Reakcja łańcuchowa polimerazy

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) – łańcuchowa reakcja polimerazy, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika została wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa z kalifornijskiej firmy Cetus, za co Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.

PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w badaniach nad genomem, charakterystyce ekspresji genów, klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, paleontologii.

Składniki mieszaniny reakcyjnej

Do reakcji wprowadza się:

• matrycowy DNA,

• bufor do polimerazy (PH i jony)

• trifosforany deoksyrybonukleozydów,

• startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do fragmentów matrycy, znajdujących się na obu końcach interesującego na genu. Wyróżniamy dwa typy starterów: starter przedni (forward)[I] - jego sekwencja musi być taka sama jak sekwencja powielana; starter wsteczny (reverse)[II] - jego sekwencja musi być komplementarna do powielanej.

• termostabilną polimerazę DNA - np. polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej.

• Mg ²⁺, H₂O

Czasem dodaje się jeszcze innych składników np. roztworu tRNA zabezpieczającego adsorbcji innych składników mieszaniny na ściankach naczynia, barwniki i wskaźniki informujące o przebiegu reakcji (szczególnie w modyfikacjach PCR) i inne.

Przebieg reakcji

Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach. Można zatem wymuszać je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmianę temperatury mieszaniny reakcyjnej.

1. Denaturacja. Pierwszym etapem jest rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA (lub mRNA, jeśli stanowi matrycę). W wysokiej temperaturze (zwykle około 95 °C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95° na 15 sekund.

2. Annealing [przyłączenie starterów] - hybrydyzacja odcinków starterowych. Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składających się z przygotowanych starterów - cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen mający ulec namnożeniu - z matrycową cząsteczką DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-60 °C), przyłączają się one do matrycy. Ponieważ roztwory primerów są dodawane w dużym nadmiarze w stosunku do matrycy, jest bardzo mało prawdopodobne, żeby na tym etapie, zamiast hybryd starter-matryca utworzyły się hybrydy połączonych się ze sobą dwóch nici matrycy.

3. Elongacja [wydłużanie DNA] - Na tym etapie zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 °C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund.

Następnie cykl powtarza się i w kolejnym etapie annealingu i elongacji jako matryca mogą służyć wszystkie zsyntetyzowane dotychczas cząsteczki genu. W ten sposób reakcja, dopóki substraty i enzym są w wystarczającej ilości, zachodzi coraz szybciej, powodując coraz większy przyrost kopii genu na etapie elongacji.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n cząsteczek. W praktyce wydajność procesu jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie pożądanego łańcucha DNA. Konwencjonalna technika PCR pozwala na namnażanie łańcuchów DNA o maksymalnej długości ok. 10 kpz.

Zalety metody

PCR jest bardzo użytecznym narzędziem w różnego typu badaniach genetycznych ponieważ:

• Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu - wystarczy znajomość sekwencji nukleotydów w odcinkach oskrzydlających gen.

• Stosowane startery nie muszą być komplementarne do matrycy w 100%. Pozwala to na amplifikację wariantów tego samego genu, które różnią się od siebie niewielkimi zmianami w sekwencji.

• Jednocześnie jest to metoda specyficzna - przy doborze odpowiednich starterów, powielaniu ulega tylko jeden odcinek DNA

• Jest to metoda bardzo czuła. Pozwala na wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA.