotworowych?
NIE
Czas generacji?
Czas pomiędzy następującymi po sobie podziałami komórkowymi (dla komórek diploidalnych, które pasażuje się w stosunku 1:2).
Czy można zostawić komórki nowotworowe o dużej gęstości na kilka dni?
Nie, gdyż komórki nowotworowe mogą się dzielić w sposób nieograniczony i nieokreślony. (spada pH)
Czy można zostawić komórki diploidalne o dużej gęstości na kilka dni?
Tak, ponieważ przy dużej gęstości komórki prawidłowe zatrzymują się w fazie G cyklu komórkowego i ich kondycja pogarsza się tylko w niewielkim stopniu.
Czy przy zmianie medium hodowlanego pozostawiamy pewną objętość pożywki?
Tak, bo tam są czynniki wzrostu; aby nie pozbawić komórek tych czynników.
Co wpływa na przepływ informacji?
Macierz zewnątrzkomórkowa + cząstki adhezji.
Uwarunkowanie od zakotwiczenia?
Zjawisko, w którym przyleganie do stałego podłoża jest warunkiem dla replikacji komórek.
Hamowanie kontaktowe?
Utrata zdolności do podziałów po osiągnięciu pewnego poziomu kontaktu międzykomórkowego (nagromadzenia lub stłoczenia); dotyczy wielu typów komórek.
Podaj przykład połączenia homofilnego.
Kadheryna E+kadheryna E; połączenia między filamentami cytoszkieletu
Reakcje agregacyjne – interakcje adhezyjne przyczyniające się do nagromadzenia komórek. (np. płytki krwi przylegające do śródbłonka).
WYKŁAD 5
Podaj przykład cząstki adhezyjnej aktywującą proliferację.
Kadheryny
Kadheryny?
Kadheryny zależne od wapnia cząstki adhezyjne pośredniczące między homotypowym przyleganiem i proliferacją (poprzez cząstki pośredniczące zwane Kareninami).
Czy p-kadheryna występuje we wszystkich organizmach i dlaczego?
P- łożyskowa
Czy obecność jonów wapnia i magnezu w środowisku reakcji pozwoli na przyspieszenie oddzielenia komórek od substratu?
Nie – te jony wymagane są przez cząstki adhezji do przyleganie, np. przez kadheryny
Jak pozbyć się jonów wapnia i magnezu ze środowiska reakcji?
EDTA – chelator jonów dwuwartościowych.
Które cząstki adhezji zależne są od jonów wapnia?
Kadheryny, selektyny
Białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)?
kolageny, proteoglikany oraz białka mogące wiązać integryny (fibronektyna, laminina, tenascyna)
WYKŁAD 6
Czym może być spowodowana zwiększona migracja komórek?
Może być spowodowana pobudzeniem aktywności lub dezaktywacją receptorów.
Połączenie barierowe.
Styk zwarty, występują białka integralne sąsiadujących błon: okludyna i klaudyna.
Połączenie komunikacyjne.
Szczelinowe – szczelina umożliwa przepływ metabolitów i jonów.
Czy koneksony będą aktywowały kinazę FAK?
Nie, bo nie uczestniczą w przekazywaniu sygnałów, a jedynie w połączeniach między błonami (np. wymianie metabolitów)
Podaj przykład cząsteczki adhezyjnej, aktywującej kinazę FAK.
Kadheryna.
Co wykazują komórki, które charakteryzują się wysoką inwazyjnością i adhezyjnością?
Wykazują znaczny potencjał do wydzielania białek MMP, których podstawową funkcją jest uczestniczenie w fizjologicznych i patologicznych procesach przebudowy składników macierzy zewnątrzkomórkowej i degradowanie ich.
Jakie będzie aktywne pH dla działania trzustkowej trypsyny, której roztwór przygotowuje się w PBS?
Neutralne, około 7 (optimum działania)
Dlaczego trypsynę można zainhibować przez dodanie surowicy?
