WD1

Organizmy gen zmodyf GMO nazywamy:

-drobnoustroje

-rosliny

-zwierzeta

stworzone w wyniku modyfikacji genetycznej.

GMO: org które zawieraja w swoim genomie obce geny pochodzące z obcego organizmu, przenoszony gen to trans gen a przekształcony organizm to organizm transgeniczny.

Cele produkcji GMO:

-produkowanie większej ilości żywności w przeliczeniu na jednostke powierzchni

-produkowanie większej ilości żywności z mniejszym uzyciem energii

Cele modyfikacji drobnoustrojów:

-wytwarzanie nowych enzymów

-zwiazków biologicznie aktywnych

-usuwanie szkodliwych substancji ze środowiska (biremediacja)

-zrodlo genów ( geny Bacilluss thuringiensis-odpornosc roslin na owady)

Cele modyfikacji roslin:

1. poprawa wlasciwosci agronomicznych (z pkt widzenia producenta zywnosci)

-odpornosc na choroby

-odpornosc na szkodniki
-odpornosc na dzialanie srodkow chwastobójczych

-odpornosc na czynniki abiotyczne: naturalne i antropogeniczne.

Czynniki abiotyczne naturalne:

-nadmiar promieniowania

-niska temperatura

-wysoka temp

-deficyt wody

-zasolenie

-dlugotrwale deszcze

Czynniki abiot antropog:

-wzrost temp

-zwiekszenie promieniowania UV-B i UV-A

-gazowe zanieczyszczenie atmosferyczne

-kwasne deszcze, mgły

-metale ciezkie (Cd, Pb, Hg)

-pestycydy, fungicydy, herbicydy

2. z pkt widzenia konsumenta (poprawa jakości żywności)

-wzbogacenie żywności w składniki podnoszące ich wartość odzywczna

-usuwanie substancji szkodliwych i niepozadanych

-poprawa cech funkcjonalnych związanych z procesami przetwórczymi

-produkcja substancji biologicznie i farmakologicznie czynnych na potrzeby medycyna i weterynarii

Cele modyfikacji zwierzat:

-szybszy przyrost masy ciała

-zwiekszenie wydajności mlecznej

-produkcja cennych lekow dla ludzi

-ksenotransplantacje

SYSTEM PRAWNY każdy sam definiuje modyfikacje genetyczne i GMO zgodnie z własnym interesem politycznym.

Def GMO polska Ustwa o org gen mody Dz. U. Nr 76, poz. 811 z dnia 22.06.2001r.: to organizm inny niż org człowieka, w którym material genetyczny zostal zmieniony w sposób niezacchodzacy w warunkach naturalnych wskutek krzyzowania lub naturalnej rekombinacji w szczególności przy zastosowaniu:

-techniki rekombinacje DNA z uzyciem wektorow w tym tworzeniu materialu genetycznego poprzez wlaczenie wirusa, plazmidu lub każdego innego wektora czasteczek DNA wytworzonych poza organizmem biorcy, w którym w warunkach naturalnych nie występują ale w którym sa zdolne do ciągłego powielania

-technik stosujących bezpośrednie wlaczenie materialu dziedzicznego przygotowanego poza organizmem a w szczególności: mikroiniekcji, mikroiniekcji i mikrokapsulkowania.

-metod niewystępujących w przyrodzie dla polaczenia materialu genetycznego z co najmniej dwoch roznych Komorek, gdzie w wyniku zastosowanej procedury powstaje nowa Komorka zdolna do przekazywania swego materialu genetycznego odmiennego od materialu wyjściowego Komorkom potomnym.

EC Novel Foods Regulation:

-zywnosc GM:

1 zywnosc I jej skladniki zawierajace lub bedace org modyfikowanymi genetycznie (pomidory, przetwory pomidorowe, truskawki, lody truskawkowe, prod z lizyna)

2 zywnosc i jej skl produkowane z GMO lecz nie zaw GMO (olej rzepakowy, majonez, cukier)

Canada def GMO

Produkt jest okreslany jako GMO jeżeli zawiera pewna ceche wczesniej niewystepujaca w danym gatunku, nawet jeśli powstala w wyniku tradycyjnych metod hodowlanych.

ZNAKOWANIE ZYWNOSCI GMO

USA: znakowaniu podlega tylko żywności rozniaca się skladem chemicznym od odpowiednika konwencjonalnego

UE: znakowaniu podlegaja wszystkie produkty spozywczze które zostaly uzyskane metodami niekonwencjonalnymi w tym za pomoca inżynierii genetycznej.

Rozporzadzenie komisji europejskiej nr 258/97 dot nowej żywności: żywnośc wyprodukowana z GMO lub zaw w swym skladzie GMO powinna być oznakowana:

1 zywnosci jednoskladnikowa: na etykiecie powinno być zamieszczone np. wyprodukowana z genetycznie modyfikowanej kukurydzy, w kolorze transparentnym

2 zywnosc wieloskladnikowa: słowa np. wyprodukowano z genetycznie zmodyfikowanej kukurydzy powinny pojawic się na liscie składników zaraz po nazwie danego składnika, slowa te mogą pojawic się jako przypis do listy składników z odnośnikiem w postaci gwiazdki. gwiazdka powinna być przy danym składniku a w przypisie może być skrot”genetycznie modyfikowana” slowa występujące w przypissie musza mieć taka sama czcionke co slowa w skladzie.

Znakowanie żywności GM: obowiązkowemu znakowaniu podlegaja wszystkie produkty oprocz tych które zawieraja poniżej 1% przypadkowego zanieczyszczenia które zawiera nowe lub genetycznie zmodyfikowane białko lub DNA.

Pierwsze odmiany transgeniczne: GMO roślinne po raz pierwszy wprowadzono na skale produkcji w Chinach na początku lat . Komercjalizacja upraw GM roslin jest od 15lat: kukurydza, soja, bawelna, rzepak.

Ilosc proponowanej żywności GM:

USA: 44 produkty spożywcze

Kanada: 42

GBR: 19

Odmienne stanowisko krajów UE i Ameryki Pln.

UE: bardzo Duzy sprzeciw spoleczenst do żywności GM, mieszkancy europy nie odczuwaja potrzeby większej produkcji żywności, nie chca akceptowac technologi z USa , boja się intensyfikacji rolnictwa

USA i kanada: do 2000r brak zainteresowania ze strony społeczeństwa żywności GM

OBAWY związane z wprowadzeniem GMO:

-techniczne które dot konstruowania trans genów

-medyczne

-ekologiczne

-watpliwosci natury etycznej.

WD2

Genom- to pełny zestaw informacji genetycznej organizmu

Gen- odcinek DNA jednostki informacji biologicznej

Gen –1 białko

Wielkość genomu- liczba par zasad wchodzących w skład nukleotydów

-Człowiek 3200 Mpz

-Zwierzęta 180-2500 Mpz

-Rośliny 125-466 Mpz

-Bakterie 0,6-9 Mpz

-Archeony 1,7 Mpz

Ludzki genom zwiera okoolo 40 000 genów. Sekwencje kodujące to około 25%

Zwierzęta – 13000 –30000 genów 30-50%

Rośliny 20 000-50 000 genów 45-50%

Bakterie kilkustet do dilku tyś. (85-89%)

Budowa genu

Introny- jednostki nie kodujące, są usuwane podczas translacji

Eksony- jednostki kodujące

Bakterie nie potrafią odczytać i uaktywnić genów zawierających introny, czyli eukariotycznego genu

Gen bakteryjny może być odczytany i uaktywniony w organizmie eukariotycznym

Promotor –uaktywnia gen, rozpoczyna translację

-Przyłącza polimerazę RNA II

-Przepisywanie sekwencji DNA na sekwencję nukleotydów mRNA

Geny aktywowane są przez aktywatory:

-Hormony i cytohiny

-Tylko na swoistych etapach rozwoju organizmu

-W określonych dojrzałych tkankach (insulina w trzustce)

Promotor konstytutywny- gen zawsze aktywnie produkuje dane białko

-Silny promotor k......- powoduje ciągłe przepisywanie genu i duże ilości wytwarzanego białka

-słaby promotor k......- powoduje ciągłe przepisywanie genu i małe ilości wytwarzanego białka

zadania terminatora :

-sekwencja kończąca gen

-wiele sekwencji terminatorowych jest prawie zawsze wymiennych między genami i gatunkami

Jak uzyskujemy gen do transmisji w inżynierii genetycznej :

-informacja genetyczna- przepis na gen z banku genów

-bank genów- dost informacji na temat sekwencji genu zasad DNA

-to między narodowe bazy danych sekwencji zasad Dna i związanych z nimi sekwencji aminokwasów

-Gen bank

Pozyskiwanie genu :

1. skonstruowanie fizyczne Dna- maszyna genowa  sztuczna synteza DNA wg przepisu z banku

2. proces inżynierii odwróconej – wyizolowanie oczyszczenie białka , określenie struktury 1-rzedowej z sekwencji aminokwasów białka , poszukiwanie sekwnecji zasad DNA

3. zakup genu z firm komercyjnych dysponujących genami ATTC –American Culture Celection Wirgiinia USA

4. wykorzystanie inf z baków do synteazy primerów i zasad technika PCR:

- primery ( krótkie odcinki DNA komplementarne do końców fragmentu DNA który chcemy powielić 8-24

nukleotydów ) stosowane do wyłapywania homologicznego genu z gnomem interesującego gatunku i techniką

- techniką PCR powiela się gen

PCR- reakcja łańcuchowa polimerazy :

-powtarzalna dwukierunkowo synteza DNA , polegająca na wydłużeniu primerów homologicvznych do

matrycy DNA

-umożliwia powielenie ilości genu

-wymagania : termocykler, odczynniki, primery, polimerazaa DNA

Technika PCR

Trzy cyklicznie powtarzające się etapy :

1. denaturacja matrycy DNA

2. hybrydyzacja primeru z matrycą

3. synteza DNA przez podłączenie nukleotydów do primerów przy zastosowaniu termo stabilnej polimerazy :

Wydajnosc PCR :

-25 cykli

-postęp geometryczny po 1cyklu 2 nici po 2 4 po 3 8 itd.

Konstrukcje genowe i metody transformacji – Jak umieścić gen w komórce dbn, rośliny czy zwierzęcia

Konstrukcje genowe-Podstawowe elementy:

-wyizolowany i sklonowany gen w odpowiedniej ilości

-nośnik genu

-biorca genu

Nośnik genu:

-wektor – nośnik służący do wprowadzenia i powielenia fragmentu DNA w komórce wybranego organizmu

-kuliste czasteczki DNA (naturalne – plazmidy bakterii; sztuczne- skonstruowane cz. DNA metodą inzynierii genetycznej)

Budowa wektora:

1. ori- miejsce inicjacji replikacji

2. polilinker- sztuczny odcinek DNA mający kilkanaście miejsc restrykcyjnych , miejsce ciecia wektora

miejsce restrykcyjne- obszar DNA rozpoznawany przez e restrykcyjne które przecinają części DNA w ściśle

określonych miejscach

3. Marker I-gen pozwalający na odróżnienie bakterii posiadających wektor od tych które go nie zawierają:

- Geny oporności na antybiotyki (ampicylinę i tetracyklinę)

Marker II- pozwala na odróżnienie komórek które pobierały wektor ze wstawka od tych które pobrały wektor bez wstawki

KONSTRUKCJE GENOWE

DNA wprowadzone do kom zawiera :

-gen którym się interesujemy

-promotor, części kodujące, terminator

-co najmniej 1gen markerowy – mała wartość handlowa(są niezbędne do wykrywania i wyizolowania kilku kom w które zostały transformowane, potrzebne w początkowych fazach lecz nieporządne w organizmie końcowym)

Markery selektywne :

-gen NPT-II- koduje fosfotransferazę neomycyny - oporności na kanamycynę

-pozwala na wzrost dbn na podłożu z kanamycyną tylko komórkom, które uległy transformacji, pozostałe komórki, które nie zostały transformowane giną

Wydajność transferu genu do komórki:

-b. mała kilka na mln transferowanych kom jest pomyślne

Metody transformacji organizmów:

-Dbn – zadanie proste

-rośłina – zad trudniejsze

-zwierzę – zad skomplikowane

Każdy gat rośłiny lub zwierzęcia ma różne indywidualne wymagania niezbędne do pomyślnej transformacji genetycznej

- ustala się je doświadczalnie

WD3

Metody transformacji drobnoustrojów

1. Naturalna zdolność bakterii do pobrania DNA- kompetencja naturalna

2. Indukcja kompetencyjna

3. Protoplastyzacja komórek

4. Elektroporacja

Ad.4. Elektroporacja protoplastów- zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego o dużej częstotliwości, następuję przebicie błony cytoplazmatycznej: tworzą się pory (tunele) w błonie cytoplazmatycznej, przez które wnika DNA do wnętrza komórki.

Jak wprowadzamy gen do roślin:

1. Met. Bez wektorowa- wprowadzenie genu bez pośrednictwa wektora

2. Met. Wektorowa- użycie bakterii z plazmidem zawierający transgen

Ad.1. Metoda bez wektorowa- Mikrowstrzeliwanie

- DNA miesza się z kuleczkami złotymi lub wolfronowymi (0,5-5µm)

- 1 mikronośnik poktyty jest od 0,01 do 0,1 pikogramów DNA

- pokryte DNA kuleczki umieszcza się na linii podmuchu strumienia helu, tak aby mogły się dostać do środka

- prędkość pocisków wynosi kilkaset m/s

-DNA obce jest dołączone do DNA komórki

-regeneracja komórki i odtworzenie pełnej rośliny

-metoda najczęściej stosuje się do pszenicy ryżu kukurydzy

Ad.2. Metoda wektorowa

Naturalna zdolność bakterii glebowych Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium ryhionogenes do infekowania roślin w miejscach zranień i przekazywaniu fragmentu własnego plazmidu, który ulega integracji z genomem komórki roślinnej. Proces nazywany inaczej agroinfekcją.

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

- bakteria czeka na zranienie rośliny a następnie przedostaje się do zranionych komórek w części znajdującej się na poziomie gleby.

- wycięcie t-DNA, osłonięcie specjalnymi białkami zabezpieczającymi

- kompleks t – DNA – białko jest wprowadzany do komórki rośliny przez kanał łączący komórkę bakteryjną z komórką roślinną

-t – DNA łączy się z DNA komórki roślinnej

-komórka roślinna rozpoczyna syntetyzować białka zgodnie z sekwencją zawartą w genach t – DNA

* Geny kodujące syntezę opin

* onkogeny, kodujące wytworzenie tumorów – miejsce bytowania bakterii w roślinie

- roślina produkuje związki zwane opinami, są wykorzystywane perfekcyjnie przez bakterie

- onkogeny są odpowiedzialne za produkcję enzymów, które powodują wytworzenie przez komórkę rośliny hormonów wzrostu – nie wykorzystują tego bakterie.

- większa ilość kopii genu w t – DNA powoduje że roślina produkuje więcej hormonów wzrostu i jeszcze więcej opin.

- roślina zmienia się w zbryloną masę komórek

-wynikiem jest powstanie w roślinie choroby: guzowatość korzenia

- geny t – DNA są tylko ładunkiem genów

- geny które kierują naturalnym transferem DNA pozostają w komórce bakterii

Rozbrojone szczepy Agrobacterium

- modyfikacja polaga na usunięciu z odcinka T-DNA genów bakteryjnych i na ich miejsce wprowadzenie genów, które planujemy przenieść do roślin.

- są to zazwyczaj geny geny: użytkowy, selekcyjny i reporterowi wraz z ich sekwencjami regulatorowymi ( promotorem, terminatorem)

- transplantacje Agromacterium powoduje powielenie wektorów w komórkach bakteryjnych, wydajność od kilku do kilkunastu roślin na 100 eksplantatorów

Rośliny genetycznie modyfikowane

Pierwsze rośliny udoskonalone genetycznie, proste udoskonalenia cech:

- odporność na owady

-odporność na działanie herbicydów

-odporność na wirusy

-zmiana barwy kwiatów

Rośliny MG

1. Soja odporna na herbicyd i/lub szkodniki

2. Kukurydza odporna na herbicyd i/lub szkodniki

3. Bawełna odporna na herbicyd i/lub szkodniki

4. Rzepak odporna na herbicyd i/lub szkodniki

5. Burak cukrowy odporna na herbicyd i/lub szkodniki

Odbiorcy korzyści wynikających z upraw odmian transgenicznych: producenci roślin, właściciel odmiany

1.Odporność na szkodliwe owady

- kukurydza i soja z GM odpornością na owady

- już od lat 50 w mieszaninach środków owadobójczych do zwalczania głównie gąsienic: w ogródkach przydomowych, dużych farmach, powszechnie stosowana naturalnie występująca bakteria Bacillus thurigensis

GEN Bt

- wytwarza kryształ białka Cry toksycznego dla owadów łuskoskrzydłych: omacnica prosowianka, stonka, biedronka, złotook zielony, motyl monarch

Działanie białka Cry

W środowisku zasadowym przewodu pokarmowego owada następuje aktywacja białka Cry (istnieje około 130 białek Cry) – łączy się ono ze specyficznymi receptorami w błonach komórkowych przewodu pokarmowego. Powoduje to powstanie otworów w błonie, zniszczenie komórek co doprowadza do śmierci owada. Receptory tych białek nie występują na powierzchni komórek jelitowych ssaków dlatego też ludzie i inne ssaki nie są na ich działanie wrażliwe. Wprowadzony gen koduje powstawanie białka Bt, które chroni roślinę przed żerowaniem. Powoduje to powstanie otworów w błonie, zniszczenie komórki co doprowadza do śmierci owada. Receptory tych białek nie występują na powierzchni komórek jelitowych ssaków, dlatego tez ludzie i inne ssaki nie są na ich działanie wrażliwe.

Wprowadzony gen koduje powstanie białka Bt, które chroni roślinę przed żerowaniem.

Rośliny Bt:

- ziemniak Bt ( z genem Cry 3A)- odporny na stonkę (od ’95)

- bawełna Bt (cry HAC)- ‘96

- kukurydza Bt (cry 1Ab) –’96 odporna na omacnice

- Ryż Bt (cry 1Ac)

Modyfikacja genów Bt:

1.Niska ekspresja natywnych genów Bt w roślinach ( w warunkach polowych):

- dużo nukleotydów A/T w genach bakteryjnych (60-70%), w których w genach roślinnych jest tylko 40-50%

- regiony ATAT i jego warianty odczytywane były jako sekwencje kończące gen i dlatego była niska wydajność białka Cry.

1. Modyfikacje genów cry 1Ab i cry 1Ac:

- usunięto wszystkie sekwencje ATTTA co spowodowało spadek liczby nukleotydów z 615 do 356 i spowodowało 100 krotny wzrost ekspresji genów w komórkach roślinnych.

- usunięto promotora genu i użyto promotor z wirusa mozaiki kalafiora.

Kukurydza MON 810- odporna na larwy owadów żywiących się liśćmi, łodygami i kolbami

Kukurydza MON 863- odporna na larwy odwadów żywiących się korzeniami (zachodnia stonka kukurydziana)

Obie te odmiany są wprowadzone na rynek Unijny. Wprowadzenie do obrotu powyższej kukurydzy dotyczy: importu ziarna i zastosowania go do przetworzenia na cele paszowe, spożywcze i przemysłowe.

2.Odporność na herbicydy

- plantację z odmianą odporną traktuje się takim herbicydem bez szkody dla uprawianej odmiany, całkowicie eliminując inne gatunki i odmiany.

- działanie- hamowanie enzymu- kluczowego dla danego szlaku biochemicznego

- mechanizmy: wytwarza enzym katalizujący rozkład cząsteczek herbicydu, syntetyzuje inną formę enzymu, wytwarza bariery fizyczne lub fizjologiczne, które zapobiegają wniknięciu herbicydu do tkanek lub komórek.

Rośliny:

1.Odporność na herbicyd glifosat

-glifosat hamuje działanie syntazy EPSPS- enzymu, który bierze udział w syntezie aminokwasów aromatycznych.

- modyfikacje roślin polegają na wprowadzeniu:

1. genu kodującego syntazę EPSPS nie wrażliwą na herbicyd (Agrobacterium)

2. gen kodujący oksydoreduktazę glifosatu (GOX), który rozkłada glifosat (Achromobacter)

Kukurydza, soja, rzepak, tytoń, pomidory

Kukurydza GA21

- z tolerancją na glifosat

- ze zmienionym genem syntazy EPSPS, który produkował w roślinie nową nieczułą na glifosat syntazę EPSPS.

- modyfikacji dokonano za pomocą „armatki genowej”.

Rzepak GT73:

-rzepak odporny na herbicyd GTF3 glifosat

- wykorzystanie w produkcji pasz i przemysłowym przetwarzaniu, nie do uprawy

- modyfikacje przy użyciu Agrobacterium

3.odporność na choroby powodowane przez bakterie i grzyby:

- geny enzymów, które niszczą ścianę komórki bakterii i grzybów: chitynaza (z Serratia marcescens), glukanaza (z lucerny)

- gen kodujący osmotynę- białko wiążące się z błoną cytoplazmatyczną patogenów grzybowych, powodując jej zniszczenie, gen pochodzi z petunii i tytoniu.

4. odporność na choroby wirusowe

1.gen białek płaszcza (kapsydu)danego wirusa

2. geny enzymów i replikazy, proteazy wprowadzone do komórek żywiciela, mogą nadawać odporność organizmowi żywiciela bez wywołania choroby.

Rośliny:

- ziemniak – odporny na wirusa Y

- tytoń- odporny na wirusa mozaiki tytoniu

- ogórek- odporny na wirusa mozaiki ogórka

- kalafior- odporny na wirusa mozaiki kalafiora

- papaja- odporna na wirusa plamki pierścieniowatej papai (pRSV)

5. zmiana koloru kwiatów (??)

- niebieski goździk i niebieska róża

- - wprowadzono geny: (??)

