SPRAWOZDANIE Z BIOCHEMII

KWASY NUKLEINOWE

Kwasy nukleinowe to związki wielkocząsteczkowe, które występują we wszystkich żywych komórkach głównie w postaci nukleoprotein (białka złożonego). Odgrywają one zasadniczą rolę w przekazywaniu cech dziedzicznych i kierowaniu syntezą białek, czyli reakcji podczas której następuje łączenie się prostych substratów, z których powstaje jeden bardziej złożony produkt główny.

Kwasy nukleinowe wywodzą swoją nazwę od łacińskiej nazwy jądra komórko­wego - nucleus, gdzie po raz pierwszy stwierdzono ich obecność. W 1869 roku został odkryty przez Mieschera kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) w plemnikach łososia. Ogromny postęp badań nad kwasami nukleinowymi datuje się dopiero od połowy XX wieku, kiedy w 1944 roku Avery, MacLeod i McCarty wykazali po raz pierwszy, że DNA zawiera informację genetyczną. W 1952 roku Brown i Todd określili sposób powiązania nukleotydów w cząsteczce, a w 1953 roku Watson i Crick zaproponowali model DNA. W ciągu ostatnich 40 lat dokonano wielu odkryć w zakresie budowy i funkcji kwasów nukleinowych, jak również przeprowadzono wiele syntez fragmen­tów DNA. Badania te przyczyniły się do rozwoju takich dyscyplin naukowych, jak: genetyka, wirusologia, bakteriologia i wielu innych.

Kwasy nukleinowe to jedne z najważniejszych związków chemicznych w organizmach żywych. Zasadniczo są dwa rodzaje kwasów nukleinowych: kwas rybonukleinowy (RNA) oraz kwas deoksyrybonukleinowy (DNA). Oba mogą występować pod postacią zarówno pojedynczej jak i podwójnej nici, przy czym zazwyczaj DNA tworzy nić podwójną, a RNA pojedynczą. Kwasy nukleinowe przechowują informację genetyczną organizmu oraz pośredniczą w produkcji białek zgodnie z zasadami kodu genetycznego. Kwas DNA jest substancją, w której jest zapisana substancja genetyczna. Na terenie komórki występuje głównie w jądrze, ale również w chromosomach, chloroplastach i mitochondriach, natomiast kwas RNA znajduje się w cytoplazmie, rybosomach i w jąderku - bierze udział w „tłumaczeniu” informacji genetycznych na język białek.

Monomer kwasu nukleinowego składa się z cząsteczki pentozy, dla RNA rybozy, dla DNA deoksyrybozy, zasady purynowej lub pirymidynowej przyłączonej do pierwszego atomu węgla pentozy, oraz reszty fosforanowej, przyłączonej do trzeciego oraz piątego atomu węgla dwóch sąsiednich pentoz polimeru.

Pentozy

Obecność cukrów w kwasach nukleinowych stwierdzono bardzo dawno. W roku 1909 w pracowni Levena w Nowym Yorku znaleziono w kwasie nukleinowym otrzymanym z drożdży cukier D-rybozę. Tamże w kilkanaście lat po tym odkryciu ustalono, że kwas deoksyrybonukleinowy zawiera 2-deoksyrybozę. Obie odmiany pentoz występują w kwasach nukleinowych w postaci β-furanozowej. Atomy węgla wchodzące w skład pierścienia pentozy numerowane są cyframi ze znaczkiem ‘ (prim) dla odróżnienia od numeracji atomów w zasadach purynowych i pirymidynowych.

Zasady purynowe

W skład kwasów nukleinowych wchodzą heterocykliczne związki dwupierścieniowe. Fisher nazwał te związki „ciałami purynowymi” (po niemiecku purinkörper od łacińskiego purum unicum: acidum unicum to łacińska nazwa kwasu moczowego). W purynie, podstawowym związku tego typu można wyróżnić pierścień pirymidynowy i imidazolowy:

D-ryboza posiada grupę hydroksylową przy drugim atomie węgla, natomiast 2-deoksyryboza nie posiada takiej grupy przy tym atomie węgla.

Zasadami są adenina, guanina, cytozyna oraz uracyl (w RNA) lub tymina (w DNA).

Puryna pirymidyna imidazol

Wolnej puryny w przyrodzie nie znaleziono, znane są natomiast pochodne aminowe i hydroksylowe puryny:: 6-aminopuryna nazywana adeniną, otrzymana po raz pierwszy z trzustki przez Koszela oraz 2-amino-6-hydroksypuryna nosząca nazwę guaniny, znaleziona już w 1844 roku w guanie, naturalnym nawozie powstałym głównie z ptasich ekskrementów. Stąd pochodzi nazwa guaniny.

