TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Czemu służy każda z poszczególnych elektroforez
1. W ćw. 1-żeby sprawdzić czy zaszło nasze trawienie i otrzymaliśmy zlinearyzowany wektor

2. W ćw. 2-żeby pozbyć się wszystkich zanieczyszczeń, aktywności enzymu restrykcyjnego i fosfatazy

3. W ćw. 3-w celu oszacowania stężenia wektora, w którym nie ma już żadnych zanieczyszczeń i aktywności
-w celu sprawdzenia, czy nasz PCR się powiódł

W jakim celu stosujemy gorący start?
-żeby osiągnąć wysoką specyficzność reakcji
-żeby nie “zmęczyć” polimerazy-nie traciła swojej aktywności; a dzięki wysokiej temperaturze niszczymy wszelką aktywność innych, ewentualnych białek, które mogą się znajdować w roztworze, no i co oczywiste, mamy pewność, że matryca się rozplotła, startery nie hybrydyzują

Dlaczego w PCR diagnostycznym nie ma etapu x5?

W diagnostycznym zależy nam tylko, aby potwierdzić, czy dane pasmo jest, bądź nie. System zero-jedynkowy. Nie tworzymy matrycy wtórnej.

Dlaczego należy zachować odpowiedni stosunek molowy n- instertu do n-wektora?

Zapewniamy dostateczne prawdopodobieństwo połączenia się wektora z insertem. Insertu nie może być zbyt dużo, ponieważ zachodzi możliwość tworzenia form konkatamerycznych, czyli połączonych ze sobą insertów.

Dlaczego pH w buforze w PCR zmienia się, jak temperatura rośnie?

Tylko bufor fosforanowy nie zmienia swojego pH wraz ze wzrostem temp.

Jak się projektuje mieszaniny do defosforylacji?

Nie ma tutaj jakiś szczególnych reguł, ale:

- bierze się zazwyczaj 1ul fosfatazy

- dodajemy ten sam bufor, co do trawienia restrykcyjnego

- bierzemy całą objętość mieszaniny po trawieniu.

- ograniczeniem objętościowym jest 50ul.

- fosfataza również pływa w 50% glicerolu - jak każdy enzym.

Dlaczego gęstość optyczną hodowli mierzymy akurat przy 600nm?

Mierzy się wtedy rozproszenie światła, jeśli jest dużo komórek bakteryjnych, to będzie ono małe, jeśli będzie mało komórek, to będzie duże.

Kilka pytań z zeszłego roku, ponoć mix od różnych prowadzących. Proponuję na zielono napisać poprawne odpowiedzi.

1. Co to jest (i co robi):

- ori - miejsce startu replikacji. U E coli jest to “Ori C locus”. To fragment DNA ktory: 1) zawiera 5 powtorzen sekwencji, do ktorych wiarza sie bialka DnaA- polipetydazy rozpoznajace miesca inicjacji replikacji DNA u bakterii. 2) Zawiera tandemowo ulozone sekwencje o dlugosci 13pz kazda bogate w pary A=T (Zrodlo: moje notatki ze strayera)

- lac I -gen represora lac; czyli to co blokuje ekspresje naszego zrekombinowanego bialka, i co inaktywujemy za pomoca IPTG (hm... chyba musze to jakos ladniej napisac...)

- MCS - (multi cloning site) polilinker, fragment wektora zawierający wiele miejsc restrykcyjnych dla różnych enzymów restrykcyjnych; cechą charakterystyczną tych mijesc jest to, że występują tylko 1 raz w całym wektorze, co zapewnia eksperymentatorowi dokładnie określone miejsce cięcia.

2. Jakie czynniki (i jak) wpływają na ruchliwość DNA wyizolowanego z bakterii. (to jest w tabelce przy którymś ćwiczeniu)

3. Zadanie z trawienia – przygotowanie mieszaniny reakcyjnej:

- BamHI

- BamHI i Eco721

- podać jakie aktywności enzymów dla tych trawień potrzeba jeśli zamiast 1h trawimy się przez 2h wtedy wystarczy użyć 2 razy mniej enzymu

4. Rozpisać program PCR:

- normalny

- dla starterów hybrydyzujących w całej długości

podać T hybrydyzacji (chyba w obu przypadkach)

podać skład mieszaniny do ligacji

5. Podane 4 enzymy restrykcyjne i sekwencje, które rozpoznają – określić który najłatwiej się później zliguje, który najciężej. Co zrobić, żeby w ogóle mieć szansę zligować tępe końce?-glikol polietylenowy

6. „practical approach”:

- dla znanych stężeń początkowych i końcowych antybiotyku (miały różne jednostki: μg/μl i μg/ml chyba), obliczyć rozcieńczenie

- mamy X próbki (chyba 20 μl) i bufor 5x, ile trzeba dodać buforu, że na końcu był 1x

- do DNA dodać TE czy wodę

7. Czy możliwe jest zligowanie produktów trawienia innymi enzymami.

Tak, jesli

a) miejsce restrykcyjne jednej restryktazy zawiera sie w drugiej (kaudamery sie to zwalo chyba izokaudamery :)) Przyklad:

CGATATCG GATATC

GCTATAGC CTATAG

b) obie restryktazy daja te same lepkie konce (czyli sa izokaudamerami bodajze)

c) obie restryktazy daja konce tempe

8. Podać definicję 1 U. (jest w notatce do ćwiczenia 1) 1U = 1 jednostka enzymu trawi całkowicie 1ug testowego DNA w czasie 1 godziny w warunkach optymalnych podanych przez producenta

9. PRAWDA/FAŁSZ:

- izoschizomery (była podana jakaś definicja tnące inne sekwencje ale dające takie same końce)NIET

“Enzymy restrykcyjne, ktore rozpoznaja te same sekwencje, ktore moga (ALE NIE MUSZA!!) dawac rozne konce”

- tlen jest inhibitorem polimeryzacji żelu poliakrylamidowego TAK (polimeryzacja akrylamidu jest procesem rodnikowym, a tlen wyłapuje rodniki)

- Dam – rozpoznawanie sekwencji CC?GG NIE (GATC)

- ligaza – wymaga ufosforylowanego końca 5’ lub 3’ NIE (ufosforylowanego 5’a 3’-OH)

- po transformacji bakterie potrzebują czasu, żeby odbudować ścianę komórkową NIE (potrzebują czasu na syntezę białka nadającego oporność na antybiotyk)

- TE = TEMED + EDTA NIE (Tris + EDTA)

- z 50 pmol starterów powstanie w PCRze 100 pmol dsDNA NIE (powstanie 50 pmoli dsDNA lub 100 pmoli ssDNA)

- aktywność egzonukleazowa 5’->3’ jest pożądana (chyba przy PCR?) NIE (bo ona służy do usuwania starterów)

- SDS zawsze maskuje ładunek białka, tak że elektroforeza rozdziela tylko wg masy NIE (np. w przypadku lizozymu, który jest silnie zasadowym białkiem - dużo Arg i Lys - SDS nie maskuje całkowicie ładunku i w efekcie lizozym ma mniejszą ruchliwość niż wynikałoby to z jego masy,)

- fag T4 używa NAD+ jako kofaktora NIE (używa ATP, NAD+ jest używany przez ligazy bakteryjne)

- aktywność gwiezdna to cięcie niespecyficzne TAK

3. Podac 2 metody pozwalające na sprawdzenie czy insert wklonowal sie w popranej orientacji.

- trawienie restrykcyjne: wybieramy dwa miejsca restrykcyjne - jedno na wektorze w pobliżu miejsca wstawienia insertu, a drugie na insercie, w pobliżu miejsca połączenia z wektorem (byle nie na środku insertu). Po trawieniu robimy elektroforezę i jeśli jest poprawnie wstawiony to będzie jeden produkt długi a drugi bardzo krótki (albo go wogóle nie będzie bo ucieknie z żelu), a jeśli będzie źle wstawiony po powstaną dwa produkty: średni i krótki. Łatwiej wytłumaczyć na rysunku.

- PCR: starter przedni do wektora (w pobliżu miejsca wstawienia insertu) i starter tylny do jednego z końców insertu; po PCRze elektroforeza. Prawidłowo wstawiony insert da produkt o oczekiwanej długości, a źle wstawiony wogóle nie da (oba startery będą wydłużane w tę samą stronę zamiast do siebie) lub da bardzo długi produkt.

4. Przeanalizowac wynik elektroforezy mieszaniny po PCR, czy wyszło jak miałoa wyjśc, jeśli nie to dlaczego, jak zmienić warunki eksperymentu by wyszło dobrze.

5. Wymienić co i jak wpływa na ruchliwość/rozdzielczośc elektroforezy w żelu agarozowym. (tabelka rysowana przez ADL na zajęciach) No ale ta tabelka taka strasznie bezosobowa jest w przeciwienstwie do moich wypocin ;p A przy okazji: Tabelka ADL nie uwzglednia, ze sa jeszcze rozne typy agarozy oraz bufory do elektroforezy

a) Stezenie agarozy: Liniowe fragmenty DNA migruja z roznymi predkosciami w zaleznosci od stezenia agarozy. Im wyzsze stezenie tym migruja wolniej.

b) Konformacja DNA- ogolnie superskrecone DNA migruje w zelu najszybciej. Dalej jest DNA koliste (nie skrecone bo “nickowane” na jednej nici), a na koncu liniowe DNA. Stosunek szybkosci tych migracji zalezy jeszcze od stezenia i typu agarozy. Ale nie zawsze powyzsza regula jest stosowana, bo pod pewnymi warunkami (np pewne wartosci sily jonowej buforu) np. superskrecone DNA migruje wolniej niz liniowe.

c)obecnosc bromku etydyny w agarozie lub buforze- Interkalujac DNA bromek zmniejsza jego ujemny ladunek, przez co spada jego ruchliwosc elektroforetyczna, oraz zwieksza sie dlugosc i sztywnosc DNA.

d) Przylozone napiecie- im wyzsze tym ruchliwosc szybsza (wzrasta jednak ryzyko denaturacji), jednak dla duzysz czastek ich tempo migracji bedzie wzrastac nierownomiernie, przez co za duze napiecie moze spowodowac klopoty z rozdzialem.

e) Typ agarozy- rozne typy sluza do rozdzialu DNA o roznej dlugosci. Wyrozniamy typ zwykly, nisko topniejacy oraz mieszany (kombinacja poprzednich).

f) Bufor do elektroforezy- w zlaeznosci od jego skladu mamy rozna sile jonowa, przez co DNA moze migrowac z rozna szybkoscia. Stezenie soli nie moze byc tez za wysokie bo zbyt duza lepkosc roztworu powoduje gorszy rozdzial

6. Po ekspresjonowaniu białka na plytce z kontrolą wyrosło 0 koloni, na plytce z indukowantmi komórkmi 2. Czy to oczekiwany wynik, jesli nie to dlaczego, co trzeba zmineic żeby wyszło dobrze. Podane było tez w jakim stosunku był insert do wektora, czy plazmid do komórki, nie pamiętam bo nie robilam tego.

Dobrze, że na kontroli nic nie wyrosło, bo to znaczy, że stopień religacji jest równy 0. Z drugiej strony wynik nie jest miarodajny, bo na ligacji wyrosło za mało kolonii, by można było coś wnioskować. Warto jeszcze raz przeprowadzić ligację używając większej ilości wektora.

1)enzym trawi z aktywnością 1U, wtedy gdy...(dokończ zdanie) w ciągu jednej godziny całkowicie zhydrolizuje 1 ug testowego DNA w całkowitej maksymalnej objętości mieszaniny reakcyjnej równej 50 ul w warunkach optymalnych podanych przez producenta.

2).napisz co i w jaki sposób wpływa na ruchliwośc liniowego DNA w żelu elektroforetycznym (tabelka w notatce do któregość ćwiczenia)

3).zadanie z projektowania mieszaniny reakcyjnej

4)zadanie z programowania PCR (ten schemat z temperaturami)

5).zadanie z projektowania starterów

6).zadanie z projektowania mieszaniny ligacyjnej

7) zdania-PRAWDA-FAŁSZ:

-czy kofaktorem dla ligazy z bakteriofaga jest ATP? nie (NAD+) Nie mylić bakterii z bakteriofagiem! T4 wymaga ATP

-czy ligaza z faga F4 wymaga 3'OH i 5'-P? TAK (jak każda inna ligaza, ale w odróżnieniu do nich może ligować tepe konce)

-neoschizomery rozpoznaja taka sama sekwencje, ale tna inaczej? TAK

-czy aktywność egzonukleazy 3'->5' jest zjawiskiem pożądanym w PCR? TAK (jest to aktywność korekcyjna), w przypadkach, gdy potrzebujemy duzej dokladnosci powstajacego produktu. Czyli w takim razie chyba nie jest to tak konieczne przy PCR analitycznym, prawda? Bo tam musimy po prostu zaobserwowac wyrazniejsze prazki na tle “smieci”?

-coś z ruchliwością w zelu agarozowym, (że zależy od stężenia ale może zależeć od bromku etydyny, jeśli ma duże pI grup bocznych?)

-czy aktywność gwiezdna nie jest zjawiskiem pożądanym i polega na tym,że enzym tnie w innym miejscu niż jego sekwencja restrykcyjna? TAK

-czy ligacja z uszkodzonym fragmentem jednej nici jest bardziej wydajna niz ligacja lepkich konców? TAK (bo wymaga spotkania się tylko dwóch cząsteczek: ligazy i uszkodzonej nici, a ligacja lepkich końców - 3 cząsteczek: jednego końca, drugiego końca i ligazy)

-czy jesli dodamy do reakcji 50pmoli startera to mozemy otrzymać maksymalnie 50pmoli dwuniciowego produktu? TAK, hm... mowa tu o dodanie 2 starterow po 50 pmol, czy moze ze starterow jest lacznie 50 pmol? Bo jesli drugi przypadek, to otrzymamy 25pmol dsDNA

ODSTĘPSTWA OD SDS PAGE: (w sensie różnice w rozdziale)

-białka silnie zasadowe, wysokie pI - np lizozym jest silnie zasadowy, bo ma dużo Arg i Lyz i nawet po związaniu z SDS nie ma odpowiednio dużego ładunku ujemnego, dlatego mimo małej masy migruje w żelu jak większe białka.

-białka inherentnie nieuporządkowane (słabiej oddziałują z SDS) - ponieważ mają słaby rdzeń hydrofobowy (?)

-białka te uwidocznione są na żelu jako cięższe niż w rzeczywistości

Hm... Ktos ma zapisane jak Glutationo S-Transferaza jest wykorzystywana by uzyskac czyste rekombinowane bialko? Bo to bylo wydaje mi sie cos z chromatografia powinowactwa, ale nie mam pewnosci

Dokładnie, dzięki GST nasze białko jest “zaczepiane” na kolumnę na zasadzie powinowactwa.

Przyłączone białka znakowane GST mogą być wyeluowane ze złoża z glutationem poprzez

jedną z trzech metod. Najczęściej stosowaną metodą jest dodanie buforu zawierającego

wolny zredukowany glutation (nr kat. 78259), który łagodnie i konkurencyjnie wypiera GST

z glutationu. GST może być także oddysocjowany przy użyciu buforu o niskim pH (na

przykład 0,1M glicyna, pH 2.8). Inną metodą jest odcięcie białka fuzyjnego od

przyłączonego GST przy użyciu proteazy takiej jak Thermo Scientific Factor Xa (nr kat.

32521), co pozwala na odzyskanie białka.

Ok, dzieki! Czyli potem jak juz wymyjemy wszystko ze zloza, to samo bialko odcinamy Trombina. Ok, juz wszystko jasne dla mnie.

:)

1. czym rozni sie klonowanie ukierunkowane od nieukierunkowanego?

A to nie chodzi o to np. Że klonowanie ukierunkowane mamy wtedy, gdy zmieniamy materiał genetyczny w ściśle określony sposób (np. dodajemy plazmid do E.coli mający nowy gen), a nieukierunkowane, gdy wywołujemy mutację w sposób losowy, jak np. przy traktowaniu bakterii świetłem UV co tworzy mostki tymidynowe?

A nie chodzi o trawienie jednym lub większą ilością enzymów restrykcyjnych? też mi się tak wydaje

Tak. W przypadku klonowania nieukierunkowanego mamy do czynienia z 1 enzymem, w 2 sytuacji z 2.

GDY FRAGMENTY MAJĄ KOŃCE TĘPE:

-korzystamy z linkerów - krótki oligonukleotyd: linker+fr DNA--> ligacja → trawienie ER → cząsteczka o lepkich końcach danego ER

linkery muszą być w nadmiarze w stosunku do DNA

kłopoty z linkerami: istnieje obawa, że fr. DNA również ulegnie strawieniu na fragmenty przez ER. Problem możliwy do rozwiązania. Fragmenty te mają lepkie końce więc teoretycznie są łatwe do zligowania, ale z drugiej strony mogą być za krótkie i klops. Rozcięcie na małe fragmenty może mieć skutek w utracie informacji.

-sekwencje adaptorowe - posiadają zmodyfikowane końce 5’ → mamy 5’OH przy końcu kohezyjnym, dlatego sekwencje te nie wiążą się ze sobą, nie dochodzi do zligowania 2 adaptorów. Sekwencje mogą ze sobą oddziaływać, ale nie trzyma je wiązanie fosfodiestrowe.

- synteza ogonów - homopolimerów - do końców 3’ syntezowany jest np ciąg poliG.

fragment DNA+terminalna transferaza niewymagająca matrycy+dGTP

to samo z wektorem tylko zamiast poli G to komplementarnie poli C ;)

wada: długość produktu terminalnej transferazy nie jest nam znana, można przewidzieć ilość produktu na podstawie stężenia dNTP i czasu przeprowadzania reakcji wydłużania

MODYFIKACJE POTRANSLACYJNE BIAŁEK:

-acetylacja

-fosforylacja

-ubikwitynacja

-adenylacja

-sumoilacja

-glikozylacja

- metylacja

Spróbowałem napisać sobie szybki wzór na to ile Unitów potrzebujemy do strawienia restrykcyjnego określonej ilości DNA w określonym czasie:

Akt [U] = (długośćtest.DNA/długośćbadanego)*(nmiejsc cięcia badanego/nmiejsc cięcia test.)*(2,5*gdy_superskręcony)*(masa[ug]/czas[h])

Mi z obliczeń takie coś wyszlo, że poprawne, jednak fajnie by było, by ktoś też to sprawdził. A po za tym, czy ktoś spróbował stworzyć wzór ligacyjny, jak radziła ADL? Bo chciałbym porównać ze swoim.

Wzór do obliczania masy insertu potrzebnej do reakcji ligacji:

Masa insertu = (masa wektora/długość wektora) x (ni/nw) x długość insertu

Mnie trapią dwie kwestie z zadania z PCR gdzie mieliśmy EcoRI i NotI i 5 podpunktów.

1. W zadaniu 3 trzeba zaprojektować mieszaninę trawienną - chyba nie uważałam za dobrze i nie wiem jakie mamy stężenie tych enzymów. W tamtych ‘starych’ katalogach mieliśmy 10u/mikrolitr, albo HC które wynosiło 50u/mikrolitr. Tu natomiast są jakieś Cat.No i jest ilość unitów, a potem stężenie 8-12u/mikrolitrów - tak na pałę to bym wzięła z tego średnią i przyjęła 10u/mikrolitr, ale szczerze nie mam pojęcia. - chyba najlepiej przyjąć że 8, ale 10 też powinno być dobrze. A ja na pałę przyjęlam, że właśnie 50U/mikrolitr

2. Dotyczy podpunktu 1. a konkretnie słowa JEDYNY istniejący w wektorze kodon STOP. Nie bardzo go widzę. Jeżeli zachowamy ramkę odczytu to trafimy na ten jedyny kodon STOP, który gdzieś w odpowiednim miejscu się znajduje, my musimy tylko pamiętać żeby nie zmienić ramki odczytu.

Będę wdzięczna za każdą pomoc.

Tam nie ma kodonu stop, w tej widocznej sekwencji. Polecenie każe tylko trzymać się ramki odczytu, aby poprawnie wejść na kodon stop, który jest poza pokazaną sekwencją MCSu.

Czy ma ktoś zapisane i chciałby się podzielić własnymi słowami o tym, czym dokładnie jest nasz wklonowywany insert? Na ostatnich zajęciach Adel ładnie opisała ‘żebyście wiedzieli, co robiliśmy na zajęciach’.

z tego co pamiętam to jest to białko fuzyjne GST-EcRDBD, zwracała uwagę na fakt, że na żelu SDS-PAGE nie szukamy EcRDBD, bo go tam nie ma, jest związane z GST, dopiero po elucji na kolumnie mamy EcRDBD, czyli receptor ekdysteroidowy, a raczej jego domena wiążąca DNA.

JAKI WPŁYW MA SIŁA JONOWA W PRZYPADKU IZOLACJI PRODUKTU PO PCR (ĆW 3)?

Nie mam tego nigdzie zapisanego, ale wydaje mi się, że jeśli będzie zbyt niska siła jonowa, to będzie słabe przewodnictwo i elektroforeza będzie z dupy.

Źle chyba sformułowałam pytanie (na bank ;p) chodzi o to, że jak wymywamy z kolumny to nasze DNA tymi całymi buforkami, roztworem G, A itd. to na jakiej zasadzie to DNA jest otrzymywane. Słyszałam, że może być takie pytanie związne z siłą jonową, czyli jaki ona ma wpływ na wyeluowanie naszego DNA. Np. dajmy na to, że bufor G ma najmniejszą siłę jonową (bądź odwrotnie) i jaki to ma wpływ. Chyba, że źle to zrozumiałam i chodzi o tą kolumnę OSTATECZNĄ ;) z glutationem. Bo o tej chromatografii powinowactwa i sile jonowej to coś tam wyszperałam, zaraz wrzucę.

No to niezłe pytanie, dobrze nam pójdzie. Tylko, że te bufory mają zastrzeżoną zawartość, więc nawet nie wiemy jakie tam mogą być jony. Chociaż wydaje mi się teraz, jak dłużej o tym myślę, że ona coś mówiła o tym - zwłaszcza o roztworze G. Ale nie spisałam tego :/

No to klops ;p

a tu czasem nie chodzilo o to ze jak wymywamy DNA roztworem o niższej sile jonowej to znaczy ze DNA bylo zwiazane z kolumna na zasadzie wiazan hydrofobowych? a jesli bysmy cos wymywali roztworem o wiekszej sile jonowej to znaczy ze DNA bylo zwiazane z kolumienka na zasadzie oddzialywan jonowych.

Ok, mam coś takiego: (tu są ogólne wszystkie typy chromatografii, może się przyda)

ETAPY ROZDZIAŁU SUBSTANCJI Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI CHROMATOGRAFII JONOWYMIENNEJ

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych-metoda opiera się na różnicach we właściwościach hydrofobowych rozdzielanych cząsteczek białka. Rozdział odbywa się z wykorzystaniem złoża mającego hydrofobowe ligandy, które po przemyciu roztworem soli o dużej sile jonowej zostają silnie wyeksponowane. Naniesione na kolumnę białko, również w solwencie charakteryzującym się dużą siłą jonową, ma także wyeksponowane grupy hydrofobowe. Rozdział substancji polega na różnicowaniu siły oddziaływań hydrofobowych między nośnikiem a rozdzielanymi substancjami. Zmieniając gradientowo siłę jonową eluenta wymywa się z kolumny białka, w pierwszej kolejności te o bardzo słabych oddziaływaniach hydrofobowych. Metoda oddziaływań hydrofobowych jest bardzo przydatna zarówno w skali laboratoryjnej, jak i przemysłowej. Wadą metody jest konieczność odsalania przez dializę lub filtrację żelową.

Chromatografia odwróconej fazy-metoda ta, podobnie jak poprzednia, polega na różnicowaniu składników w zależności od właściwości hydrofilowo-hydrofobowych. Różnica między metodami polega na tym, że w tej metodzie stosuje się rozpuszczalniki organiczne, co także jest jej wadą. Jednak w powszechnej opinii metoda ta jest uznana jako najlepsza pod względem rozdzielczości. W pierwszej kolejności kolumna jest przemywana wodą zakwaszona kwasem octowym lub trifluorooctowym w celu odsłonięcia grup hydrofobowych zarówno nośnika, jak i składników rozdzielanych. Zwiększając następnie w eluencie zawartość rozpuszczalnika organicznego(acetonitrylu, metanolu lub innych), prowadzi się wymywanie coraz bardziej hydrofobowych białek. Towarzyszy temu przejście hydrofobowej cząsteczki zaadsorbowanej na nośniku do fazy rozpuszczalnika organicznego, od czego pochodzi nazwa metody. Metoda odwróconych faz z powodzeniem jest stosowana do rozdzielania niskocząsteczkowych peptydów i hormonów, a także-ze względu na selektywność i rozdzielczość-do sekwencjonowania białek i peptydów.

Chromatografia powinowactwa-w tej metodzie ligandy swoiste związane z nośnikiem łączą się tylko z odpowiadającymi im składnikami. Wymywanie składników związanych odbywa się przy użyciu roztworów o odpowiednio dużej lub małej kwasowości czynnej. Metoda ta ze względu na selektywność, jest stosowana w przemyśle farmaceutycznym, a także do separacji RNA, DNA, itp.

Zielony to kolor nadziei - może skoro była z nas tak zadowolona - to wykreśli pytania teoretyczne i zostawi same zadanka^^ albo udostępnijmy jej nasze pliki i pokażmy jak ładnie pracujemy ;P Wybaczcie spam, ale doprawdy mam już dość.

i jeszcze coś takiego :)

Zestaw do izolacji DNA genomowego opiera się na zdolności wiązania DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych.

DNA przechodząc przez złoże osiada na nim, podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą nie wiążąc się. Po wypłukaniu z kolumny resztek zanieczyszczeń, oczyszczone DNA wymywane jest z niej niskojonowymi buforami lub wodą i nadaje się do bezpośredniego wykorzystania bez konieczności precypitacji.

Znalazłam coś.. ze strony firmy produkującej te kolumienki.

Jako opis podali:

Zestaw do oczyszczania DNA po reakcjach enzymatycznych

specyfikacja

- materiał: złoże krzemionkowe

- maksymalna wielkość próbki: 150 µl

- pojemność złoża: 10 µg DNA

- roztwory do elucji DNA ze złoża: bufor TE, bufor Tris lub woda

- minimalna objętość elucji: 30 µl

- zastosowania: klonowanie, sekwencjonowanie, PCR

- efektywne oczyszczanie fragmentów DNA wielkości: 100 pz - 5 000 pz

Oczyszczanie kwasów nukleinowych z użyciem specjalnie do tego celu wyselekcjonowanych membran krzemionkowych jest szybkim, wygodny i ekonomicznym sposobem izolacji DNA i RNA. Zastosowana technika nie wymaga zastosowania czasochłonnych metod opartych na starych technologiach, takich jak: użycie metody ekstrakcji w układzie fenol-chloroform, precypitacji czy polimerów typu PEG. Zastosowana technologia membranowa pozwala na uniknięcie problemów z przenoszeniem drobinek krzemionki stosowanych w metodach z użyciem zawiesin krzemionki lub typowych złóż krzemionkowych. Oferowana gama produktów A&A Biotechnology opartych o technologię klasyczną pozwala na wydajną izolację DNA i RNA o wysokiej czystości.

Dużo lepsze wydajności izolacji DNA uzyskuje się jedynie z użyciem zestawów opartych o technologię AX.

Stąd wydaje mi się, że to co napisałaś: Zestaw do izolacji DNA genomowego opiera się na zdolności wiązania DNA do złóż krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chaotropowych. Jest kluczowe. A te wszystkie roztwory G A A1 to mają właśnie zapewniać wysokie stężenia, czy coś takiego, no a przez to jest wysoka siła jonowa.

AAA OK, już wiem (tak mi się wydaje :)), skoro ostatecznie przepłukiwaliśmy TE/wodą/cokolwiek to wymywaliśmy DNA z kolumny roztworem o najmniejszej (?) sile jonowej. Wcześniej “przytwierdzaliśmy” DNA do kolumny dzięki tym wysoko stężonym roztworom G, A.. wyższa siła jonowa → DNA na kolumnie, niska → DNA w eppendorfce ;) Im wyższa siła jonowa tym większe znaczenie mają oddziaływania nieelektrostatyczne, specyficzne. Więc najpierw używamy roztworów o wysokiej sile jonowej żeby te oddziaływania powstały między złożem w kolumnie i DNA, a potem wymywamy roztworami o zmniejszonej sile jonowej, przez zmniejszenie tych specyficznych oddziaływań.

Ale co do tych kolumn, to na tej stronie nie ma nic napisanego o tym. http://sklep-aabiot.com/pl/p/Clean-up-50-izolacji/76 Mnie się wydaje że to co napisałaś ma sens. Ta kolumienka bazuje na złożu krzemionkowym - to jest pierwsza ważna informacja. Dodajemy tego G, które ma dużą siłę jonową, bo ma duża zawartość soli chaotropowych i przez to (nie wiem dokładnie jak) ale DNA wiąże się do kolumny - a to co nie jest DNA, się nie wiąże i do odrzucami i pisaliśmy wtedy - tu nie powinno być DNA. Roztwór A1 opisują jako roztwór do płukania - właściwie nie wiem co ono dokładnie ma zrobić, ale może oprócz tego że nasze DNA związało się z kolumną to coś jeszcze a ten roztwór A1 ma to trochę odmyć - tylko nie wiem jaki może być ten czynnik selekcjonujący, że DNA zostanie w kolumnie a reszta się odczepi. Chyba, że... może być tak że A1 odpłukuje G, przez co będzie się zmniejszała zawartość soli, przez co oddziaływanie kolumna-DNA będzie słabsze. A na koniec dajemy TE, które ma niewielką zawartość tych soli chaotrpowych (albo nie ma ich wcale?) i DNA odpłukuje z kolumny, a my mamy DNA razem z TE gotowe do przechowania?