DRUGA GENERACJA ROŚLIN – mają cechy istotne dla konsumenta:

-niskokaloryczne buraki cukrowe – przekształcają sacharozę w niskokaloryczną fruktozę

-ziemniaki ze zmodyfikowaną skrobią – przeznaczone do smażenia w mniejszej ilości oleju

Opóźnienie dojrzewania (POMIDORY) - najważniejsze enzymy kontrolujące proces dojrzewania owoców:

- poligalakturonaza (PG) – rozkłada pektyny w ścianach komórkowych

- metyloesteraza pektynowa (PE) – dem etyluje pektynę w błonie wtórnej i ścianie komórkowej

- synteza fitoenu – synteza karetonoidów

Gen kodujący enzym PG – w pozycji antysensownej czyli ma odwróconą sekwencję nukleotydów – 90-99% zmniejszenie aktywności poligalakturanozy w początkowej fazie dojrzewania.

Gen reaktywny PG – znacznie skrócony – opóźnia miękniecie pomidorów zachowując czerwoną barwę.

Przydatność GM pomidora dla przetwórstwa

Przecier i koncentrat pomidorowy:

-bardzo mała synereza (wydzielanie się fazy płynnej; rozdział)

- poprawna barwa

- zwiększenie lepkości koncentratów

- brak różnic w zawartości cukrów redukujących, kw. cytrynowego, pektyn

ZIEMNIAKI

- zwiększenie s.m. ziemniaków

- wzrost zawartości skrobi

- odmiany składające się wyłącznie z amylopektyny

Wprowadzono gen z E. coli kodujący pirofosforylowy ADP-glukozowy:

-wzrost s.s. o 20-30%

- ograniczenie powstawania cukrów redukujących w czasie przechowywania w niskiej temp.

- zachowanie jasnego koloru frytek

- zmniejszenie kiełkowania bulw ziemniaków GM

Ziemniaki GM odmiany Amflora:

- wytwarzają skrobię składającą się tylko z amylopektyny – pozbawione amylazy

- wstawiono gen pochodzący z innej odmiany ziemniaka (GBSS) w pozycji antysensowej który spowodował … (nie mam tego)

ZŁOTY RYŻ – Na skutek niedoboru wit. A 500tys. dzieci na świecie traci wzrok. Ryż zawiera ok. 20x więcej beta-karotenu niż odmiana złotego ryżu-1

Złoty ryż-2 - wprowadzono dwa geny: kodujący syntezę fitoenu (psy) oraz kodujący desaturazę karotenu (crtI)

Zawartość prowitaminy A w kolejnych odmianach:

Golden Rice – 1,6 ug/g

GR 1 – 6 ug/g

GR 2 – 37 ug/g

KUKURYDZA – zwiększenie zawartości żelaza

Wprowadzono do genomu dwa geny które odpowiedzialne są za wydajniejsze pobieranie żelaza z gleby oraz udostępnianie go w formie łatwo przyswajalnej:

- gen z soi – koduje białko ferrytynę

- gen z Aspergillus – koduje fitazę rozkładającą kw. fitynowy

TRZECIA GENERACJA ROŚLIN – przeznaczone do produkowania związków chemicznych wielkiej wartości np.: sałata produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B (opracowana w PL)

Raport produkcji GMO publikowany od 1996r. – data pojawienia się pierwszych upraw GMO.

Areał upraw GMO:

1996r. – 17 mln ha

2006r. – 102 mln ha

2011r. – 160 mln ha (5-10% ogółu upraw na świecie; w PL 300 ha)

Największy areał (soja 47%, kukurydza 32%, bawełna):

1. 69 mln ha – USA

2. 30 mln ha – Brazylia

3. 24 mln ha – Argentyna

Uprawy GMO w Europie < 0,1 mln ha : Hiszpania, Portugalia, Rumunia, Niemcy, Szwecja, Czechy, Słowacja. Głównie kukurydza Bt, soja Bt, ziemniaki.

Dominujące cechy uprawianych roślin GMO:

- odporność na herbicydy – 59% areału: soja, kukurydza, rzepak, bawełna, buraki cukrowe.

- odporność na herbicydy i owady – 26% areału

- odporność na owady – 15% areału

Korzyści upraw biotechnologicznych

- znaczne zmniejszenie zużycia pestycydów – łączne ograniczenie w latach 1996-2010 szacowano na 443 mln kg surowca aktywnego

- stała oszczędność emisji CO₂ poprzez ograniczenie zużycia paliw kopalnych (1,7 mld kg CO₂)

- zwiększenie produktywności przez zmniejszenie wylesienia, zmniejszenie emisji CO₂ , oszczędności gruntów

- zachowanie różnorodności biologicznej

ZWIERZĘTE TRANSGENICZNE – zwierze, które w swoim genomie posiada egzogenny DNA w postaci:

- losowo zintegrowanego fragmentu liniowego DNA (trans genu)

- zmodyfikowanego własnego genomu w wyniku wprowadzenia egzogennego DNA

- wprowadzonej całej sztucznej jednostki genetycznej np. sztucznego chromosomu bakteryjnego lub sztucznego chrom. drożdżowego

Sposoby otrzymywania zwierząt transgenicznych:

1.mikroiniekcja DNA do zygoty

2.transfer DNA przy pomocy wirusów

3.modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES

4.transplantacja jąder komórkowych

Ad 1-metoda bezwektorowa. Mikroinjekcja trans genu do jednego z przedjądrzy jednokomórkowego zarodka (zygoty) przy pomocy mikrochirurgicznej szklanej pipety. Przedjądrza posiadają materiały genetyczny od ojca i matki.

Etapy metody:

- r-r DNA wtryskiwany jest do dowolnie wybranego przedjądrza

- nastrzyknięte zygoty hodowane są in vitro do stadium dwukomórkowego

- zarodki przeszczepia się do jajowodu matek zastępczych, dochodzi do ciąży i porodu

Trudności: przeżywa ok. 50% - nie wszystkie przyjmują trans gen, 15% posiada zintegrowany transgen.

Komórki macierzyste – zdolne do podziału i różnicowania się w inną komórkę; rozwija się dojrzała komórką o określ. budowie, pełniącą określ. funkcje. Wyróżniamy:

- komórki macierzyste zarodka (ES)

- komórki macierzyste dorosłego osobnika

Ad3-metoda bezwektorowa. Komórki ES to pierwotne komórki zarodkowe izolowane z blastocysty. Posiadają zdolność wbudowywania się do tkanek rozwijającego się zarodka po ponownym wprowadzeniu do blastocysty.

Etapy metody:

-wprowadzenie genów do komórek ES metodą elektroporacji

-namnożenie komórki i trans genu w odpowiednich warunkach selekcyjnych

-transfer komórek potomnych do blastocysty

Cele modyfikacji:

-doskonalenie zwierząt gospodarczych

-aspekty hodowlane: uzyskanie szybszego rozwoju zwierząt, lepsze wykorzystanie paszy, uzyskanie redukcji tłuszczu, doskonalenie składu mleka, zwiększenie odporności zwierząt na choroby.

- aspekty biomedyczne: produkcja ludzkich białek przydatnych w medycynie oraz organów do transplantacji.

WD5

Transgeniczne owce

-wprowadzono geny bydlęcego lub ludzkiego wzrostu

-zdecydowanie negatywne wyniki

-transgeniczne owce chorowaly na: artretyzm, cukrzyce, żadna nie przezyla roku

Transegeniczne ryby z hormonem wzrostu:

-wprowadzono geny hormonu wzrostu malych zwierzat lub człowieka

-transg ryby: karpie, pstragi, lososie i innne.

Doskonalenie składu mleka

1 zmiana składu bialek mleka

2 zmiana zawartości tluszczu w mleku

3 zmiana zaw laktozy w mleku

Ad1 zmiana w strukturze pierwszorzędowej kazeiny może polepszyc jakość celów, wprowadzenie dodatkowych genów K-kazeiny może wzrosnąć stabilność mleka na wzrost temperatury, zastapienie przynajmniej czesciowe genów bialek krowich ludzkimi spowoduje „humanizacje” mleka krowiego, spadek zawartości B-laktoglobuliny – bialek które sa głównym alergenem mleka

Ad2: unieczynnienie genow (1 z wielu) enzymow uczestniczacycvh w biosyntezie lipidow spowoduje: spadek zawartości tluszczu w mleku, wzrost udzialu kwasow tluszczowycg nienasyconych zdrowszych dla konsumenta.

Ad3: spadek zaw laktozy można dokonac przez:

-unieczynnienie genu kodującego a-laktoalbumine lub

-wprowadzenie genu kodującego B-galaktozydaze

Redukcja stężenia laktozy korzystnie wpłynie na jakość serów i innych produktow mleczarskich np. lodow.