Adenina Guanina

Zasady pirymidynowe

W kwasach nukleinowych występują głównie trzy zasady pirymidynowe. Są to: cytozyna, czyli 2‑hydroksy-4-aminopirymidyna, występująca w obu odmianach kwasów nukleinowych, uracyl, będący 2,4-dihydroksypirymidyną, składnik RNA oraz tymina, czyli 5-metylouracyl, występująca tylko w DNA.

Wykonanie ćwiczenia:

1. Wyodrębnienie nukleoproteidów z drożdży.

Około 20 g drożdzży rozetcieramy dokładnie z piaskiem w moździerzu z dodatkiem 1 ml eteru w celu rozbicia komórek i z tą samąilością H20 destylowanej. Następnie do moździerza dodajemy około 50-70 cm3 0,4% roztworu NaOH i rozcieramy zawartość przez okres20minut. Ekstrakt nukleoproteidów owirowujemy.

1. Hydroliza kwasów nukleinowych.

Z otrzymanego w części I ekstraktu nukleoproteidów odmierzamy 25 cm3 i przenosimy do kolby. Następnie dodajemy 30 cm3 20% H2SO4 i ogrzewamy przezokoło 40 minut pod chłodnicą zwrotną w temperaturze łagodnego wrzenia.

1. Wykrywanie komponentu białkowego:

1. Reakcja biuretowa z niezhydrolizowanym ekstraktemnukleoproteidów.

Do około 1 cm3 ekstraktu dodajemy 1 cm3 10% NaOH, zawartość mieszamy, a następnie kroplami dodajemy 1 cm3 0,1% CuSO4.

Wniosek: Zaobserwowaliśmy zmianę zabarwienia roztworu na kolor jasno fioletowy.

1. Reakcja biuretowa ze zhydrolizowanym ekstraktem nukleoproteidów.

Do około 1 cm3 zhydrolizowanego ekstraktu dodajemy 2 cm3 10% NaOH, zawartość mieszamy.Kolejnie dodajemy kroplami 1 cm3 0,1 CuSO4.

Wniosek: Roztwór pozostał bezbarwny.

1. Wykrywanie składników budowy kwasów nukleinowych.

1. Wykrywanie zasad azotowych:

Do 1 cm3 hydrolizantu dodajemy 2 cm3 roztworu NH4OH. Roztwór przesączamy do klarowności, następnie wprowadzamy 3 cm3 amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra.

Wniosek: Wytrąca się osad nierozpuszczalnych w amoniaku soli srebrowych puryn zmieniających barwę pod wpływem światła.

1. Wykrywanie kwasu ortofosforowego:

1 cm3 hydrolizantu zobojętniamy za pomocą NH4OH. Kolejnie dodajemy 1 cm3 stężonego HNO3 i 4 cm3 roztworu molibdenianiu amonu. Zawartość probówki ogrzewamy do wrzenia.

Wniosek: Wytrąca się żółty osad fosforomolibdenianu amonu.

1. Wykrywanie cukrów:

Do 1 cm 3 hydrolizantu dodajemy 4-6 kropli 2% α-naftolu, a następnie ostrożnie wlewamy, po ściance probówki stężony kwas siarkowy H2SO4.

Wniosek: Pojawia się pierścień na granicy faz, o kolorze ciemnozielonym.

1. Wykrywanie 2-D-deoksyrybozy:

Do dwóch probówek wlewamy po 1 cm3:

• 1- hydrolizantu,

• 2- 0,05% roztworu 2-D- deoksyrybozy.

Następnie do probówek dolewamy po 2 cm3 difenyloaminy i ogrzewamy na łaźni wodnej około 10 minut.

Wniosek: Pojawia się niebieski kompleks difenyloaminy z 2-D- deoksyrybozą. W pierwszej probówce nie zauważyliśmy zmiany zabarwienia, pozostała ona bezbarwna. W drugiej probówce nastąpiła zmiana koloru roztworu na granatowo-niebieską.

1. Ilościowe oznaczenia DNA.

Do dwóch probówek pobieramy po 2 cm3:

• 1- hydrolizantu DNA,

• 2- roztworu wzorcowego DNA w 0,4% NaOH o stężeniu 0,005%.

Do probówek dodajemy następnie po 4 cm3 difenyloaminy, po czym ogrzewamy na wrzącej łaźni wodnej przez około 10 minut. Po ostudzeniu roztworów mierzymy ich absorbancję przy długości fali 600 nm. Wzorcem była woda, której absorbancja wody wynosi 0 nm.

Obliczamy stężenie DNA w hydrolizacie według wzoru:

C _{próby badanej}= A _{próby badanej}/ A _wzorca x C _wzorca

Gdzie: C- stężenie,

1. Absorbancja.

W probówce 1 absorbancja przy długości fali wynosiła 0,153 nm, a w probówce 2 - 0,045 nm.

Wnioski: