Rozdział 1 – Laboratorium mikrobiologiczne i podstawy aseptyki

Wstęp teoretyczny:

Laboratorium mikrobiologiczne powinno się składać z kilku pomieszczeń przeznaczonych do różnych badań , dostosowanych odpowiednio do indywidualnych potrzeb pracowni. Pracownia powinna być chroniona przed promieniowaniem słonecznym, musi być wyposażona w system wentylacji, czujniki dymu i gazu oraz klimatyzację. Każde laboratorium posiada odpowiednie urządzenia i sprzęty oraz szkło laboratoryjne i przyrządy stosowane w trakcie badań. W celu uniknięcia skażenia lub zakażenia podczas doświadczeń mikrobiologicznych należy przestrzegać zasad aseptyki. W związku z tym w laboratorium powszechnie przeprowadzane są procesy sterylizacji i dezynfekcji. Sterylizację można przeprowadzić stosując metody fizyczne, mechaniczne i chemiczne natomiast do dezynfekcji stosowane są przede wszystkim środki chemiczne (np. kwasy i zasady, alkohole, detergenty) oraz metody temperaturowe (dekoktacja i pasteryzacja). Jako antyseptyki stosuję się również antybiotyki.

Część praktyczna:

Na zajęciach zapoznaliśmy się z zasadami których należy przestrzegać podczas zajęć laboratoryjnych, przyjrzeliśmy się pomieszczeniom i sprzętom w laboratorium. Następnie przygotowywaliśmy szkło laboratoryjne do sterylizacji, przygotowaliśmy kilka korków z waty i nauczyliśmy się jak jałowo rozlewać pożywki.

W pierwszym doświadczeniu kontrolowaliśmy sterylność podłoży wylewanych w sposób jałowy i niejałowy. Potrzebne nam były do tego dwie szalki Petriego (jałowa i niejałowa) z agarem odżywczym i również dwie probówki z czego jedna niejałowa a druga jałowa z bulionem. Odstawiliśmy je następnie do cieplarki.

Skład bulionu odżywczego: Skład agaru odżywczego:

-pepton -ekstraktat mięsny

-chlorek sodu - ekstraktat drożdżowy

-ekstraktat wołowy - pepton

-ekstraktat drożdżowy - chlorek sodu

- glukoza

- agar

Wyniki:

W szalce jak i w probówce do których rozlewaliśmy bulion i agar w warunkach sterylnych nie zaobserwowano żadnych śladów bakterii, natomiast w szalce niesterylnej wyrosła znaczna ilość kolonii bakteryjnych a w niesterylnej probówce bulion uległ zmętnieniu co może świadczyć o pojawieniu się w nim bakterii.

Komentarz:

W celu uzyskania stuprocentowej pewności co do skuteczności i poprawności uzyskanego wyniku niezbędne jest zachowanie sterylnych warunków pracy.

W dalszej części ćwiczeń testowaliśmy skuteczność różnych środków dezynfekcyjnych na bakterie testowe posiane na szalki z pożywką agarową. Bakterie te to: Esherichia coli i Staphylococcus aureus. Użyte środki dezynfekcyjne to: HCl 1%, CH₃COOH 50%, etanol 10%, Formaldehyd 37%, butanol 100%, metanol 50%, KMnO₄ 0,15%, H₂O₂ 20%, metanol 10%, płyn Lugola 1%, AgNO₃ 1% i KMnO₄ 5%.

Wyniki:

Na szalki 1 z bakterią Escherichia coli i szalkę 2 z bakterią Staphylococcus aureus z zastosowanych środków w obu przypadkach najlepsze działanie dezynfekujące wykazał formaldehyd – w granicach 100% skuteczności. Dalej CH₃COOH – ok. 70 – 75% skuteczności. Najsłabsze oddziaływanie nastąpiło w przypadku etanolu – 20% i HCl – 5%.

Na szalki 3 z bakterią Escherichia coli i szalkę 4 z bakterią Staphylococcus aureus z zastosowanych środków w pierwszym wypadku najlepsze działanie wykazał KMnO₄ - 40%, natomiast AgNO₃, płyn Lugola i metanol słabiej – ok. 10% skuteczności. Natomiast w szalce nr 4 wyniki są następujące : AgNO₃ – 15%, płyn Lugola i metanol 5%, KMnO₄ ok. 5%.