Aspekty biomedyczne

-transgeniczne zwierzeta jako „zywe bioreaktory”

-modyfikacje maja na celu wytwarzanie w organizmie zwierzat genetycznie modyfikowanych zmienionych bialek wykorzystywanych jako leki

-transegeneza gruczolu mlecznego w celu modyfikacji składu mleka (myszy, kroliki, owce, kozy, krowy)

Bakterie transgeniczne:

Mogą produkowac tylko proste bialka, nie wymagające obrobki potranslacyjnej

Gruczoł mleczny:

-może produkowac bialka wymagające obrobki potranslacyjnej

-konieczna jest do biologicznej aktywności bialek (wytworzenie mostkow di siarczkowych, glikozylacja reszt azotowych lub tlenowych)

Transgeniczne myszy i kroliki – bioreaktory

-87’ pierwsze transgeniczne myszy wytwarzaly owcza B-laktoglobuline, bialko które nie wysteopuje naturalnie w mleku gryzoni

-do wytworzenia 4 kg czynnika krzepliwości krwi IX

-przy ekspresji ludzkiego bialka rzedu 1g/l mleka trzeba wykorzystac:

1 transg korwe lub

7 kóz lub

10 swin lub

13 owiec lub

714 krolikow.

PRZYKLADY!

1. Antytrombina – ludzki enzym - czynnik krzepliwości krwi wytwarzany w mleku transeg kóz od 2009 roku w USA – lek przeciwzakrzepowy w profilaktyce zakrzepic.

2. Antytrypsyna – stosowana w leczeniu rozedmy pluc

3. Erytropoetyna – stos w leczeniu anemii

4. Laktoferytryna – dla osob zagrozonych niedoborami Fe

Zwierzeta transg jako dawny narzadów:

-transgeniczna swinga TG1154 ma wbudowany gen który może znieść immunologiczna bariere miedzygatunkowa pomiedzy człowiekiem a swinga

Drobnoustroje genetycznie modyfikowane

Zamkniete uzycie GMO: prace realizowane z drbn w zamknietym bioreaktorze czyli urzadzeniu w pelni odizolowanym od środowiska, produkcja hormonow, enzymow, lekow

Insulina ludzka: szczepy transgeniczne E. coli i S. cerevisiae, zaakceptowano od 1982r

-identyczna budowa z insulina endogenna wytwarzana przez komórki B trzustki ludzkiej

-producenci: USA, Dania, Niemcy, Polska –Bioton

Szczepy E.coli do produkcji insuliny ludzkiej

1.Konstrukcje plazmidu fragmentem DNA kodującym zmodyfikowany prekursor ludzkiej insuliny:

-sekwencja DNA kodująca prekursor jest dolaczana do zmodyfikowanego fragmentu genu ludzkiego dysmutazy ponadtlenkowej

-peptyd stanowiący cząsteczkę dysmutazy jest nosnikiem dla prekursora insuliny, war duza wydajność syntezy bialka funkcyjnego w E.coli

2. Transformacje plazmidem komórek E.coli

Budowa insuliny ludzkiej

-bialka – 51 aminokwasow

- 2 lancuchy polipeptydowe ( Ai B) polaczone mostkami di siarczkowymi

-lancuch A – 21 aminokwasow

Lanc B – 30 aminokwasow

- 3 mostki -S-S-

Produkcja ludzkiej insuliny:

-biosynteza w kom E.coli

-oddzielenie od biomasy i od pożywki

-transformacje enzymatyczne i oczyszczanie

-krystalizacja i wydzielenie

-tworzenie form farmaceutycznych

Biosynteza pro insuliny:

-proinsulina jest syntetyzowana w postaci tzw. Ciałek inkluzyjnych gromadzonych w cytozo lu , komorki w postaci nierozpuszczalnych zlogów (mini-pre-mini-pro-insulina)

Oczyszczanie biomasy od pozywki:

-odwirowanie komórek od plynu pofermentacyjnego w hermetycznych wirówkach

-rozbicie scian Komorek w dezintegratorach ciśnieniowych

-odlacznia cialek inkluzyjnych

Konwersja enzymu i modyfikacje chem

Oczyszczanie insuliny:

-wytracanie surowej insuliny

-oczyszczanie chromatograficzne insuliny

-krystalizacje i suszenie pod proznia

-przygotowanie form farmaceutycznych o nazwie Gensulina

-cykl 1 na 2 tygodnie

Drobnoustroje GM zarejestrowane w UE:

-regulation EU 1829/2003

*NOVO pMT742 lub pAKt29 – Yeast biomass – Norolisk A/S , Dania

*pCABL Bacterial biomass – Ajinomato Eurolysine SAS, Francja

NOVO Yeast Crean – jest produktem wytwarzanym z genetycznie modyfikowanych drozdzy S. cerevisiae, nie zawiera żywych kom. Co uzyskuje się przez zastosowanie kontrolowanego ogrzewania

Bakteryjna proteina – chlorowodorek L-lizyny: produkt fermentacji prowadzonej przez Brevibacterium lactofermentum

-lizyna – niedobor powoduje zahamowanie wzrostu, zanik miesni, odwapnienie kosci, zakłócenie biosyntezy bialek