POZNAWANIE EWOLUCJI

Rodzina molekularna - członkowie mają wspólne cechy np. człowiek i szympans. Żeby to wykryć porównuje się też budowę przestrzenną.

Rybonukleaza bydlęca - budowa 3D -> bardzo podobna do rybonukleazy człowieka. Nie jest to zaskakujące xD ale np. już taka angiogenina, która stymuluje tworzenie naczyń krwionośnych również jest podobna do rybonukleaz. I obie zalicza się od tej samej rodziny białek, więc musiały mieć wspólnego przodka.

Niestety oznaczono struktury przestrzenne niewielkiej liczby białek. ;( SOOO SAD ;( ale jest dostępnych dużo sekwencji genów i odpowiadające im aminokswasy. Pokrewieństwo ewolucyjne pojawia się także w sekwencjach aminokwasów. Np. bydlęca rybonukleaza i angiogenina są w 35 % takie same.

W tym rozdziale każdą nam się przyglądać metodom porównywania sekwencji AK i wnioskowania o ewolucyjnym pokrewieństwie xD

Metody porównywania sekwencjii stały się potężnym narzędziem nowoczesnej biochemii. Porównuje się też sekwencje przestrzenne, bo czasami mówią więcej niż normalne.

Jak se sekwencjonujemy to też możliwa jest ustalenie kiedy jakaśtam ewolucja zaszła. Tak się konstruuje drzewa ewolucyjne od Archea i Bacteria przez Eukarya z człekiem wlącznie. DNA pochodzące ze skamieniałości można powielać techniką PCR i sekwencjonować.

____________________________________________________________________________________

6.1 Cechy homologiczne pochodzą od wspólnego przodka

Badania ewolucyjne - w jaki sposób białka, inne cząsteczki i szlaki biochem. zmieniały się w czasie. Homologia -podst. związek pomiędzy 2ma jednostkami, cząsteczki homologiczne - pochodzą od jednego przodka.

Cząsteczki homologiczne można podzielić na dwie klasy: 1) Paralogi homologi w obrębie jednego gatunku, mają często różne funkcje biochem 2) ortologi homologi w różnych gatunkach, spełniają podobne lub identyczne funkcje biochem. PODOBNO GÓWNO PRAWDA XD

Homologia często przejawia się znacznym podobieństwem w sekwencji nukelotydowej lub aminokwasowej i niemal zawsze objawia sięw strukturze przestrzennej.

____________________________________________________________________________________

6.2 Analiza statystyczna przyrówań sekwencji może wykryć homologię.

2 podobne sekwencyjnie cząsteczki - wspólne pochodzenie ewolucyjne, taką samą strukturę 3D, funkcje i mechanizm działania. Żeby wykazać homologię, moża by było też DNA porównywać, ale one mają kwasów tylko 4. A AK jest 2, więc jest bardziej szczegółowe.

W celu zilustrowania metod porównawczych sekwencji będą rozważać klasę białek - globuliny. Mioglobina - białko wiążące tlen w mięśniach, hemoglobina - białko przenoszące tlen we krwi. Oba mają grupę hemową, organiczną cząst. zawierającą żelazo, która wiąże tlen. Każda cząst. hemoglobiny składa sie z 4rech łańcuchów polipeptydowych, zawierających: hem (po 2 identyko łańcuchy :alfa i 2 beta).Biorą tylko alfę i zamierzają sprawidzić podobieństwo jego do mioglobiny. Alby wykryć to podobieństwo opracowano metody przyrównania sekwencji.

W jaki sposób możemy wiedzieć jak dopasować do siebie sekwencje? Najprościej: porównanie ze sobą wszystkich możliwych zestawień jednej sekwencji białka z drugą i zliczeniu za każdym razem liczby identycznych reszt wstępujących w tej samej pozycji. Najlepsze przyrównanie sekwencji łąńcuchów: zawiera 23 identyczne reszty AK, rozrzucone wzdłuż środkowej części sekwecji. Inne dobre - 22 identyko. ale są usytuowane bliżej końca aminowego. Obie sekwencje można tak dopasować, aby zachować większość z identycznych pozycji występujących w obu przyrównaniach. Konieczne jest jednak wstawienie przerwy do jednej. Trza je wstawiać w celu kompresjonowania tych insercji lub delecji nukleotydów, które zachodziły w trakcjie ewolucji w genie jednej cząst.

Wprowadzanie tych przerw jednak komplikuje sprawę - procedurę tworzenia przyrównania. Są nawet mechaniczne metody wstawiania tych przerw i ich zliczania.

Istotność statystyczną przyrównania sekwencji można oszacować przez tasowanie

Na rysunku 6.5 (str 167). widać dużo podobnych AK, ale w sumie nie wiadomo czy one powstały przez przypadek czy celowo się tam znajdują. Jak to oszacować? Sekwencja aminokwasowa jednego z białek jest “tasowana” - losowo rearanżowana - po czym powtarza się procedurę przyrównania sekwencji.Proces powtarzany jest w celu uzyskania rozkładu, ukazującego dla każdej uzyskanej punktacji liczbę przetasowanych sekwencji, które uzyskały taki sam rezultat. Jeśli to zastosować do mioglobiny i hemoglobiny alfa to autentyczne przyrównanie zdecydowanie się wyróżnia., więc można stwierdzić że jest to nieprzypadkowe - są one homologami.

Odległe pokrewieństwo ewolucyjne można wykryć używając macierzy substytucji

Substytucje konserwatywne strukturalnie - zastępujące jeden AK innym o zbliżonej wielkości i podobnych właściwościach chemicznych - ma to względnie mały wpływ na strukturę białka, więc są tolerowane, bo nie wpływają na funkcję tego białka.

W przypadku innych substytucji AK może byc zastąpiąny innym, do niego podobnym. Co więcej niektóre substytucje są wywołane tylko zamianą jednego nukleotydu w sekwencji genu, podczas gdy inne wymagają dwóch/trzech zmian. Te konserwatywne są bardziej prawdopodobne, bo przy innych trzeba dużo zmian, co nie jest dobre. JAk możemy ocenic jaki to typ substytucji? SRAK xD Trza sprawdzic jakie substytucje faktycznie zachodzily w ewolucyjnie spokrewnionych białkach.

Na podstawie analizy prawidłowo przerównanych sekwencji można utworzy macierze substytucji. W nich przyznaje się wysoką dodatnią punktację substytucjom, które występują stosunkowo często. Ujemna punktacja - dla tych które pojawiają się rzadko. Przykładem takiej macierzy jest BLOSUM-62 (rys.6.9, str. 169). Zachęcam do zapoznania się z nią. Najwyzsza punktacja dla Cys i Trp - są częściej konserwatywne (niezmienne), niż Ser i Ala. Dośc wysoka punktacja przyznawana też strukturalnie konserwatywnym substytucjom jak zamiana Liz na Arg czy Ile na Val.

Podczas porównania 2óch sekwencji każdej substytucji przypisuje się punktację, wyznaczaną na podst. macierzy. Przerwom przypisuje się pkt. ujemną, zgodnie z jej długością.

System punktowania pozwala wykryc homologię między sekwencjami. Metoda bardziej dokładan niż porównanie tylko identycznych AK. Np. leghemoglobina z łubinu z mioglobiną człowieka. Zwykłe zliczanie 1:20 - niby pokrewieństwo, ale 5% że wynik jest dziełem przypadku. Macierz - to że nie przypadek jak 1 do 300.

Badania wykazały: dla sekwencji dłuższych niż 100 AK - identycznośc sekwencji większa niż 25% - wykazuje, że nie jest to dzieło przypadku, są to homologi. Jeśli mniej niż 15% podobieństwo z przypadku. Pomiędzy 15-25% trzeba dodatkowe analizy. Brak ststystycznej istotności stopnia podobieństwa sekwencji nie wyklucza homologii. Niektóre tak się pozmieniały, że nie da rady wykryc homologii tylko na podst. sekwencji.

W celu zidentyfikowania sekwencji homologicznych można przeszukiwac bazy danych

Pierwszy krok w analizie nowo syntezowanego białka jest porównanie go z sekwencjami zdeponowanymi w bazach danych. Najczęściej jest to baza: NCBI narodowe centrum informacji biotechnologicznej www.ncbi.nih.gov. Wykorzystuje się do tego procedurę przeszukiwania BLAST.

W 1995 roku opubikowano 1szą kompletną sekwencję organizmu wolnożyjącego., bakterii Haemophilus influenzae. Uzyskaną sekwencję DNA przetłumaczono na białka i porównano za pomocą BLASTu.

_______________________________________________________________________________

6.3 Badanie struktury przestrzennej wzbogaca naszą wiedzę o ewolucyjnym pokrewieństwie

Biocząsteczki funkcjonują jako skomplikowane przestrzennie cząteczki, a nie liniowe polimery. Mutacje zachodzą na poziomie sekwencji, ale pojawiają się na poziomie funkcji, ta jest związana z strukturą 3D (przestrzenną). Zatem trza te struktury przestrzenne posprawdzac bąki!

Struktura trzeciorzędowa jest bardziej konserwatywna niz pierwszorzędowa

Ponieważ struktura przestrzenna jest ściślej związ. z funkcją niż sekwencją, struktoura 3cio rzędowa jest bardziej konserwatywna ewolucyjnie niż 1szo rzęd. Jest to widoczne w strukturach 3cio rz. globin, które są fest podobne, mimo że podobieństwo między ludzką mioglobiną i leghemoglobiną z łubinu jest ledwie wykrywalne na poziomie sekwencji. a ludzkiej leghemoglobiny (łań. alfa) z leghemogl. łubinu nie jest statystycznie istotne (15.6% identycznych AK). Podobieństwo budowy silnie wskazuje, że struktura wiążąca gr. hemową i ułatwiająca odwracalne wiąz. tlenu pozostała zachowana w ciągu długiego czasu ewolucji.

Porównanie przestrzenne daje często zaskaujące wyniki. np. aktyna - składnik główny cytoszkieletu i białko szoku cieplnego Hsp-70, które wspomaga wewnątrzkom. zwijanie białek.. Strukturalnie bardzo podobne, sekwencyjnie tylko 15.6%. Na podstawie struktur - paralogi.

Wiedza o budowie przestrzennej może pomóc w ocenie przyrównania sekwencji

Te wszystkie opisane metody do teraz traktowały na równi wszystkie sekwencje. Jednak badania wykazały, że reszty AK leżące w rejonach niezbędnych do funkcjonowania białka sa bardziej konserwatywne niż pozostałe. Np. każdy typ globiny zawiera związaną grupę hemową, która w centrum ma atom żelaza. Reszta His, która bezpośrednio oddzaływuje z tym Fe jest konserwatywna we wszystkich globinach. Czasami po zdentyfikowaniu kluczowych reszt AK lub silnie konserwatywnych sekwencji w jakiejś rodzinie białek, możemy odnaleźć innych członków tej rodzinny, nawet jeśli oglóny poziom podobieństwa sekwencji jest nieistotny statystycznie. Stąd można tworzyc szablony sekwencji które pomogą w rozpoznawaniu nowych członków. Są to mapy koserwatywnych AK, które mają znaczenie strukturalne i funkcjonalne oraz są charakt. dla poszczególnych rodzin białek.

Przyrównanie sekwencji do niej samej pozwala wykryć powtórzone motywy

Ponad 10% białek zawiera zestawy 2óch lub więcej domen, które są do siebie podobne. Kiedy powtórzona jednostka nie odpowiada zidentyfikowanym wcześniej można porównac ją z nią samą. Istotnośc statystyczną takich powtórzeń mośna sprawdzic przyrónując badane regiony w taki sposób, jakby pochodziły one z oddzielnych białek. Dla białka wiążacego kasetę TATA przyrównanie jest znaczace: sposród 90 AK aż 30% jest identyczna. Przypadek jak 1 do 10^13. Białko jest tworzone przez 2 niemal identyczne domeny. dowody wskazują, ze gen kodujący to białko wyewoluował przez duplikację genu kodującego pojedyńczą domenę.

Ewolucja konwergentna: te same rozwiązania na podobne wyzwania biochemiczne

Jak dotąd zajmowałyśmy się białkami, które miały wspólnych przodków moje drogie panie. Czyli powstawły one w wyniku działania ewolucji dywergentnej. Można znaleźc takie co nie pochodzą od wspólnego przodka. (podobieństwo strukturalne). Niezależne ewoluujące białka mogą upodabiac się do siebie z powodu wykonywania podobnej funkcji biochemicznej. Proces, w którym rózne ścieżki ewolucyjne prowadzą do tego samego rozwiązania, nazywany jest ewolucją konwergentną (zbieżną).

Tera przykłady: np. u proteaz serynowych; enzymy te rozcinają wiąz.peptydowe. Miejsca aktywne chymotrypsyny i subtylizyny sa znacząco podobne pod względem budowy. Reszty Ser,His i Asp są rozmieszczone tak samo. Nie jest to przypadkowe, bo wykorzystują one ten same mechanizm hydrolizy wiąz. peptydowego. Może to sugerować, że są homologami, ale różnice w budowie są ogromne. Chymotrypsyna jest zbudowana ze struktur beta, subtylizyna zawiera rozległe rejony zbudowane z helis alfa. Te 3 kluczowe reszty nie zajmują podobnych pozycji, ani nie pojawiają się w tej samej kolejności. Nie jest możliwe, aby pochodziły od jednego przodka.

Porównanie sekwencji RNA może dać wgląd w struktury drugorzędowe

Przyrównanie sekwencji homologicznych RNA może byc źródłem info na temat pokrewieństwa ewolucyjnego podobnie jak w przypadku metod opisanych do tej pory. Dodatkowo mówią o strukturze RNA. Jednoniciowe cząst. kw. nukein. zwijają się tworząc skomplikowane struktury, utrzymywane przez parowanie zasad Wat-Crick oraz za pomocą innych oddziaływań. Będziemy rozważac rRNA. W przedstawionym rejonie rRNA E.Coli ma resztę G w pozycji 9 i resztę C w pozycji 22, podczas gdy sekwencja rRNA człowieka ma w pozycji 9 U, a 22 A. analizowali se fragmnenty z różnych organizmów i te zasady się zmieniały, ale zawsze pary są te same, w sensie A z U i C z G.

___________________________________________________________________________________

6.4 Na podstawie informacji zawartej w sekwencjach można konstruowac drzewa ewolucyjne

I znowu to samo tu piszą, że podobieństwo sekwencji sugeruje, iż za pomocą analizy podobieństwa sekwencji można prześledzic ewolucyjne ścieżki pokrewieństwa członków rodziny białek. Po co 50 raz to samo xD? Teraz analizują znowu globiny. Mówią, że przerwy jak trza wstawiac to tylko w tych samych miejscach. I robią to całe drzewo ewolucyjne. Długośc gałęzi łączących każdą parę białek jest wprost proporcjonalna do liczby AK różniących ich sekwencje.

To pokazuje jedynie względny czas dywergencji. Np. mioglobina oddzieliła się od hemoglobiny 2 razy szybciej niż łańcuch alfa od beta. Jak można oszacowac przybliżony czas? Drzewa ewolucyjne mogą byc kalibrowane przez porównanie wywnioskowanych pkt. rozgałęzień z czasem dywergencji określonym na podst. danych kopalnych. Hmoglobiny - ok 350 mln lat temu (trocęe mi nie poszedł ten rysunek xDXD). Sądzą tak, bo jakieś minogi oddzieliły się 400 mln lat temu od ryb kostnoszkieletowych i one zawierają już tylko hemoglobinę jednego typu.

Analiza RNA doprowadziła do tego, ze Archea są osobną grupą org.

___________________________________________________________________________________

6.5 Nowoczesne techniki umożliwiają eksperymentalne badanie procesów ewolucyjnych

Łańcuchowa reakcja polimeryzacji umożliwiła bezpośrednie badanie starożytnych sekwencji DNA. Molekularną ewolucję można badac wykorzystując chemię kombinatoryczną - proces polegający na produkowaniu dużych populacji cząst., a następnie selekcjonowaniu puli pod względem okreslonych właściwości biochemicznych.

Starożytny DNA można czasami amplifikowac i sekwencjonowac

DNA jest bardzo stabilne, więc dobrze robi za magazyn info genetycznej. Mogą przetrwac kilka tysięcy lat (odp.warunki).Od kiedy jest PCR mozna amplifikowac i sekwencjonowac. Znależli jakiegoś neandertalczyka sprzed 30K-100K lat, porównali z homo sapiens i dało to: od 22 do 36 substytucji, człowiek z szympansem na 55 różnic., wykazało też że żył 600K lat temu. Sumując neandertalczyk nie był ogniwem pośrednim w ewolucji człowieka, ale stanowił odrębną linię ewolucyjną, która uległa wymarciu tzw. “ślepa uliczka”

Ewolucję molekularną można badac eksperymentalnie

Euolucja wymaga trzech procesów:

1) wytworzenie zróżnicowanej populacji

2) selekcji osobników na podstawie pewnego kryterium dostosowania

3) reprodukcji osobników najlepiej dostosowanych

Cząst. kw. nukleinowych mogą podlegac 1->3 in vivo. odpowiednie warunki.

Różnorodną populację takich cząst. można wytowrzyc w labie, stosując chemię kombinatoryczną. Tzn. tworzy się najpierw populację określonej wielkości cząst. potem się selekcjonuje, zostają te o żądanych właściwościach wiązania lub aktywności. Potem powiela się je PCR’em. Startery do amplifikacji są komplementarne do specyficznej sekwencji, zawartej na końcach każdej cząsteczki w populacji. Błędy wystepujące w PCR - wprowadzają zmiennośc populacji.