1. Test na oznaczanie zdolności do wykorzystania cukrów z wytworzeniem kwasów warunkach tlenowych i beztlenowych (pod parafiną) na podłożu Hugh Leifsona.

• ziarniaki Gram-dodatnie

• zmodyfikowane podłoże Hugh-Leifsona z glukozą

• odróżnienie gronkowców od mikrokoków

Micrococcus luteus Staphylococcus aureus

(zdjęcie 053,054) (zdjęcie 055)

żółte niebieskie żółte żółte

Micrococcus luteus jest bezwzględnym tlenowcem, nie fermentuje glukozy, stąd brak zmiany zabarwienia podłoża w probówce z parafiną (barwa niebieska). W warunkach tlenowych utlenia glukozę i podłoże zmienia barwę z niebieskiej na żółtą.

Staphylococcus aureus jest względnym beztlenowcem. Fermentuje glukozę w warunkach beztlenowych i utlenia w warunkach tlenowych - stąd podłoże zmieni barwę z niebieskiej na żółtą w obu probówkach.

ćwiczenie 8 str. 2

• pałeczki Gram-ujemne

E. coli Ps. aeruginosa Ac. baumanii

żółte żółte żółte niebieskie niebieskie niebieskie

Podłoże Hugh-Leifsona w przypadku pałeczek Gram-ujemnych ma nieco inny skład niż w przypadku ziarniaków.

Zmiany barwy są analogiczne jak u ziarniaków.

W przypadku Ac. baumanii brak zmiany barwy w obu probówkach spowodowany jest faktem, iż jest to szczep asacharolityczny, tzn. że nie rozkłada glukozy w warunkach tlenowych, co może wynikać np. z braku odpowiednich enzymów, ponadto jest to pałeczka nie fermentująca glukozy stąd w warunkach beztlenowych barwa podłoża także się nie zmienia. ćwiczenia 9 i 10

2. Podłoże COLI ID

• zdj. 047

• ćwiczenie 9 str. 4 - poczytać

E. coli kolonie różowo-fioletowe (takie buraczkowe trochę, ciemne)

Klebsiella pneumoniae (pałeczka podobna do E. coli) - kolonie sinoniebieskie

3. Podłoże Mac Conkey`a - podłoże wybiórczo-różnicujące; różnicowanie pałeczek na laktozo (+) i laktozo (-).

• zdjęcie 046

• ćwiczenie 9 str. 4-5

Szczepy laktozo (+) - rozkładają laktozę, wykazują na podłożu intensywny wzrost, tworzą kolonie różowo-czerwone, przykłady: E. coli i Klebsiella pneumoniae

Szczepy laktozo (-) - nie rozkładają laktozy, na podłożu tworzą kolonie bezbarwne. Przykłady: Pseudomonas aeruginosa, Shigella, Salmonella (tylko Ps. aeruginosa był w zestawie z podłożem Mac Conkey`a jako przykład szczepu laktozo (-)).

Acinetobacter baumani teoretycznie powinien tworzyć kolonie bezbarwne, podobnie jak Ps. aeruginosa, jednak w zestawie był słaby wzrost i kolonie były lekko różowe - szczep laktozo-wątpliwy :). Żeby się upewnić trzeba nastawić krótki szereg.

4. Podłoże Chapmana

• obraz 038

• podłoże wybiórczo-różnicujące, zawiera mannitol i NaCl, pozwala różnicować gronkowce na mannitolo (+) i mannitolo (-).

• Mannitolo (+) - tzn. rozkładające mannitol, tworzą kolonie żółte z żółtą obwódką.

Mannitolo (-) --tzn. nie rozkładają mannitolu, tworzą kolonie małe i otoczone czerwoną lub purpurową obwódką.

• ćwiczenie 8 str. 1

5. Podłoże stałe agarowe z TTC (chlorek trójfenylotetrazoliowy)

• obraz 036

• na podłożu agarowym powstają czerwono zabarwione kolonie; jest to wynik redukcji TTC do formazonu

• jest to reakcja charakterystyczna dla Pseudomonas aeruginosa

• nie mylić z reakcją pozwalającą wykryć ruch bakterii na podłożu płynnym.

ćwicz. 10 str. 4

6. Oznaczanie wrażliwości na furazolidon

• odróżnienie wrażliwych na furazolidon gronkowców od opornych mikrokoków

• test wykonuje się metodą dyfuzyjno krążkową:

1. przygotowanie zawiesiny bakteryjnej o gęstości 0,5 wg skali Mac Farlanda

2. posiew zawiesiny przy użyciu wymazówki na podłoże Mueller-Hintona (grubość 3,5-4 mm)

3. nałożenie krążka wysyconego furazolidonem

4. preinkubacja 15 min. w temp. pokojowej

5. inkubacja w 35-37°C 18-24h

• ćwiczenie 8 str.2

7. Podłoże wybiórcze z cetrymidem (bromek acetylotrójmetyloamonowy 0,02% i kwas nalidyksowy 15mg/l jako czynniki selektywne)

• obraz 032

• np. Agar Pyocyanogel bioMerieux; może służyć do bezpośredniego posiewu kału, ropy, moczu; zalecany do wykrywania Ps. aeruginosa w żywności i wodzie; używany zarówno w badaniach systematycznych w warunkach szpitalnych jak i w przemyśle - zanieczyszczenia powierzchni, aparatury, sprzętu, środków antyseptycznych itd.

• Ps. aeruginosa wytwarza barwniki fenazynowe: piocyjaninę (barwnik niebieski) oraz fluoresceinę (barwnik fluoryzujący, zielono-żółty)

• wytworzenie tych barwników można zaobserwować w świetle UV - lampa Wooda długość fali 257,3 nm, po inkubacji 24-48 godz. w temp. 35°C

• płytki z podłożem oznaczone były na ćwiczeniach jako P

• ćwiczenie 10 str.4

Pseudomonas aeruginosa - wzrost intensywny, kolonie żółte (cytrynowe), gdzieniegdzie zielona poświata, barwniki przenikają do podłoża i zabarwia je na żółto

Acinetobacter baumanii - wzrost zahamowany, podłoże jest bezbarwne, kolonie nieliczne.

8. D-COCCOSEL agar (ćwiczenie 8 str.6)

• podłoże wybiórcze zawierające żółć (czynnik wybiórczy) i eskulinę (czynnik różnicujący)

• na tym podłożu rośnie większość pałeczek Gram-ujemnych, Staphylococcus sp., grupa D Streptococcus i Enterococcus

• jedynie D Streptococcus i Enterococcus hydrolizują eskulinę do eskuletiny, która reaguje z zawartym w podłożu cytrynianem żelazowo-amonowym dając brązowo-czarny produkt (takie zabarwienie przyjmuje podłoże)

• w zestawie była płytka z Enterococcus faecalis.

9. Odróżnienie Enterococcus sp. (Enterococcus faecalis) od Streptococcus sp. (grupa D Streptococcus)

• zdjęcie 048

• ćwicz.8 str.6

czynnik różnicujący	Enterococcus faecalis	D Streptococcus
bulion o pH 9,6	+	-
bulion z 6,5%NaCl	+	-
bulion temp.45°C	+	-

10. Kolonie bakterii na podłożu TSA (agar tryptozowo-sojowy)

• zdjęcie 034 i 035

• opis morfologii kolonii i jakie cechy bierze się pod uwagę przy ich opisie

• kolonie w zestawie: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Staphylococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa

• ćwiczenie 3

11. Wzrost grzybów na podłożu Sabouraud

• podłoża do hodowli grzybów powtórzyć, tzn. podłoże Sabouraud z chloramfenikolem itd.

• opis morfologii koloni grzybów drożdżopodobnych na podłożach

• zestaw kolonii grzybów drożdżopodobnych: Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans - zdjęcie 059 (ta ciemna płytka to jest E. faecalis na D-Coccosel agar pkt 8)

• zestaw z plechami grzybów strzępkowych: Microsporum canis, Aspergillus niger, Penicillium

• powtórzyć chorobotwórczość, charakterystykę mikrohodowli (grzyby strzępkowe), typy zarodników

• zestaw podłoży chromogennych: co to jest i na czym polega identyfikacja zdjęcie 033

• zestaw z zymogramem - probówki 4 cukry (glukoza, sacharoza, maltoza, laktoza) określenie czy zaszła fermentacja gazowa (pęcherzyk powietrza w rurce Durhama oznacza fermentację gazową) czy kwaśna (zmiana pH podłoże zabarwione na żółto świadczy o fermentacji kwaśnej, barwa niebieska brak fermentacji danego cukru)

12. Ilościowe badanie moczu - metoda ez kalibrowanych (metoda Hoepricha)

• ćwiczenie 4, dodatek Zakażenia układu moczowego str. 10 (9)

• obraz 039

13. Oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów w pożywkach płynnych NLP.

• będzie to zestaw probówek 3 powtórzenia trzech stężeń: 1,0ml, 0,1ml, 0,01ml.

• ćwiczenie 4, str.6 pkt3, dodatek Część praktyczna str.14

• zdjęcie 060

14. Określanie stężenia użytkowego preparatów dezynfekcyjnych metodą zawiesinową wg PZH - z cylindrami

• ćwiczenie 5, Aneks str.8

• obraz 037

15. Ocena aktywności bakteriobójczej preparatów dezynfekcyjnych metodą zawiesinową wg PZH - oznaczanie najmniejszego stężenia bakteriobójczego.

• zdjęcie 058

• będzie oznaczenie szczepu testowego na probówce: E.coli NCTC 8196

• na probówkach oznaczenie stężeń preparatu badanego w procentach 0,1 0,2 itd. dla preparatu badanego i wzorcowego

• może trzeba będzie policzyć współczynnik aktywności

16. Kontrola sterylizacji w autoklawie przy użyciu testów biologicznych Stericon plus Bioindicator

• zdjęcie 051

• kolorowe ampułki zawierające wskaźnik biologiczny laseczki Geobacillus stearothermophilus

• kontrola fiolka fioletowa

• fiolka żółta wskazuje na nieprawidłowy przebieg procesu sterylizacji (wzrost bakterii z niezabitych przetrwalników)

17. Metody jakościowe i ilościowe oznaczania wrażliwości na dany antybiotyk

• metoda dyfuzyjna przy użyciu krążków bibułowych ćwiczenie 6 str.4 - zdjęcie 044

• metoda seryjnych rozcieńczeń w podłożu płynnym - makrorozcieńczenia - ćwiczenie 6 str.5 - zdjęcie 061

18. Wykrywanie mechanizmów oporności

• wykrywanie β-laktamaz ESβL - test dwóch krążków; ćwiczenie 7 str.4

• wykrywanie karbapenemaz MBL metodą dyfuzyjno-krążkową; ćwiczenie 7 str. 6

• zdjęcia 040, 042, 043

Powtórzcie sobie też e-tesy (zdjęcie 049) i przejrzyjcie antybiogramy w ćwiczeniu 6 i 7.

19. Krótki szereg diagnostyczny

• ćwiczenie 9

• zdjęcie 059

---