Szalka 5 (Escherichia coli) – KMnO₄ – 40%,

Szalka 6 (Staphylococcus aureus) - H₂O₂ 20%, butanol 15%, metanol i KMnO₄ – 5%.

Wnioski:

Stosowanie środków dezynfekcyjnych ogranicza liczebność drobnoustrojów. Silniej działają kwasy i aldehydy, a najsłabiej alkohole. Zastosowane środki utleniające działają silniej na bakterie Gram-ujemne, do których należy Escherichia coli użyta w naszym doświadczeniu.

Ostatnim ćwiczeniem na naszych zajęciach było badanie wpływu antybiotyków na wzrost mikroorganizmów. Na dwóch szalkach Petriego z rozprowadzonym agarem posialiśmy bakterie Escherichia coli i Bacillus Subilitis. Szalki podzieliliśmy na trzy części i użyliśmy w celu sprawdzenia działania Augmentinu, Ceroximu i kropli wodnych.

Wyniki:

Na obie bakterie najsilniej zadziałał Augmentin. Skuteczność Ceroximu w przypadku bakterii Escherichia coli był słaba, lepiej zadziałał na Bacillus Subilitis. Krople wodne – skuteczność ok. 50% na Escherichia coli, na Bacillus bardzo słabo.

Wnioski:

Skuteczność działania antybiotyku jest związana z ilością substancji czynnych w nim zawartych.

Rozdział Drugi – Podłoża i hodowle mikrobiologiczne

Wstęp teoretyczny:

Drobnoustroje potrzebują do wzrostu i rozmnażania źródła pokarmu i energii. Różne drobnoustroje można podzielić pod różnymi względami np. ze względu na typ odżywiania, czy ze względu na źródło energii. Między drobnoustrojami zachodzą wzajemne oddziaływania takie jak: komensalizm, mutualizm, antagonizm, drapieżnictwo czy pasożytnictwo. Możemy je hodować w laboratoriach i badać w specjalnych, sztucznych środowiskach tzw. pożywkach. Pożywki, żeby były użytecznie muszą spełniać określone kryteria co do wartości odżywczej, odczynu pH, izotoniczności, sterylności i przejrzystości. Pożywki dzieli się według charakteru składników, wymagań odżywczych i konsystencji. W celu otrzymania czystych kultur stosuje się metody bezpośrednie i pośrednie. Drobnoustroje hoduje się w hodowlach zamkniętych, otwartych i hodowlach dla tlenowców i beztlenowców.

Część praktyczna:

W tym doświadczeniu wykonywaliśmy test zapotrzebowania grzyba Aspergillus Niger na pierwiastki biogenne. Badaliśmy wzrost kropidlaka czarnego na podłożach, niezawierających poszczególnych składników. Kontrolnie stosowaliśmy pożywkę pełną. W kolbie miarowej o pojemności 50ml, przygotowaliśmy pożywkę pełną z 1ml 5% NH₄NO_3, 1ml 2,5% KH₂PO₄, 1ml 2,5% MgSO₄, i 2krople 0,25% FeSO₄ + 0,25% ZnSO_4, 2,5g sacharozy i dopełniliśmy wodą destylowaną do danej objętości, którą rozlaliśmy do dwóch kolb o pojemności 25ml. Następnie w 3 miarowych kolbach o objętości po 25ml każda przygotowaliśmy odpowiednio pożywki bez azotu, bez fosforu i bez potasu. Wszystkie pożywki później zostały wysterylizowane podczas gotowania na palniku i po ochłodzeniu zostały zaszczepione (za wyjątkiem jednej kolby z pożywką pełną, którą zostawiliśmy jako kontrolę sterylności) za pomocą sterylnej ezy. Tak zaszczepione hodowle zostawiliśmy do inkubacji w temperaturze 28 - 30°C na okres jednego tygodnia.

Wyniki:

• Pożywka kontrolna pełna - pozostała sterylna i o klarownym roztworze.

• Pożywka pełna – największa, najbardziej obfita grzybnia.

• Pożywka bez azotu – skupisko zarodników na środku i wzdłuż brzegów kolby. Pożywka mętna.

• Pożywka bez potasu – unoszące się w mętnej pożywce o kolorze podobnym do białka jaja kurzego białe zarodniki.

• Pożywka bez fosforu – najmniejsza ze wszystkich kolonia. Zarodniki w pożywce o kolorze ciemnym.

Wnioski:

Test pokazał iż wybrane makroelementy są niezbędne do prawidłowego wzrostu grzyba. Brak niektórych pierwiastków biogennych sprawia iż grzyb rośnie tylko do pewnego momentu, lub pozostaje w formie zarodników.

Następnym testem był test na wykorzystanie przez Aspergillus Niger różnych źródeł węgla. W miarowych kolbach o pojemności 25ml każda przygotowaliśmy 6 pożywek o składzie: 0,5ml 5% NH₄NO_3, 0,5ml 2,5% KH₂PO_4, 0,5ml 2,5% MgSO₄ i jedną krople 0,25% FeSO₄ + 0,25% ZnSO₄. Do pierwszej probówki dodaliśmy 1,25 g glukozy a do pozostałych odpowiednią ilość fruktozy, sacharozy, skrobi, kwasu winowego i glicerolu a następnie uzupełniliśmy wodą destylowaną do objętości 25ml. Skrobie należało rozpuścić w łaźni parowej, gdyż niemożliwe było rozpuszczenie się jej w temperaturze panującej w laboratorium. Pożywki następnie zostały wysterylizowane przez zagotowanie na palniku gazowym i zaszczepione zarodnikami kropidlaka czarnego za pomocą jałowej ezy i odłożone do inkubacji w temperaturze 28-30°C

Wyniki:

• Pożywka z glukozą – gruba, obfita grzybnia. Pofalowana. Koloru jasnoszarego. Pożywka o kolorze słomkowym.

• Pożywka ze skrobią – Mętna pożywka o kolorze białawym. Grzybnia ma wygląd kulistych form o białym spodku i pokrytych osadem podobnym do szronu, o kolorze zielonkawym na górze.

• Pożywka z sacharozą – Podobna jak ze skrobią tylko pożywka ma trochę ciemniejszą barwę.

• Pożywka z kwasem winowym – kilka zarodników unoszących się na przezroczystej pożywce

• Pożywka z glicerolem – Przezroczysta pożywka. Grzybnia pofalowana o kolorze białym, miejscami pokryta osadem.

• Pożywka z fruktozą – Pożywka o kolorze brudnej wody, ciemnobrązowa. Grzybnia podobna do tej ze skrobią. Kolor szarozielony

Sucha masa hodowli (w gramach):

Z glukozą	0,23
Z glicerolem	0,33
Z kwasem winowym	0,13
Z sacharozą	0,34
Ze skrobią	0,37
Z fruktozą	0,27

Wnioski:

Najlepszymi źródłami węgla okazały się pożywki na których grzyby rozwinęły się najlepiej. W przypadku tego doświadczenia były to skrobia i sacharoza. Najmniejsza kolonia wyrosła na pożywce z kwasem winylowym, więc nie jest to najlepsze źródło węgla potrzebnego do wzrostu.

Rozdział 3 – Mikroflora człowieka

Wstęp teoretyczny:

Powierzchnie zewnętrze i wewnętrzne każdego zdrowego organizmu zasiedlają drobnoustroje ogólnie nazwane mikroflorą. Dzieli się ona na mikroflorę stałą i mikroflorę przejściową. Pomiędzy mikroorganizmami a makroorganizmem zachodzą identyczne stosunki ekologiczne jak w innych środowiskach. Mikroflorę człowieka zamieszkują m.in. bakterie z rodziny Enteriobacteriaceae, do których należy np. Escherichia coli. Bakterie te występują w jelicie w ogromnych ilościach. Bakterie licznie też zamieszkują skórę. Mikroflora skóry składa się głównie z gronkowców, paciorkowców, prątków i bakterii propionowych. Obecne są również bakterie oportunistyczne, czyli warunkowo chorobotwórcze i chorobotwórcze.

Część praktyczna.

W tej części badaliśmy mikroflorę skóry i mikroflorę jamy ustnej poprzez odciśnięcie palca i dokonanie rozmazu wymazu z jamy ustnej na podłożu z agarem zwykłym oraz agarem Chapmana.

