Sprawozdanie z laboratorium biochemii.

Ćwiczenie 7. Metabolizm drobnoustrojów.

Zadanie 1. Oznaczanie aktywności dehydrogenazowej drobnoustrojów testem TTC.

Wykonanie: do czterech probówek zawierających bufor Tris i zawiesinę drobnoustrojów dodano kolejno: roztwór glukozy, sacharozy, skrobi i NaCl, probówka z roztworem NaCl została umieszczona w łaźni wodnej, a po pięciu minutach została schłodzona w strumieniu zimnej wody. Do każdej z czterech probówek dodano roztworu TTC i umieszczono na 30 minut w termostacie o temperaturze 37˚C.

	Osad czynny	Osad czynny adaptowany	Drożdże	Bakterie
skrobia	-	++	+	+++
sacharoza	+/-	++++	+++	+++
glukoza	+	+++	++	+++

Obserwacje i wnioski :intensywność zabarwienia na kolor czerwony jest proporcjonalna do aktywności dehydrogenazowej drobnoustrojów. Najwyższą aktywność dehydrogenazową wykazał osad czynny adaptowany oraz bakterie, najmniejszą osad czynny. Brak aktywności dehydrogenazowej w osadzie czynnym dla skrobi i sacharozy może świadczyć o nie przeprowadzeniu przez obecne w nim szczepy rozkładu cukrów na glukozę.

Zadanie 2. Wykrywanie aktywności katalazowej drobnoustrojów.

Wykonanie: do dwóch probówek dodano zawiesinę drobnoustrojów, a następnie jedną z nich (kontrolną) włożono do łaźni wodnej, a po pięciu minutach schłodzono ją w strumieniu wody. Do probówek dodano wodę utlenioną.

Obserwacje i wnioski: w każdej probówce zawierającej drobnoustroje po dodaniu wody utlenionej doszło do szybkiej reakcji z wydzieleniem tlenu, świadczy to o tym, że osad czynny, osad czynny adaptowany, drożdże oraz bakterie wykazały aktywność katalazową, w probówkach kontrolnych reakcja przebiegała mniej intensywnie, ze względu na denaturację enzymu –katalazy.

Zadanie 3. Wykrywanie aktywności oksydazowej drobnoustrojów

Wykonanie: do dwóch probówek z osadem czynnym, z czego jedna została umieszczona w łaźni z wrzącą wodą na 5 minut, dodano kilka kropel pirokatechiny i inkubowano w 40˚C przez 30 minut.

	Osad czynny	Osad czynny adaptowany	Drożdże	Bakterie
Akt. oksydazowa	+	+/-	-	-

Obserwacje i wnioski: pojawienie się brunatnej barwy roztworu świadczy o aktywności oksydazowej drobnoustrojów, w wyniku utlenienia pirokatechiny powstaje o-benzochinon, który ulega spontanicznej polimeryzacji z wytworzeniem ciemno zabarwionych barwników melaninowych. Jedynie osad czynny i osad czynny adaptowany wykazał aktywność oksydazową, co świadczy o obecności bakterii tlenowych.

Utlenianie pirokatechiny przez oksydazy, z powstaniem o-benzochinonu.

Zadanie 4. Badanie pozostałych aktywności drobnoustrojów.

	Osad czynny	Osad czynny adaptowany	Drożdże	Bakterie
Bulion	+	+	+	+
Bulion z KNO3	+	+	-	+
2% sacharoza	-	-	-	-
Eijkman	+	+	+	+
Żelatyna	+	+	-	-
Agar, octan ołowiu	+	-	-	-
Mocznik	+	-	-	+

• Bulion: każdy drobnoustrój dał pozytywny, czyli zmętnienie, świadczy o rozroście drobnoustrojów i korzystanie z zawartych w bulionie substancji odżywczych,

• Bulion z KNO₃: drożdże nie dały pozytywnego wyniku, co świadczy że nie mają zdolności do denikryfikacji,

• 2% sacharoza: żaden z drobnoustrojów nie ma zdolności do przeprowadzania fermentacji masłowej,

• Podłoże Eijkmana: wszystkie drobnoustroje wykazały zdolność do fermentacji laktozy, wynik pozytywny drożdży świadczy o ich zanieczyszczeniu przez inne mikroorganizmy,

• Upłynnienie żelatyny: zdolność tą wykazały osady czynne, których bakterie wykazują aktywność proteazową,

• Agar z octanem ołowiu: jedynie w miejscu wkłucia osadu czynnego pojawił się czarny osad, ponieważ tylko bakterie z osadu czynnego mają zdolność do wytwarzania H₂S, który reagując z octanem ołowiu tworzy czarny osad PbS,

• Podłoże z mocznikiem (aktywność ureazowa): pozytywny wynik dał osad czynny oraz bakterie, oznacza to, że zawarte bakterie wykazują aktywność ureazową polegającą na hydrolizie mocznika z wytworzeniem amoniaku, alkalizującego roztwór.