Może ten G ma największą siłę jonową , a kolejno dodawane roztwory coraz mniejszą.

Jeszcze mam coś takiego :D

W tej metodzie izolacji plazmidowego DNA wykorzystujemy powinowactwo DNA do złoża krzemionkowego w obecności soli chaotropowych, dlatego do naszych próbek dodajemy 600 µl roztworu G. Jest to 8M chlorowodorek guanidyny, ułatwiający wiązanie DNA do złoża. Całość przenosimy na kolumnę do oczyszczania plazmidowego DNA i zawirowujemy.

To potwierdza tylko ten roztwór G, że jest on potrzebny do tego żeby złoże związało DNA. No a ten roztwór A1.. to nie wiem. Ale jak nie znajdę nic więcej to tak napiszę jak wyżej.

Ponieważ DNA związało się ze złożem, supernatant wylewamy, a na kolumnę nanosimy 500 µl roztworu A(lub 96% EtOH). Wirujemy, znów wylewamy superntant, bo DNA dalej pozostaje związane z kolumną i ponownie płuczemy kolumnę 300 µl roztworu A.

f) Po tym drugim płukaniu osuszamy dokładnie końcówkę kolumny bibułką i przenosimy ją do nowej probówki eppendorfa, gdzie nastąpi elucja DNA przy użyciu TE w ilości 60 µl (podgrzane do temp. ok. 70oC, żeby zwiększyć jego moc elucyjną). Inkubujemy jeszcze przez 5 min. w temp. pokojowej i zawirowujemy. W probówce mamy nasze DNA gotowe do dalszych analiz.

[na podstawie zestawu do izolacji plazmidowego DNA firmy A&A Biotechnology].

W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji, natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan potasu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci

serowatego osadu.

Wymywanie DNA z kolumny przez TE bądź wodę → zaburzenie oddziaływań wodorowych i hydrofobowych.

Ale dalej mnie męczy to EcRDBD, bo jakoś przysnęłam całkowicie pod koniec kiedy o tym mówiła.

Wiele nie powiedziała. To było wtedy kiedy pytałą nas z receptorów jądrowych? Tak, mówiła coś o N końcu i w ogóle, właściwie to nie wiem co jeszcze.

To o N końcu było do NTD, bo nie wiem po co ktoś jej przypomniał o tej publikacji... EcR to receptor jądrowy, DBD domena wiążąca DNA. AAAA już wiem, z tym N końcem mogło jej chodzić o to, że nasze GST jest na N końcu EcRDBD. Gdyby GST było za polilinkerem to byłoby na końcu C ;)

Ekdyzon, ekdyson, ekdysteroid, hormon linienia – steroidowy hormon, produkowany przez larwy i poczwarki stawonogów (zooekdyson) oraz syntetyzowany przez wiele roślin (fitoekdyson).

Zooekdysony są wydzielane przez gruczoły protorakalne (przedtułowiowe) owadów, narząd Y skorupiaków lub rzadziej przez jajniki. Gruczoły protorakalne wydzielają α-ekdyzon, który w wyniku przemian w ciele tłuszczowym zostaje przetworzony w β-ekdyzon, powodujący wydzielanie płynu linienia przezkomórki naskórka.

Rośliny wytwarzają ekdysony w obronie przed atakami szkodników. Fitoekdysony mają zdolność zmieniania metabolizmu, wzrostu i rozwoju owadów. Wykazują większą aktywność biologiczną niż zooekdysony. Są od nich bardziej trwałe[2].

A czy moglby ktos krotko opisac proces polimeryzacji akrylamidu?i co po kolei sie dodaje?

w instrukcji z biochemii powinno być nawet z rysunkiem