Jarosław Grządziel
grupa: poniedziałek, godz. 8.00
Sprawozdanie z ćwiczenia nr 7

Znaczenie centralnego atomu metalu

pierścienia porfirynowego cząsteczki chlorofilu.

Chlorofil to bardzo powszechny barwnik roślinny zlokalizowany w chloroplastach. Poza komórkami roślinnymi może także występować w fotosyntetyzujących bakteriach, glonach a nawet - co jest rzadkością - u zwierząt. Chlorofil jest kompleksem magnezu
z czterema pierścieniami pirolowymi, połączonymi ze sobą w pozycjach 2 i 5 mostkami metinowymi (=CH-) tworzącymi układ porfiryny. Do czwartego pierścienia pirolowego dołączony jest fitol (alkohol). Wyróżniamy kilka rodzajów chlorofilu a, b, c, d oraz g, różnią się one podstawnikiem w bocznych pozycjach szkieletu porfirynowego. W roślinach wyższych występują jedynie chlorofil a (przy drugim pierścieniu pirolowym posiada grupę -CH₃) oraz chlorofil b (przy drugim pierścieniu pirolowym posiada grupę -CHO).

Chlorofile wykazują zdolność absorpcji światła widzialnego w zakresie 370-760 nm,
a następnie wykorzystaniu tej energii co ma ogromne znaczenie w procesach fazy jasnej fotosyntezy. Każdy z chlorofili ma swoje widmo absorpcji z dwoma maksimami zlokalizowanymi odpowiednio w zakresie długości fali dla światła niebieskiego oraz czerwonego. Barwniki chlorofilowe charakteryzuje także zdolność emisji pochłoniętej energii w postaci fluorescencji.

Chlorofile bardzo łatwo ulegają rozpadowi pod wpływem działania kwasów oraz zasad. Stosunkowo łatwe jest podstawienie centralnego atomu magnezu innymi jonami metali dwuwartościowych. Prowadzi to do zmiany barwy cząsteczki a także zwiększenia jej stabilności. Zjawisko to zostało wykorzystane w przemyśle.

1. Przygotowanie ekstraktu barwników.

Rozdrobniony materiał roślinny utarliśmy z 40 ml 100% acetonu. Otrzymaną masę przesączyliśmy przez watę umieszczoną w lejku. Odebraliśmy 1ml roztworu do osobnej probówki i podpisaliśmy jako roztwór A (odstawiony w ciemne miejsce). Wykorzystana została właściwość chlorofilu polegająca na jego łatwym rozpuszczaniu w rozpuszczalnikach niepolarnych.

1. Otrzymywanie feofityny

Pozostały przesącz otrzymany w punkcie 1 przenieśliśmy do zlewki i dodaliśmy 0.6ml stężonego HCl. Powstał brunatno brązowy roztwór. Odebraliśmy 1 ml roztworu do nowej probówki i podpisaliśmy jako roztwór B który następie odstawiliśmy w ciemne miejsce. Brunatno-brązowy roztwór to feofityna powstała na skutek wymiany jonu magnezu na dwa jony wodoru pochodzące z dodanego kwasu.

Określanie stężenia feofityny:
Do suchej probówki wlaliśmy 2 ml 80% acetonu oraz dodaliśmy 200µl (0.2ml) feofityny. Następnie zmierzyliśmy absorbancję przy użyciu spektrofotometru:

- dł. fali 653 nm absorbancja 0,089

- dł. fali 665 nm absorbancja 0,156

Obliczenie stężenia feofityny ze wzoru:

C_fec=(22.42 ∙ A₆₆₅ – 6.81 ∙ A₆₅₃ ) ∙10 – po uwzględnieniu rozcieńczenia

C_fec=(22.42∙ 0,156 – 6.81 ∙ 0,089) ∙ 10 = (3,5 – 0,6) ∙ 10 = 29 µg/ml

Wniosek: Stężenie feofityny w badanym preparacie wynosi 29 µg/ml

1. Otrzymywanie Cu-porfiryn

Do zlewki z brunatnym roztworem feofityny dodaliśmy kroplami roztwór 0.2 M CuSO₄ do ponownego uzyskania zielonej barwy. Następnie roztwór przesączyliśmy przez sączek
z bibuły, odebraliśmy 1 ml substancji do osobnej probówki i podpisaliśmy jak roztwór C (także został odstawiony w ciemne miejsce podobnie jak roztwór A i B).

Wniosek: Ponownemu wystąpieniu zielonego zabarwienia roztworu towarzyszyło podstawienie atomu miedzi w centrum pierścienia porfirynowego feofityny.

1. Rozdział barwników

Resztę przesączu z punktu 3 przenieśliśmy do rozdzielacza, dodaliśmy 2 ml benzyny, 1 ml wody destylowanej a następnie delikatnie wymieszaliśmy. Po kilku minutach od wymieszania utworzyła się górna warstwa benzynowa o ciemnozielonym zabarwieniu, którą poddaliśmy rozdziałowi chromatograficznemu na płytce powleczonej żelem krzemionkowym. Płytkę z naniesionym przesączem barwników wstawiliśmy do kamery zawierającej rozwijacz (benzyna-izopropanol-woda w stosunku 100:10:0.25). Rozwijacz został wlany w takiej ilości aby zwilżyć płytkę z żelem do wysokości 1 cm. Rozwijacz podsiąkając do góry pociągał za sobą poszczególne barwniki w kolejności od stopnia ich polarności. Rozdział został zakończony gdy pojawiły się wyraźnie rozdzielone poszczególne pasma barwników.

Wniosek: Jako pierwsza (patrząc od góry płytki) wędrowała Cu-porfiryna a odpowiadająca chlorofilowi a (pasmo niebieskozielone), druga w kolejności była Cu-porfiryna b odpowiadająca chlorofilowi b (barwa żółtozielona).

1. Wykreślanie widm absorpcyjnych barwników.

Płytkę z rozdzielonymi pasmami barwników wysuszyliśmy przez kilka minut na stole. Pasma Cu-chlorofilu a oraz Cu-chlorofilu b zdrapaliśmy i wsypaliśmy do oddzielnych suchych probówek. Po całkowitym odparowaniu rozwijacza do każdej z nich dodaliśmy 4 ml 100% acetonu. Probówki wstrząsaliśmy aż do całkowitej ekstrakcji barwników. Zawiesinę przesączyliśmy przez sączek z bibuły filtracyjnej nasączonej rozpuszczalnikiem. Klarowne ekstrakty użyliśmy do wykreślenia krzywych widm absorpcji barwników za pomocą spektrofotometru.

Barwnik	Zakres długości absorbowanej fali [nm]	Barwa światła	Maksimum długości fali absorbowanej przez chlorofil [nm]
Cu-chlorofil a	370-450; 620-670	Fioletowa; czerwona	410; 650
Cu-chlorofil b	370-460; 600-680	Fioletowa/niebieska; czerwona	440; 650

Wniosek: Cu-porfiryny podobnie jak chlorofile mają zdolność absorpcji promieniowania w zakresie światła widzialnego 370-760nm. Maksima absorpcji także obejmują pasmo światła niebieskiego oraz czerwonego. Różnią się jednak wartością dla maksimum absorpcji. Wynika z tego iż metaloporfiryny pochłaniają światło ale słabiej niż chlorofile.

1. Obserwacja fluorescencji barwników roślinnych.

Trzy ekstrakty otrzymane na różnych etapach doświadczenia obserwowano pod lampą UV.

Wniosek: Roztwór A zawierający chlorofil przy świetle UV wykazuje fluorescencję czerwoną podobnie jak roztwór B czyli feofityna która również przy UV świeci na czerwono. W przypadku roztworu C którym jest Cu-porfiryna, nie wykazuje ona fluorescencji w świetle UV. Dzieje się tak z powodu braku absorpcji a w rezultacie braku emisji światła przez tak zmodyfikowany układ porfirynowy.