Wyniki:

Na podłożu z agarem zwykłym, w miejscu gdzie robiony został wymaz pojawiło się małe skupisko kolonii w kolorze żółtym, natomiast w miejscu odciśnięcia palca kolonii jest znacznie więcej , jest większe ich skupisko oraz jest ich objętościowo więcej. Jeśli chodzi o agar Chapmana w miejscu wymazu z ust widać pojedyncze kolonie, natomiast w drugim przypadku nagromadzenie kolonii jest dużo gęściejsze.

Wnioski:

Żółty kolor kolonii wyrosłych na podłożu Chapmana wskazuje na obecność gronkowców które fermentują mannitol (mannitolo-dodatnich) do których zaliczyć można np. Staphylococcus aureus, lub Staphylococcus saprophyticus.

Komentarz:

Gronkowce złociste często występują w środowisku człowieka. Ich obecność na skórze i w jamie ustnej świadczy o nosicielstwie tych potencjalnie chorobotwórczych bakterii.

Rozdział 4 - Badania mikrobiologiczne wód

Wstęp teoretyczny:

Mikroorganizmy w dużej części zajmują również środowisko wód powierzchniowych jako mikroflora autochtoniczna. Stanowi ona część składową planktonu, peryfitonu lub bentosu i zajmuje warstwę epilimnionu, metalimnionu lub hipolimnionu. Najbardziej charakterystyczne dla środowisk wodnych mikroorganizmy to bakterie ruchliwe np. z rodzaju Vibrio, Pseudomonas, bakterie nitryfikacyjne i żelaziste, które są chemoautotrofami oraz bakterie nitkowate i styliskowe osiadające się na podwodnych ciałach stałych. Nie można zapomnieć również o bakteryjnych autotrofach jakimi są sinice, bakterie siarkowe czy heliobakterie. W wodach zamieszkują również grzyby, glony i pierwotniaki.

W wodach pojawia się także mikroflora allochtoniczna, czyli obca, nie występująca tam naturalnie. Przykładem są bakterie glebowe czy bakterie ściekowe. Większość tych bakterii ma szkodliwy wpływ na zdrowie człowieka.

W celu zminimalizowania ryzyka zakażenia wodę pitną lub przeznaczoną na potrzeby przemysłu poddaje się oczyszczaniu, uzdatnianiu i różnym badaniom sanitarnym. Badanie te stosuje się w celu wykrycia bakterii które wskazują na zanieczyszczenie wody fekaliami, co z kolei wskazuje na ryzyko zanieczyszczenia wody groźnymi bakteriami chorobotwórczymi. Bakterie te nazywa się bakteriami wskaźnikowymi i są to bakterie grupy coli, paciorkowce kałowe i laseczki beztlenowe redukujące siarczany(IV).

Część praktyczna:

W tej części oznaczaliśmy miano i NPL bakterii grupy coli typu ogólnego i typu kałowego w wodzie wodociągowej z Krakowa i w wodzie z rzeki Ostra z okolic Tarnowa. Wykorzystaliśmy do tego metodę fermentacyjną probówkową. Najpierw przeprowadziliśmy badania wstępne z zastosowaniem pożywki Eijkmana, następnie potrzebne było wykonanie badań potwierdzających z zastosowaniem agaru Endo a na końcu zrobiliśmy badania uzupełniające , które polegały na ponownym stwierdzeniu zdolności wyizolowanego szczepu do fermentowania laktozy na pożywce płynnej ze wskaźnikiem Andrare. Dla wody wodociągowej zastosowaliśmy system posiewu 1 * 50ml, 5 * 10ml, natomiast dla wody z rzeki system 3 * 0,1ml, 3 * 0,01ml i 3 * 0,001ml.

Wyniki:

Woda z rzeki Ostra:

Badania wstępne: 5 wyników dodatnich (nastąpiła zmiana barwy z fioletowej na żółtą, obecny był gaz w rurkach Durhama i nastąpiło zmętnienie podłoża), 4 wątpliwe (nastąpiła nieznaczna zmiana barwy i nie zanotowaliśmy obecności gazu w rurkach Durhama). Nie uzyskano żadnego ujemnego wiec wszystkie probówki zostały poddane badaniom potwierdzającym. Badania potwierdzające: 4 wyniki dodatnie (na szalkach z agarem Endo zaobserwowaliśmy gładkie kolonie, o metalicznym, zielonkawym połysku), 3 wątpliwe (nietypowe kolonie), 2 ujemne (kolonie o innym zabarwieniu). Badaniom uzupełniającym zostały poddane tylko wyniki wątpliwe. Badania uzupełniające: 3 wyniki dodatnie (nastąpiło zmętnienie pożywek, zmiana barwy, co świadczy o zakwaszeniu i obecny był gaz w rurkach Durhama)

Woda wodociągowa. Zastosowaliśmy system posiewu 5 * 10ml, 1 * 50ml.

Wszystkie wyniki ujemne w badaniach wstępnych, w związku z tym zakończyliśmy na tym badania.

Dla wody wodociągowej miano wyniosło 100, a NPL – 0. Dla wody z rzeki miano wyniosło 0,005 a NPL 21 000.

Komentarz:

Woda wodociągowa zawiera dopuszczalne miano i NPL i możemy uznać ją za zdatną do picia. Natomiast na podstawie wyników analiz wody powierzchniowej, stwierdziliśmy, iż woda z rzeki Ostra jest silnie zanieczyszczona.

Rozdział 5 – Badania mikrobiologiczne powietrza

Wstęp teoretyczny:

Mikroflora powietrza jest zróżnicowana , jej skład zależy od źródeł zanieczyszczenia, warunków meteorologicznych oraz terenowych. W skład powietrza wchodzi wiele różnych mikroorganizmów, które nie mogą się rozmnażać, nie zachodzą między nimi związki metaboliczne, są tylko w powietrzu zawieszone i przemieszczają się razem z nim.

Drobnoustroje występujące w powietrzu to: wirusy, bakterie (19 – 26%) z których dominują gronkowce, pakietowce, paciorkowce i bakterie z rodzaju Micrococcus , oraz głównie grzyby które stanowią ok. 70% wszystkich drobnoustrojów występujących w powietrzu.

W celu ułatwienia wykrywania chorobotwórczych bakterii w powietrzu stosuje się tzw. mikroorganizmy wskaźnikowe którymi są: gronkowce hemolizujące, gronkowce mannitolo-dodatnie i mannitolo – ujemne, promieniowce oraz pałeczki Pseudomonas fluroescens.

Do mikrobiologicznych metod badania powietrza zaliczamy metody mikroskopowe oraz metody hodowlane do których należą takie metody jak: metoda sedymentacyjna Kocha, metoda uderzeniowa, metoda membranowa i metoda płuczkowa.

Część praktyczna:

W tej części badaliśmy czystość powietrza w laboratorium za pomocą metody sedymentacyjnej Kocha. Użyliśmy w tym doświadczeniu 3 podłóż, każde z nich po 300 ml. Były to podłoże Pochona, agar brzeczkowy i podłoże Chapmana plus dodatkowo dwie szalki z agarem odżywczym. Przygotowane podłoża rozlaliśmy każe do szalek. Rozmieściliśmy szalki w różnych częściach pomieszczenia i pozostawiliśmy otwarte na 10 minut a następnie po upływie określonego czasu odłożyliśmy do cieplarki na tydzień.

Wyniki:

Po tygodniu odczytaliśmy wyniki. (Ja odczytywałem wyniki z grupą 3). Suma kolonii wyrosłych na wszystkich szalkach z danym podłożem wygląda następująco:

• Agar brzeczkowy – 22 kolonie

• Podłoże Pochona – 0 kolonii

• Agar odżywczy – 18 kolonii

• Podłoże Chapmana – 17 kolonii w tym jedna kolonia gronkowców mannitolo-dodatnich

Po podstawieniu do wzoru , liczba drobnoustrojów w 1 m³ powietrza, po obliczeniach wyglądają następująco:

• Ogólna liczba bakterii – 707

• Liczba promieniowców – 0

• Liczba grzybów – 346

• Liczba gronkowców mannitolo-dodatnich- 26

• Liczba gronkowców mannitolo-ujemnych- 419

Wnioski:

Według tabeli 5.1 z konspektu o ocenie czystości powietrza na podstawie wskaźników mikrobiologicznych i naszych wyników możemy stwierdzić, że powietrze w laboratorium jest niezanieczyszczone. Wyniki są jednak niedokładne, gdyż metoda której użyliśmy pozwala na określenie tylko względnego zanieczyszczenia powietrza.