Dojdzie do reakcji kompetycyjnej (walka o substrat), ponieważ jeśli dodamy najpierw białko w postaci surowicy to trypsyna zajmie się proteolizą tych białek.
Wymień metody pozwalające na odczepienie komórek adherujących od substratów.
Metody mechaniczne (potrząsanie, zdrapywanie)
Metody enzymatyczne (enzymatyczne odczepienie za pomocą: trypsyny; dyspasza; trypsyna + kolagenaza; TrypLETM (enzym odczepiający)).
Czy obecność jonów wapnia i magnezu w środowisku reakcyjnym pozwoli na przyspieszenie oddzielenia komórek od substratu? Uzasadnij.
Nie pozwala, gdyż od np. jonów wapnia zależna jest adhezja przez kadheryny
Jak pozbyć się jonów wapnia i magnezu ze środowiska reakcji? Uzasadnij.
Należy zastosować EDTA - to jest związek chelatujący jony dwuwartościowe, przez co nastąpi ich dysagregacja ?
Gdybyś chciał przeprowadzić hodowlę pierwotną/standardową to którego enzymu użyłbyś do uzyskania komórek?
Pierwotna – kolagenoza
Standardowa – trypsyna
Zaproponuj enzym do oddzielenia komórek z komórek krwi.
Nie możemy zadziałać enzymem, możemy co najwyżej komórki krwi odwirować
WYKŁAD 7
Czego najlepiej użyć w przypadku hodowli, która nie jest zamrażana na „zawsze”? Azotu czy -80ºC?
-80ºC
Kriokonserwacja to proces przechowywania materiału biologicznego w temp. (-79stC) – (-196stC), w której procesy metaboliczne komórek ustają (procesy biochemiczne -130stC, metaboliczne -196stC), a uszkodzenia są minimalizowane. [-196stC ciekły azot]
Dryf genetyczny
Zmiana częstości występowania alleli.
W której fazie zamrażamy?
Zamrażane komórki muszą być w fazie log wzrostu orz być w dobrej kondycji i wolne od mikroorganizmów, aby uniknąć strat w czasie przechowywania.
Po co mrozi się komórki?
Aby komórki, które nie są wykorzystywane w danym momencie mogły być przetrzymane.
Jeżeli planowane jest przeprowadzenie eksperymentu w ciągu trzech tygodni od momentu zamrożenia komórek to jaki sposób krioprotekcji zalecisz (mrożenie w azocie czy w ciekłym azocie).
Mrożenie w ciekłym azocie.
Jeżeli planowane jest przeprowadzenie przesiewu w ciągu 3 tygodni od momentu zamrożenia komórek to jaki proces zalecisz?
80ºC w specjalnej zamrażarce.
Cechy glicerolu?
Podczas powolnego zamrażania powoduje odwodnienie komórki, co zapobiega tworzeniu kryształów wody. Nie przenika przez błonę komórkową w niskiej temperaturze (przenika w temperaturze fizjologicznej). Stabilizuje białka w ich stanie natywnym.
Cechy DMSO?
Podczas powolnego zamrażania chelatuje metale białkowe, co przeciwdziała denaturacji białek. Dodatkowo DMSO obniża temperaturę mrożenia co przeciwdziała tworzeniu kryształów lodu.
WYKŁAD 8
Mykoplazma (gram-)
Bakteria nie posiadająca ściany komórkowej (średnica 0,3-0,8 mikrometra); nie widać zmian makroskopowych – może spaść tempo proliferacji.
Zapłodnienie in vitro
Zapłodnienie komórki jajowej przez plemnik poza organizmem kobiety.
Inseminacja domaciczna (wewnątrzmaciczna)
Podawanie odpowiednio przygotowanego nasienia mężczyzny do wnętrza macicy leczonej kobiety
Krioprotektanty
Polialkohole oraz cukry proste: glikol polietylenowy, glicerol, glukoza, sacharoza.
