kwasy moje

Biochemia

laboratorium

Ćwiczenie 4:

Kwasy nukleinowe

Sprawozdanie poprawione 27.06.2011

Katarzyna Kędzierska 144530
Sprawozdanie dodatkowe zaliczające nieobecność

kierunek Biotechnologia

grupa dziekańska: III

semestr: IV

data wykonania ćwiczenia: 24.03.201

data oddania sprawozdania 31.03.2011

  1. Wstęp teoretyczny:
    Kwasy nukleinowe są to wielocząsteczkowe związki - podstawowe składniki wszystkich żywych komórek. Składają się one ze składnika cukrowego, zasady azotowej (purynowej lub pirymidynowej) i reszt kwasu ortofosforowego.
    Kwasy nukleinowe dzielimy na:

Składniki cukrowe kwasów nukleinowych:

β-D-rybofuranoza 2-deoksy-β-D-rybofuranoza

Do podstawowych zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych należą:

  1. Zasady purynowe występujące zarówno w RNA jak i w DNA:

Adenina Guanina

  1. Zasady pirymidynowe, z których tymina występuje w DNA, uracyl zastępujący tyminę w RNA:

Cytozyna Uracyl Tymina

  1. Część doświadczalna:

    1. Rozpuszczalność kwasów nukleinowych:

  1. Wykonanie:

  1. Obserwacje:

  1. Wnioski:
    Kwasy nukleinowe, ze względu na wielkość cząsteczek, tworzą w roztworach wodnych układy koloidowe, a dzięki dużej zawartości reszt kwasu ortofosforowego, mają odczyn kwaśny. Dzięki temu rozpuszczają się dobrze w środowisku zasadowym, natomiast dodanie kwasu i obniżenie pH roztworu doprowadza do odwracalnego wytrącenia kwasów nukleinowych. Tą właśnie właściwość kwasów nukleinowych obserwujemy w pierwszej części tego doświadczenia. Mianowicie po dodaniu, do 0,1% roztworów zawierających DNA lub RNA, kwasu solnego (czyli zakwaszeniu środowiska) wytrąca się biały osad kwasów nukleinowych, a po wkropleniu roztworu NaOH (czyli zalkalizowaniu środowiska), osad rozpuszcza się. Również dodanie czynników odwadniających np. alkoholu powoduje wytracenie kwasów nukleinowych, co potwierdza druga cześć doświadczenia. Po wprowadzeniu 96% etanolu, do roztworów zawierających 0,1% roztwory DNA lub RNA, wytrąca się biały osad kwasów nukleinowych.

  2. