TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

1. zagadnienia z poprzednich zajęć (+ materiały - będziemy kończyć omawianie roztworów i zagadnień związanych z restryktazami)

2. ruchliwość DNA w żelu

3. rola składników zawartych w 6xSB

4. różnica w długości fali podczas obserwowania żeli analitycznych i preparatynych

Ruchliwość DNA w żelu:

Czynnik	dsDNA liniowy	dsDNA superskręcony
Długość	Im dłuższy tym mniejsza ruchliwość	Im dłuższy tym mniejsza ruchliwość
Stężenie agarozy	Im wyższe tym mniejsza ruchliwość	IELEKTROFOREZA PREPARATYWNA W ŻELU AGAROZOWYM m wyższe tym mniejsza ruchliwość
Napięcie	Im wyższe tym większa ruchliwość*	Im wyższe tym większa ruchliwość*
Bromek etydyny	Im wyższe stężenie bromku tym mniejsza ruchliwość	**
Stopień superskręcenia	-	Im większy, tym większa ruchliwość

*przy zbyt wysokim napięciu wydziela się dużo ciepła, struktura żelu może ulec zniszczeniu

** u bakterii DNA jest skręcone ujemnie, w prawo (plektonemicznie), a bromek etydyny dodaje dodatnie skręty. Superskręcone DNA wędruje w żelu szybciej niż liniowe, więc do pewnego momentu ruchliwość będzie spadać wraz ze wzrostem stężenia bromku (rozwijanie skrętów ujemnych do liniowego DNA) a potem wraz ze wzrostem stężenia bromku zacznie wzrastać ruchliwość (bo gdy już będzie liniowe DNA zaczną być wprowadzane dodatnie superskręty) – „uśmiechnięty” wykres zależności ruchliwości od stężenia bromku, ale „smutny” żel.

6xSB

- błękit bromofenolowy

- ksylenocyjanol

- ficoll

Funkcje:

- zwiększenie gęstości próbki

- nadanie koloru probce

- zawiera barwniki, które poruszają się w kierunku anody z przewidywalnymi szybkościami: błękit bromofenolowy migruje w żelu agarozowym (0,5-1,4%) w ~ z tą samą szybkością, co liniowy dsDNA o długości 300 pz, a ksylenocyjanol ~ liniowy dsDNA o długości 4000 pz

Żele preparatywne oglądamy przy długości fali 365 nm, ze względu na to, że będziemy dalej używać zawartego w żelu DNA i nie chcemy, żeby zmutowało(powstawanie par T-T itp.) pod wpływem UV. Fala o długości 365 nm ma mniejszą energię niż 254 nm i ponad to jest adsorbowana bezpośrednio przez bromek etydyny, w przeciwieństwie do 254 nm, która jest przekazywana na bromek przez DNA. Żele analityczne oglądamy przy 254 nm, bo nie będziemy wykorzystywać dalej zawartego w żelu DNA więc jest nam wszystko jedno czy zmutuje, a przy 254 nm jest większa czułość niż przy 365 nm.

Agaroza jest liniowym polimerem składającym się z naprzemiennych reszt D oraz L-galaktozy połączonych alfa-(1->3) i beta-(1->4) wiązaniami glikozydowymi.

Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym:

-wielkość DNA-duże cząsteczki migrują wolniej niż małe z racji większych oporów tarcia oraz występowania w żelu porów

-stężenie agarozy

-konformacja DNA-mobilność poszczególnych form DNA zależy od: stężenia i rodzaju agarozy, przyłożonego napięcia, siły jonowej buforu, gęstości skręceń w formie superskręconej

-obecność bromku etydyny-interkalacja bromku etydyny w DNA powoduje spadek ujemnego ładunku i wzrost sztywności

-przyłożone napięcie (powinno być 5-8 V/cm)

-rodzaj agarozy

-bufor do elektroforezy-przy braku jonów przewodnictwo jest małe i DNA migruje wolno, gdy siła jonowa jest duża przewodnictwo jest dobre i generuje to znaczną ilość ciepła-żel i DNA mogą się zdenaturować

Bufory do elektroforezy

-TAE: Tris-acetate (octan), EDTA (pH 8.0; TAE)-nazywany również buforem E, najmniejsza pojemność buforowa, jeżeli elektroforeza jest prowadzona długo anodowa porcja żelu staje się kwasowata i bromofenol zmienia swoje zabarwienie z niebieskawo-filoetowego na żółte, dsDNA migruje w nim 10% szybciej niż w TBE czy TPE, zdolność rozdzielcza jest lepsza dla dużych cząsteczek DNA i gorsza dla małych

-TBE: Tris-borate (boran)

-TPE: Tris-phosphate (fosforan) (pH 7.5-7.8)

Gel-loading buffers

-zwiększają gęstość próbki zapewniając, że DNA wpadnie do studzienki

-dodają kolor ułatwiając proces nanoszenie na żel

-zawierają barwniki, które migrują w żelu: bromofenol jak 300 pz, ksylenocyjanol jak 4000 pz

Bromek etydyny

Zawiera 3 grupy pierścieniowe, które interkalują w DNA, jedna cząsteczka bromku etydyny interkaluje na 2,5 pz. Po wniknięciu leży prostopadle do osi i tworzy wiązania van der Waalsa z parami zasad leżacymi ponad oraz poniżej. Promieniowanie UV przy długości 254 nm jest absorbowane przez DNA i przekazywane do barwnika, 366 nm jest absorbowane bezpośrednio przez barwnik. Służy do wykrywanie jedno i dwuniciowych cząsteczek DNA i RNA, powinowactwo do jednoniciowych jest słabe dlatego fluorescencja jest słaba. Nie używamy go przy żelach poliakrylamidowych, ponieważ jest inhibitorem polimeryzacji akrylamidu. W obecności bromku etydyny prążki są mniej wyraźne.

Bromek wędruje w żelu w przeciwną stronę do DNA. DNA jest ujemnie naładowany więc wędruje do anody (elektrody dodatniej).

W przypadku naszego ćwiczenia elektroforeza preparatywna służyła wyizolowaniu tylko zlinearyzowanego wektora. Wyeliminowano zanieczyszczenia, EDTA i wszelkie aktywności enzymatyczne (BamHI, fosfatazę).

Bufor do elektroforezy preparatywnej musi być świeży, a żel agarozowy idelanie czysty.

Defosforylacja nie przebiega w 100%

Żeby sprawdzić jaki mamy stosunek transformantów do rekombinantów robimy 2 posiewy:

Aby zapobiec religacji wektora używamy 2 enzymów restrykcjnych, które tworzą inne końce. Mimo wszystko należy się zdefosforylować nawet przy takim trawieniu kierunkowym (bo kilka cząsteczek wektora może zostać strawione tylko przez 1 enzym i wtedy już są komplementarne końce).