Witryfikacja
Proces przejścia ze stanu ciekłego do stałego bez tworzenia się niekorzystnych dla komórek kryształków lodu. Efekt ten osiąga się poprzez zastosowanie wysokiego stężenia krioprotektantów oraz błyskawicznego chłodzenia ( w tempie 15000-30000stC/min)
WYKŁAD 9
Hormeza.
Hormeza – zjawisko korzystnego wpływu niskich dawek czynnika szkodliwego w wysokich dawkach.
Czym się różni przeżywalność od cytostatyczności?
Cytostatyczność jest to zahamowanie wzrostu i rozmnażania się komórek, a przeżywalność jest to stopień zdolności do przeżycia organizmu wyrażony liczbowo.
Cytotoksyk a cytostatyk?
Pierwszy odnosi się do metabolizmu, a drugi do proliferacji.
Co to jest multipleksowanie?
Multipleksowanie testów komórkowych pozwala na wydajną analizę więcej niż jednego parametru z jednej próbki dzięki połączeniu różnych testów. Dzięki pomiarowi i skojarzeniu kilku parametrów dane mają duże znaczenie diagnostyczne i są powtarzalne. W zależności od skojarzenia jeden test może służyć jako wewnętrzna kontrola dla innego testu.
Elektroforeza – od jakiego, do jakiego ładunku?
Od (+) do (-).
Czym różni się lamellipodia od filopodii?
Lamellipodia to sieć krótkich włókienek aktynowych skrzyżowanych skośnie, bądź pod kątem prosty, a to nibynóżki zawierające równoległe wiązki filamentów aktynowych.
WYKŁAD 10
Przeszczepy autologiczne.
Polega on na przeszczepienie tkanki, narządu wewnątrz jednego organizmu.
Składniki macierzy zewnątrzkomórkowej
Kolagen, żelatyna, kwas hialuronowy, chityna (polimery naturalne)
W jaki sposób dostarczamy czynniki wzrostowe?
Bezpośrednie wstrzykiwanie DNA plazmidowego, które zawiera gen kodujący czynnik wzrostu
Transfekcja genu danego czynnika wzrostu do komórek, które będą przeszczepiane i transplantacja tych komórek do tkanki, która ma być regenerowana
Bezpośrednie związanie czynników wzrostowych z matrycą (GF – związany najpierw z odpowiednim nośnikiem, np. Żelatyną tworzy kompleksy jonowe z GF)
Podaj w jaki sposób przez wprowadzenie do DNA czynnika wzrostowego indukujemy proliferacje?
Przez wprowadzenie bezpośrednio plazmidu, ewentualnie fragmentu który wcześniej był transfekowany.
WYKŁAD 11
Macierz zewnątrzkomórkowa.
Skład macierzy zewnątrzkomórkowej determinuje zasiedlanie niszy przez komórki. Każda komórka ma sferę chroniącą znajdującą się między tą komórką a środowiskiem zewnętrznym – przestrzeń zewnątrzkomórkowa.
Macierz pozakomórkowa (ECM).
Jest dynamiczną, elastyczną i wielkoskładnikową zwartą strukturą, która wypełnia przestrzeń między komórkami, gdzie dochodzi do magazynowania czynników wzrostu i cytokin oraz przenoszenia sygnałów.
Podaj przykład białek włókienkowych w wewnątrz macierzy zewnątrzkomórkowej
Elastyna, kolagen, keratyna.
WYKŁAD 12
Efflux.
Mechanizm odpowiedzialny za przenoszenie substancji toksycznych i antybiotyków na zewnątrz komórki, uważany jest za istotną część metabolizmu ksenobiotyków. Mechanizm ten jest ważny w medycynie ponieważ przyczynia się do bakteryjnej oporności na antybiotyki.
Sferoidy.
Powstają z agregatów, które w czasie hodowli przekroczyły krytyczną średnicę agregatu.
Apoptoza.
Śmierć zaprogramowana, brak czynników promujących przeżycie.
Anoikis.
Proces apoptozy wynikający z nieprawidłowego przylegania komórek nabłonkowych, śródbłonkowych oraz niektórych fibriblastoidowych nazywany jest anoikis. Zaburzenie anoikis w warunkach in vivo wpływają na metastazę odseparowanych komórek nowotworowych pozwalając im na rozprzestrzenianie się w organizmie.
Autofagia
Proces pozwalający komórkom na wygenerowanie substancji odżywczych i energii z wykorzystaniem procesu degradacji organelli wewnątrzkomórkowych.
Narządy płaskie.
Np. gruczoł mlekowy myszy, przepona lub tkanki zarodkowe ssaków.
Hodowla narządowa.
Model najbardziej zbliżony do stanu komórki lub narządu in vivo.
Komórka macierzysta
Komórka, która drogą podziałów albo wytwarza komórki identyczne, jak ona sama (samo odnawialność) albo różnicuje komórki.
Co to znaczy że komórka macierzysta jest samo odnawialna?
Na skutek szeregu podziałów wytwarza komórki takie same.
Druga cecha komórek macierzystych to różnicowanie – przekształcenie komórki do komórki odpowiedniego typu, które nie dzielą się w sposób ograniczony.
Czym różni się mitoza symetryczna od mitozy niesymetrycznej?
Asymetryczna mitoza – podczas niej powstają dwie komórki potomne, których materiał genetyczny jest identyczny, ale różnią się funkcją:
Jedna z nich jest dalej komórką macierzystą, samo wytwarzającą się,
Druga staje się komórką progenitorową, potencjalnie zdolną do różnicowania we wszystkie typy komórek somatycznych.
W mitozie symetrycznej powstają dwie identyczne komórki potomne o tej samej funkcji.
Komórki macierzyste dzielimy na (ze względu na różnicowanie się):
Totipotencjalne (do każdego typu komórek w organizmie), Pluripotencjalne (nie mogą przekształcać się z powrotem do totipotencjalnych), multipotencjalne (do wszystkich w obrębie listka zarodkowego), unipotentne (tylko do jednego typu).
Reprogramowanie.
Przeprowadzenie komórek somatycznych w pluripotentne.
INNE
Zaproponuj enzym do komórek zawiesinowych
Nie da się, komórki te jedynie można odwirować!
Czym możemy zróżnicować (wyspecjalizowane) komórki? Co możemy do nich dodać?
Czynniki wzrostu albo końską surowicę.
Miocyty
Miocyty, włókna mięśniowe, dojrzała postać komórek mięśniowych, które powstają w czasie ontogenezy z mioblastów.
Hodowle 3 D
Technika hodowli 3D przybliża warunki mające miejsce w tkankach i organach bardziej od hodowli 2D. Komórki łączą się ze sobą tworząc naturalne połączenia cell – to – cell. Struktura jest ruchoma i plastyczna w sposób analogiczny, jak ma to miejsce w tkankach. Oddziaływania komórka – komórka pozwalają na utworzenie połączeń między komórkami w 3 wymiarach. Do hodowli przestrzennych 3D zaliczamy: agregaty mogą być zbudowane z jednego lub kilku typów komórek, zawierają macierz zewnątrzkomórkową i połączenia międzykomórkowe, model ten jest wysoce użyteczny w prowadzeniu hodowli komórek wysoce zróżnicowanych, przejawiających krótki okres aktywności – komórki żyją dłużej niż rosnąc w monowarstwie. sferoidy – powstają z agregatów, które w czasie hodowli przekroczyły krytyczną średnicę agregatu, rosnące w systemie 3D sferoidy zachowują się jak guzy nowotworowe, mikroobszary nowotworowe lub ogniska przerzutów.