Rozdział 6 – Badania mikrobiologiczne gleb

Wstęp teoretyczny:

Gleba to zewnętrzna warstwa skorupy ziemskiej tworząca się w procesach wietrzenia chemicznego i fizycznego skał macierzystych, działania czynników naturalnych oraz człowieka.

Gleba składa się z pięciu zasadniczych frakcji i są to:

• Związki mineralne w stanie stałym – składające się z cząstek o różnej wielkości , powstałe ze skały macierzystej z których najdrobniejszą i najważniejszą frakcję stanowi frakcja ilasta (ił koloidalny). Koloidy glebowe są dogodnym siedliskiem dla bakterii, grzybów i glonów które tworzą na koloidach kolonie.

• Substancja organiczna – najważniejsza frakcja dla życia mikroorganizmów dostarczająca im węgla, azotu, energii i związków mineralnych. Substancja organiczna pochodzi z rozkładu resztek roślin wyższych, ciał mikroflory i mikrofauny. Stanowią ją również produkty przemiany materii organizmów glebowych i humus (próchnica).

• Powietrze glebowe - przeważa para wodna, ale obecne są też N₂, O₂, CO₂, tlenki azotu, węgla, siarki, siarkowodór, metan, i inne lotne substancje organiczne. Dwutlenku węgla w glebie jest średnio 10 razy więcej niż w powietrzu.

• Roztwory glebowe – woda krążąc w glebie nasyca się w pewnym stopniu dwutlenkiem węgla stając się tym samym słabym rozpuszczalnikiem. Rozpuszczają się w nim różne związki mineralne i organiczne dając roztwory glebowe.

• Organizmy glebowe – w glebie żyją różnorodne organizmy żywe które określa się mianem edafonu. Pod względem rozmiaru edafon można podzielić na mikrobiote, mezobiotę i makrobiotę. Bakterie w glebie występują najliczniej. Szczególnie liczne są promieniowce oraz maczugowce z rodzaju Arthrobacter. Na dalszych miejscach, pod względem liczebności plasują się grzyby, glony i pierwotniaki. Jeśli chodzi o klasyfikację drobnoustrojów glebowych to można podzielić je na grupy fizjologiczne takie jak np.: 1) autotrofy i heterotrofy, 2) prototrofy i auksotrofy neleżące do heterotrofów,3) tlenowce, beztlenowce i mikroaerofile, 4) psychrofile, mezofile i termofile 5) wrażliwe i niewrażliwe na zakwaszenie środowiska.

Jednakże podział najważniejszych mikroorganizmów glebowych sprowadza się do czterech grup jakimi są: drobnoustroje zymogeniczne, drobnoustroje autochtoniczne, drobnoustroje oligotroficzne i drobnoustroje autotroficzne.

Gleba przechodzi proces samooczyszczania, który następuje w wyniku szeregu procesów. Szybkość tego procesu zależy od typu gleby, rodzaju glebowej mikroflory, klimatu i rodzaju roślinności. Ocena stanu gleby obejmuje szereg badań, zależnie od tego czemu ma służyć. Dla przykładu w celu oceny stanu sanitarnego gleby stosuję się oznaczenia liczebności bakterii grupy coli typu ogólnego. Dla określenia przebiegu procesów samooczyszczania się gleby oznacza się np. ogólną liczbę bakterii mezofilnych. Można również stosować inne oznaczenia wskazujące na zanieczyszczenie gleby fekaliami, intensywność przebiegu procesów gnilnych czy kontakt gleby z odchodami człowieka lub zwierząt. Oznacza się w tych badaniach ilość określonych bakterii.

Część praktyczna:

W tej części ćwiczeń przeprowadzaliśmy doświadczenia służące wykazaniu obecności w glebie bakterii amonifikacyjnych i denitryfikacyjnych. Do tego celu przygotowaliśmy w kolbkach po 20 ml wody peptonowej podłoża z azotanem (V) potasu a następnie zaszczepiliśmy te podłoża niewielkimi próbkami gleby.

Rozdział 7 – Metabolizm mikroorganizmów

Wstęp teoretyczny:

W naturalnym środowisku przyrodniczym Ziemi występują zależności pomiędzy elementami nieożywionymi i ożywionymi. Obopólne oddziaływania pomiędzy elementami biocenoz umożliwiają zamknięty obieg pierwiastków. Jednymi z najważniejszych pierwiastków krążących w przyrodzie są np. węgiel, azot, siarka lub fosfor.

Wszystkie związki organiczne ulegają rozkładowi w warunkach tlenowych lub beztlenowych. Odpowiedzialne są za to odpowiednie drobnoustroje. Są to głównie bakterie, ale również grzyby, glony, pierwotniaki jak również robaki, owady i mięczaki.

Zdolności metaboliczne mikroorganizmów wynikają z obecności specjalnych enzymów w ich komórkach. W praktyce zdolności mikroorganizmów do metabolizmu wykorzystuje się w celach identyfikacyjnych określonego gatunku czy też rozróżniania poszczególnych gatunków o podobnej budowie. Z mikroorganizmów często pozyskuje się enzymy, które ułatwiają przyspieszanie pewnych procesów, które człowiek wykorzystuje na masową skalę.

W celach szybkiej identyfikacji biochemicznej mikroorganizmów stosuje się specjalne testy, jak np. test API 20 E. Podobnymi testami są Rapid 20 E, API 10 S lub API 20 NE.

Część praktyczna:

W tej części przygotowywaliśmy podłoża charakterystyczne dla danych reakcji metabolicznych mikroorganizmów. Później na tych podłożach zaszczepialiśmy otrzymaną bakterię. Przygotowane podłoża to:

• Agar zwykły- do barwienia metodą Gramma

• Podłoże Fraziera -do oznaczania proteolizy

• Podłoże skrobiowe- do wykrywania rozkładu skrobi

• Podłoże trójbutyrynowe- do wykrywania rozkładu tłuszczów

• Podłoża fermentacyjne na bazie wody peptonowej z dodatkiem sacharozy, glukozy, laktozy i mannitolu

• Podłoże z podwójnie stężoną wodą peptonową -do wykrywania indolu.

Po przygotowaniu podłoży odłożyliśmy probówki do sterylizacji a następnie zaszczepiliśmy je koloniami bakterii. Po zaszczepieniu probówki wstawiliśmy do cieplarki na tydzień.

Rozdział 8 – Mikroskopia i barwienie drobnoustrojów

Wstęp teoretyczny:

Pod pojęciem mikroskopia rozumiemy szczegółowe obserwowanie materiału biologicznego ( w tym drobnoustrojów) za pomocą urządzeń powiększających obraz – mikroskopów.

Mikroskopy można podzielić ze względu na ich budowę i będą to: mikroskopy proste, czyli lupa i mikroskopy złożone, które są już bardziej skomplikowanymi urządzeniami w porównaniu do lupy. Mikroskopy dzieli się również w zależności od mechanizmu uzyskiwania obrazu. Podział ten obejmuje mikroskopy świetlne i mikroskopy elektronowe.

Jeśli chodzi o mikroskopy świetlne to wyróżniamy: mikroskop świetlny zwykły, ciemnego pola, ultrafioletowy, fluorescencyjny, kontrastowo – fazowy i interferencyjny. Różnią się one cechami konstrukcyjnymi, charakterem pozyskanego obrazu oraz rodzajem wykorzystywanego promieniowania świetlnego.

Innym rodzajem mikroskopów są mikroskopy elektronowe. Zamiast światła jak w przypadku wyżej wymienionych mikroskopów, jest tu strumień elektronów a zamiast przyrządów optycznych mamy elektromagnesy. Są one również o wiele dokładniejsze, ze względu na możliwość bardzo dużego powiększenia. Można tutaj wyróżnić mikroskopy transmisyjne, skaningowe, odbiciowe czy rentgenowskie.

Drobnoustroje barwi się dlatego, ażeby je uwidocznić i odróżnić od innych elementów preparatu. Dokonuje się tego za pomocą specjalnych barwników, z których najbardziej popularne to: błękit metylenowy, fuksyna, safranina, zieleń malachitowa, fiolet goryczki, fiolet krystaliczny i metylenowy. W zależności od ilości zastosowanych barwników mówimy o barwieniu prostym lub złożonym. Pod względem wybarwianych elementów preparatu barwienie nazywamy pozytywnym, negatywnym lub negatywno – pozytywnym. Barwienie przyżyciowe stanowi odmienną kategorię.

Najbardziej podstawowym w mikrobiologii barwnikiem jest barwienie metodą Grama. Ta metoda dzieli bakterie na Gram-dodatnie i Gram-ujemne. Różnią się one budową i składem ściany komórkowej. Dzięki tym różnicom po barwieniu można łatwo odróżnić od siebie poszczególne mikroorganizmy.

Cześć praktyczna:

W tej części zajęć zajmowaliśmy się barwieniem oraz wykonywaliśmy testy mające na celu zidentyfikować gatunek bakterii która została nam przydzielona na zajęciach poprzednich.

Na początku zajęć robiliśmy preparaty, które później barwiliśmy. Preparaty robiliśmy poprzez rozmaz bakterii z podłoża z agarem (lub skrobią jeśli komuś na agarze zwykłym nie wyrosły żadne kolonie) z szalek z bakteriami które zaszczepiliśmy na poprzednich zajęciach, na szkiełku podstawowym, uprzednio potraktowanym kroplą soli fizjologicznej. Po zrobieniu rozmazu, preparat należało utrwalić nad ogniem palnika. Następnie przystąpiliśmy do barwienia metodą Grama, która to polegała na barwieniu preparatów kolejno w następujących barwnikach:

1. Fiolet krystaliczny przez 2 – 3 minuty

2. Płyn Lugola przez 1.5 – 2 minuty

3. Etanol 30 sekund

4. Safranina 20 sekund

Po barwieniu preparaty pozostawiliśmy do wyschnięcia. W międzyczasie wykonaliśmy test na obecność katalazy, który polegał na pobraniu ezą próbki z podłoża ze skrobią lub z agarem zwykłym i obserwacji czy wydzielają się pęcherzyki powietrza przy kontakcie z kroplą H₂O₂. W przypadku kiedy pęcherzyki powietrza wydzielają się, wynik testu uznać można za pozytywny jak to było w moim przypadku.

Następnym testem był test na obecność oksydazy cytochromowej. Polegał on na pokropieniu, uprzednio przygotowanym odczynnikiem Kovasca patyczka z wymazem z podłoża ze skrobią lub z agaru. Wynik pozytywny był wtedy, kiedy zaobserwowaliśmy zabarwienie wacika na kolor granatowy. W moim przypadku wynik był pozytywny.

Wykonaliśmy również testy na obecność żelatyny w podłożu i rozkład skrobi poprzez zastosowanie odczynnika Fraziera na podłoże Fraziera i płynu Lugola na podłoże ze skrobią. W przypadku podłoża Fraziera, jeśli zmieniło ono barwę na kolor biały to oznacza że żelatyna jest obecna, w innym przypadku nie. U mnie wynik na obecność żelatyny wyszedł pozytywny. W przypadku podłoża ze skrobią, również uzyskałem wynik pozytywny, gdyż podłoże zmieniło barwę na kolor brązowy, co świadczy o rozkładzie. Testów na rozkład tłuszczów w podłożu z trójbutylyną nie wykonywaliśmy, wobec tego w tym przypadku brak wyników.

Odczytaliśmy wyniki w probówkach z mannitolem, laktozą, sacharozą i glukozą z poprzednich zajęć. W probówkach z laktozą, sacharozą i glukozą zaszły reakcje chemiczne, nastąpiła fermentacja, co wnioskujemy po zmianie barwy na żółtą. W probówce z mannitolem reakcja nie zaszła. Natomiast w celu sprawdzenia reakcji wytwarzania indolu, wprowadziliśmy kilka kropel odczynnika Kovasca do wody peptonowej. Jeśli reakcja miałaby miejsce to powinien pojawić się czerwony pierścień w górnej części roztworu, wtedy wynik byłby pozytywny. W moim przypadku reakcja nie zaszła, w związku z tym wynik na wytwarzanie indolu jest negatywny.

Po wykonaniu wszystkich prób i po wyschnięciu zabarwionych szkiełek z rozmazami bakterii przystąpiliśmy do obserwacji ich pod mikroskopem, najpierw w tradycyjny sposób, następnie z zastosowaniem olejku immersyjnego.

Wnioski:

Po obserwacji wyglądu kolonii pod mikroskopem, stwierdzenia jej kształtu, rodzaju skupisk, zabarwienia oraz na podstawie tabelki z bakteriami doszedłem do wniosku, iż moja bakteria (nr 126) to Bacillus megaterium.