Mikromanipulacje na gametach i -zarodkach ssaków

Mikromanipulacje – techniki pozwalające manipulować pojedynczymi komórkami i zarodkami

Mikromanipulacje prowadzone na komórkach płciowych i zarodkach ssaków podzielić można na dwie grupy:

- zabiegi, które nie wymagają ingerencji w wnętrze komórki i zarodka

- zabiegi naruszające integralność komórki czy zarodka

Zabiegi, które nie wymagają ingerencji w wnętrze komórki i zarodka

- oczyszczanie oocytów z komórek warstwy ziarnistej

- hodowla i zapłodnienie oocytów in vitro

- aktywacja oocytów

- otrzymywanie chimer metodą agregacji całych zarodków

Zabiegi naruszające integralność komórki czy zarodka (mikrochirurgiczne)

- Usuwanie osłonki przejrzystej z oocytów oraz z bruzdkujących zarodków

* metodą najmniej szkodliwą jest mechaniczne usunięcie osłonki za pomocą cienkich szklanych igieł, co wymaga wprawy i przy większej liczbie zarodków jest zabiegiem czasochłonnym

* trawienie enzymatyczne lub działanie kwaśnego płynu Tyrode’a

Enzymy: pronaza, α-chymotrypsyna, trypsyna

α-chymotrypsynę stosuje się najczęściej do usuwania osłonki z niezapłodnionych oocytów, pronazę z kolei do trawienia osłonek bruzdkujących zarodków

Zalecane jest enzymatyczne nadtrawienie osłonki, a następnie całkowite jej mechaniczne usunięcie np. poprzez pipetowanie

Czynnikiem najszybciej usuwającym osłonki jest kwaśny płyn Tyrode’a o pH 2,5 z dodatkiem poliwinylopirolidonu. Szybkość wymaga manipulowania jednym najwyżej trzema zarodkami. Zarodki należy przełożyć do pożywki przed całkowitym zanikiem osłonki w przeciwnym razie przywrą one bardzo silnie do podłoża.

Jeżeli zachodzi konieczność ponownego wprowadzenia do jajowodu zarodków, z których usunięto osłonkę należy przeszczepić je do osłonek zastępczych (tan sam gatunek lub inny)

Zatapianie zarodków przeszczepionych do osłonek w bloczkach agarowych, a następnie wprowadzenie takich bloczków do jajowodu, w jednym bloczku można umieścić zarodki pochodzące z jednej grupy doświadczalnej

Opracowanie technik dojrzewania i zapłodnienia in vitro oocytów wielu gatunków zwierząt stanowiło istotny krok w udoskonaleniu metod produkcji zwierzęcej.

Zapłodnienie może być osiągnięte poprzez zastosowanie następujących technik mikrochirurgicznych

- częściowego rozcięcia osłonki przejrzystej (PZD)

- zrobienia w niej niewielkiego otworu (ZD) lub tylko przebicie jej cienką szklaną igłą (ZP)

Mikrochirurgia osłonki przejrzystej ma na celu ułatwienie plemnikom wniknięcia do przestrzeni około żółtkowej, ułatwiając penetrację komórki jajowej:

- wprowadzenie plemników pod osłonkę przejrzystą do przestrzeni około żółtkowej (SZI, SUZI)

* mechaniczne wprowadzenie jednego, częściej kilku plemników do przestrzeni około żółtkowej oocytu. Nie dochodzi do naturalnej selekcji plemników podczas przechodzenia przez osłonkę. Liczba plemników jest sprawą otwartą różni autorzy podają od 1 do 20 plemników. Zbyt mała liczba plemników zmniejsza szansę zapłodnienia, zwiększenie ich liczby może prowadzić do wzrostu liczby oocytów polispermicznych

- wprowadzenie plemników bezpośrednio do cytoplazmy oocytu (ICSI) *najbardziej inwazyjna, eliminuje zmiany zachodzące w główce plemnika podczas przechodzenia przez osłonkę przejrzystą

U bydła jednak mechaniczne wprowadzenie plemnika do oocytu nie jest wystarczające do jego aktywacji jak u człowieka czy królika. Oocyty bydlęce muszą być dodatkowo aktywowane np. impulsami prądu elektrycznego, aby mogło dojść w nich do wytworzenia przedjądrzy i dobrego rozwoju

Po raz pierwszy zapłodnienie oraz rozwój do urodzenia w następstwie mikrochirurgii osłonki przejrzystej uzyskali Gordon i Tolansky w 1986r.

Przerwanie ciągłości osłonki przejrzystej nie pozostaje bez wpływu na rozwój przynajmniej części operowanych oocytów - następstwem zrobienia otworu w osłonce może być tworzenie się blastocyst bliźniaczych

Chimery – organizmem chimerowym lub allofenicznym określa się w biologii organizm zbudowany z komórek pochodzących z dwóch różnych (lub więcej) organizmów różniących się tym samym wyraźnie pod względem genetyczny.

Chimer uzyskać można u ssaków trzema metodami

- agregacja dwóch lub więcej bruzdkujących zarodków

- iniekcja komórek do jamy blastocysty – może być przeprowadzona tylko, gdy blastocysty są jeszcze w osłonce przejrzystej (po jej usunięciu przebicie ściany trofoblastu nie jest możliwe)

- rekonstrukcja zarodków w stadium blastocysty – specyficzny rodzaj uzyskiwania chimer, sam zarodek nie będzie chimerą.