sprawozdanie ćw 1

Ćwiczenie 1: Chromatografia bibułowa aminokwasów.

1. Odczynniki:

-wywoływacz ninhydrynowa- 0,5% roztwór ninhydryny w acetonie

-wodne roztwory wzorców aminokwasów

-wodne roztwory mieszaniny aminokwasów

-faza ruchoma: n- butanol: kwas octowy: woda w stosunku (4:1:1)

-zlewka jako komora chromatograficzna

2. Wykonanie:

Z bibuły Whatman wyciąć pasek o wymiarach 5,5x8 cm, na który w odległości 0,5-1cm od dolnej krawędzi bibuły nanieść za pomocą kapilarek, roztwory dwóch wybranych aminokwasów oraz mieszaninę aminokwasów. Miejsca z naniesionymi plamkami wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza (np. w suszarce lub suszarką do włosów). Następnie, tak przygotowaną bibułkę umieścić w komorze chromatograficznej (zlewka przykryta szalką Petriego) i rozwijać w układzie rozpuszczalników. Proces rozdziału zakończyć z chwilą, gdy czoło fazy rozwijającej dojdzie do wysokości około 0,5-1cm od górnej krawędzi bibuły. Po wyjęciu i wysuszeniu paska bibuły w strumieniu ciepłego powietrza, spryskać go roztworem 0,5% ninhydryny w acetonie, a następnie wysuszyć go w strumieniu ciepłego powietrza. Tak przygotowany chromatograf jest gotowy od identyfikacji aminokwasów znajdujących się w badanej mieszaninie. Aby określić różnice w migracji badanych aminokwasów wyznacza się współczynnik podziały Rf.


$$\text{Rf} = \frac{\text{Odleg}losc\ \text{od}\ s\text{rodka}\ \text{plamy}\ \text{do}\ \text{miejsca}\ \text{startu}}{\text{Odleg}losc\ \text{od}\ \text{miejsca}\ \text{startu}\ \text{do}\ \text{czo}la\ \text{fazy}\ \text{rozwijajacej}}$$

3. Obserwacja płytek:

G- glicyna

C-cysteina

F- fenyloalanina

M-mieszanina

  1. Bibuła z fazą ruchomą G- naniesiony roztwór na linii startu, powstała jedna plamka. Odeszła od linii startu na odległość 2,2cm.

  2. Bibuła z fazą ruchomą F- naniesiony roztwór rozdzielił się na jedną plamkę, która odeszła od linii startu na odległość 4,7cm.

  3. Bibuła z fazą ruchomą C- naniesiony roztwór rozdzielił się również na jedna plamkę, która odeszła od linii startu na odległość 2,7cm.

  4. Bibuła z fazą ruchomą M- naniesiona mieszanina na linii startu, powstały trzy wyraźne plamki, których granice są widoczne. Plamki oddzieliły się o około 1,4 cm, 2,9cm oraz 4,9cm od linii startu .

Na bibułkę o wymiarach 5,5 x 8 cm nanosimy wzorce roztworów aminokwasów oraz mieszaninę aminokwasów w kolejności: -glicyna, - fenyloalanina, - cysteina, -mieszanina zachowując miedzy nimi odstęp ok. 0,7cm. Następnie bibułkę umieściliśmy w komorze chromatograficznej i czekaliśmy aż czoło fazy ruchomej osiągnie linie mety. Bibułkę wyjęłyśmy i osuszyłyśmy za pomocą suszarki. Z obserwacji bibułki wynika, że w komorze chromatograficznej faza ruchoma M mieszanina rozdzieliła się najlepiej. Zaobserwowaliśmy trzy oddzielne plamki z wyraźnie zaznaczonymi granicami między nimi oraz w różnych odcieniach fioletu oraz żółci, na podstawie których wnioskujemy, iż jest to mieszanina trzech roztworów: -glicyna, - fenyloalanina, - cysteina.

