1. WYKRYWANIE CHIMER
sekwencje z pliku torf.fasta należy porównać a następnie wyszukać chimer za pomocą dwóch programów:
-Decipherhttp://decipher.cee.wisc.edu
-Bellerophonhttp://comp-bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl
W przypadku potencjalnych chimer należy powierdzić wyniki przeprowadzając analizę BLAST. W tym celu balstujemy fragment chimerycznej sekwencji od początku do punktu rekombinacji i osobno od punktu rekombinacji do końca. Jesli wyniki są różne to chimera jest prawdziwa i należy ją usunąć z analizy lub rrozdzielić w miejscu rekombinacji na dwie sekwencje reprezentujące dwa różne organizmy.
2. LICZENIE OTU
Mothur
http://www.mothur.org/wiki/Download_mothur
prosze zainstalować na komputerze
Plik z danymi musi być w tym samym miejscu co program MOTHUR wówczas nie trzeba podawać pełnej ścieżki dostępu
1. Komenda umożliwiająca policzenie dystansu:
>dist.seqs(fasta=nazwapliku.fasta, output=lt)
2. Komenda umożliwiająca posegregowanie OTU na podstawie dystansu wyliczonego za pomocą pierwszej komendy
>cluster.calssic(phylip=nazwapliku.phylip.dist, coutoff=0.3, precision =1000)
Ten plik został wygenerowany w pierwszym kroku
Zadanie
W pliku torf.fasta znajdują się sekwencje (nie porównane) uzyskane w trakcie analizy bioróżnorodności torfowiska (znajdującego się pod Olsztynem). Sekwencje uzyskane z biblioteki genu 16S wykonanej z próby wody (oznaczone symbolem PL...) oraz z torfu (oznaczone symbolem BG...).
Należy wykonać alignment a następnie po wyszukaniu i usunięciu ewentualnych chimer proszę zgrupować sekwencje w OTU za pomocą programu MOTHUR.
Proszę wybrać po 1 sekwencji reprezentującej każde OTU na poziomie 97% (dystans 0,03) i zidentyfikować za pomocą programu Classifier http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp
Następnie proszę „pobrać“ z genbanku po 3 sekwencje najbardziej podobne do koażdej z nich wykorzystując program Seqmatch http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp
Proszę wyrysować drzewo filogenetyczne dystansu genetycznego.
Wyniki postaci pliku zawierającego informację o:
liczbie OTU na poziomie 97%
identyfikację poszczególnych OTU
drzewo filogenetyczne wklejone do dokumentu
prosze przesłać na email malgorzata.waleron@gmail.com
3. PROJEKTOWANIE STARTERÓW
Proszę wybrać sobie gen dla którego należy zaprojektować startery.
W przypadku braku pomysłu może to być sekwencja która była identyfikowana na poprzednich zajęciach (każdy miał inną).
Startery maja być wykorzystane do rekacji RT-PCR ( produkt PCR będzie miał zatem max. 350bp).
Aby projektowanie było poprawne sekwencja powinna być porównana z sekwencjami tego genu z innych najbliżej spokrewnionych organizmów. Tu macie państwo porównanie z ubiegłego tygodnia.
Programy pozwalają projektować startery w oparciu tylko o 1 sekwencje ale możemy sprawdzi na porównaniu czy miejsce przyłączenia startera jest w regionie konserwatywnym czy też zmiennym i unikalnym dla wąskiej grupy organizmów w te sposób można projektować bądź bardzo specyficzne bądź uniwersalne startery.
Programy:
Primer 3 http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Przydatne informacje i manuale znajdują się m.in. na str https://eu.idtdna.com/pages/scitools/tutorials/
Primer quest https://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index
Program do wyszukania nowych starterów
Oligo analyzerhttps://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
Program do analizy parametrów starterów