Joanna Kwiotek 181833

Cewniki powlekane nanocząsteczkami srebra – inhibicja powstawania biofilmu bakterii Staphylococcus Aureus

Synteza nanocząsteczek srebra

Z celu produkcji nanocząsteczek srebra przeprowadzono reakcję redukcji. Substratami reakcji były: 0.1M azotan srebra, 0.1M cytrynian sodu, 0.1M borowodorek sodu. Otrzymanie oczekiwanego produktu zostało potwierdzone poprzez obserwację zmiany koloru roztworu – z blado żółtego w brązowy, spektroskopię UV-VIS oraz obrazowanie mikroskopem elektronowym (SEM)

Ocena wpływu nanocząsteczek srebra na inhibicję wzrostu bakterii

Klinicznie wyizolowane bakterie zostały pozostawione przez noc w bulionie odżywczym. Następnie po rozcieńczeniu zawiesiny 100krotnie zostały pozostawione na kolejną godzinę. Po tym czasie na próbkę (talerz) zawierający 96 studzienek dodawano po 100μl zawiesiny i różne stężenia nanocząsteczek srebra ( 25,50,75,100 μg/ml). Tak przygotowane próbki inkubowano przez 3 dni w 37 C. Po tym czasie usunięto medium zaś szczep przemyto 100 ul 1% wodnego roztworu fioletu krystalicznego. Po 30 minutach (temperatura pokojowa) usunięto barwnik, następnie do próbek dodano 95% etanol i inkubowano 15min. Po tym czasie przeprowadzono pomiar spektrofotometryczny przy długości fali 570nm. Na podstawie wyników obliczono procent inhibicji wg wzoru:

Wpływ nanocząsteczek srebra na powstawanie biofilmu na cewniku

W badaniach użyto wysterylizowanego cewnika o pojemności 2000ml. Cewnik pocięto na kawałki o długości 1,5cm i 10 losowych próbek zanurzono w 190ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej po czym wymieszano. Następnie seryjnie rozcieńczoną zawiesinę zaszczepiono posiewem dywanowym na płytkach z podłożem z agarem odżywczym oraz z agarem z glukozą ziemniaczaną. Zaszczepione płytki z agarem odżywczym inkubowano w 37C przez 24 do 48h zaś z agarem „ziemniaczanym” w 28C przez 3do 4 dni. Po czasie inkubacji nie zaobserwowano wzrostu bakterii i grzybów co wskazuje na sterylność fragmentów cewnika.

Powlekanie cewnika nanocząsteczkami srebra

Kawałki cewnika zanurzono w mono dyspersyjnym roztworze koloidalnego nano-srebra o stężeniu 100ul i trzymano przez 24h w 37C. Po tym czasie w próbek usunięto nadmiar zawiesiny i wysuszono w 50C. Topografię podłoża badano następnie pod mikroskopem elektronowym (SEM).

Analiza inhibicji powstawania biofilmu

Cewnik pokryty nanocząsteczkami srebra zanurzono w 10ml zawiesiny bakterii na 24h (37C). Po czasie inkubacji próbki przemyto 0,1% roztworem fioletu krystalicznego. Następnie kawałki cewnika przemyto trzykrotnie 95% etanolem. Tak oczyszczony roztwór badano spektrofotometrycznie przy długości fali 570nm. Na podstawie wyników obliczono procent inhibicji wg wzoru:

Badanie inhibicji cząstek pokrytych nano-srebrem w obecności antybiotyków

Badanie przeprowadzono dla trzech antybiotyków: cephalexinu, oflaxacinu, neoflaxinu. Antybiotyki rozcieńczone 100krotnie rozpuszczono w 10ml dejonizowanej wody. Następnie 5ml powstałego roztworu zmieszano z 5ml nano-srebra. Mieszanie z mieszadłem magnetycznym utrzymywano przez 3h w 40C. Otrzymany homogenat wysuszono w 50C. otrzymany suchy produkt zawieszono w 100ml wody dejonizowanej. W tak otrzymanym roztworze zanurzono kawałki cewnika. Po czasie inkubacji ( 37C,24h) kawałki cewnika wysuszono w 50C.

WYNIKI

Synteza nano-srebra została potwierdzona przede wszystkim poprzez zmianę koloru roztworu. Brązowe zabawienie pojawiało się po dodawaniu kroplami borowodorku sodu i cytrynianu sodu. Zsyntetyzowane Nanocząsteczki srebra pojawiają się na spektroskopii UV-VIS w postaci piku przy 420nm. Rozmiar (40-60nm) i kształt cząsteczek został zobrazowany na obrazie mikroskopowym (SEM).

Analiza spektrofotometryczna wykazała, że wszystkie każde badane stężenie powoduje inhibicję powstawania biofilmu. Maksimum inhibicji przypada na stężenie 100ug/mg.

Matriks biofilmu składa się prawie wyłącznie z całych węglowodanów i białek. Ilość tychże zmniejsza się w każdym teście – po dodaniu nanocząsteczek, powleczeniu nimi cewnika oraz w teście z antybiotykami. Zaobserwować można synergiczny efekt inhibicji. Stężenie węglowodanów i białek w biofilmie zmniejsza się w każdym kolejnym doświadczeniu.

Obrazowanie mikroskopem elektronowym wyraźnie potwierdza, że powlekanie cewnika nano-srebrem przebiegło pomyślnie. Na powierzchni wyraźnie obserwować można cząsteczki srebra. Inhibicja powstawania biofilmu na cewnikach powleczonych nano-srebrem wzrasta wraz z czasem inkubacji (zanurzenie cewnika w roztworze nano-srebra). Kompletna inhibicja notowana jest przy czasie inkubacji równym 18h. Obraz SEM pokazuje kompletną degradację biofilmu.

Dowiedziony został synergiczny efekt inhibicji biofilmu podczas stosowania antybiotyków. Każdy z badanych antybiotyków wykazał kompatybilność z nanocząsteczkami srebra. Całkowite stężenie węglowodorów i białek w matriks biofilmu jest znacznie niższe , gdy cewnik powleczony został roztworem antybiotyku i nano-srebra. Największy procent inhibicji obserwujemy przy użyciu oflaxacinu (99,1%)