5. Obliczenia:

Współczynnik retencji obliczamy ze wzoru:

Rf = a/b, gdzie:

a – droga migracji roztworu [mm]

b – droga przebyta przez fazę ruchomą [mm]

RfG= 22/65=0.34

RfF= 47/65=0.72

RfC= 27/65=0,42

RfMG= 14/65=0.22

RfMC= 29/65=0.45

RfMF= 49/65=0.75

6. Obserwacja płytki z wybraną reakcja ruchomą:

Rodzaj plamki Droga przebyta przez roztwór [mm] Droga przebyta przez czoło fazy ruchomej [mm] Współczynnik retencji
-glicyna 22 65 0,34
- fenyloalanina 47 65 0,72
-cysteina 27 65 0,42
Mieszanina G 14 65
F 49 65
C 29 65

7. Wnioski:

-Prędkość przemieszczania się każdej reakcji jest wielkością indywidualną i zależną od siły oddziaływań z fazami, a więc na bibułce chromatograficznej powstają plamki położone w różnej odległości od linii startu.

-Współczynnik retencji jest wielkością charakterystyczną dla danej reakcji, w określonych warunkach chromatograficznych. Możemy go policzyć dzięki migracji tej reakcji.

- Mieszanina została rozdzielona na 3 składniki, dzięki nim można stwierdzić, że jest ona mieszaniną trzech wzorców.

-Przy porównaniu współczynnika retencji powstałych reakcji wyniki wyszły zgodne. Składniki fenyloalaniny i cysteiny wyszły prawidłowo lecz wynik glicyny wyszedł z minimalną różnicą, jak wynik DNA naszej mieszaniny.

- Na naszej bibułce w przy reakcji C znajduje się ślad lekko fioletowy, który może oznaczać rozkład naszej cysteiny.

- Jasnożółte plamy na bibułce mogą świadczyć o zanieczyszczeniach w roztworze.

I. Obliczenia reszty grup:

a) gr. I

RfG= 14/61=0.23

RfF= 47/61=0.77

RfC= 24/61=0,39

RfMG= 0.8/61=0.13

RfMC= 24/61=0.39

RfMF= 47/61=0.77

Rodzaj plamki Droga przebyta przez roztwór[mm] Droga przebyta przez czoło fazy ruchomej [mm] Współczynnik retencji
-glicyna 14 61 0,23
- fenyloalanina 47 61 0,77
-cysteina 24 61 0,39
Mieszanina G 14 61
F 47 61
C 24 61

Wnioski: Współczynnik retencji różni się minimalnie: mieszanina G z reakcja glicyny.

b)gr. II

RfG= 20/68=0.29

RfF= 53/68=0.77

RfC= 29/68=0,42

RfMG= 19/68=0.28

RfMC= 31/68=0.46

RfMF= 56/68=0.82

Rodzaj plamki Droga przebyta przez roztwór[mm] Droga przebyta przez czoło fazy ruchomej [mm] Współczynnik retencji
-glicyna 20 68 0,29
- fenyloalanina 53 68 0,77
-cysteina 29 68 0,42
Mieszanina G 19 68
F 56 68
C 31 68

Wnioski: Współczynnik retencji danej reakcji różni się minimalnie z wynikami DNA naszej mieszaniny.

c)gr. III

RfG= 10/64=0.29

RfF= 24/64=0.77

RfC= 11/64=0,42

RfMG= 0,8/64=0.13

RfMC= 25/64=0.39

RfMF= 48/64=0.75

Rodzaj plamki Droga przebyta przez roztwór[mm] Droga przebyta przez czoło fazy ruchomej [mm] Współczynnik retencji
-glicyna 10 64 0,29
- fenyloalanina 24 64 0,77
-cysteina 11 64 0,42
Mieszanina G 0.8 64
F 48 64
C 25 64

Wnioski: Współczynnik retencji danej reakcji różni się minimalnie z wynikami DNA naszej mieszaniny.


Wyszukiwarka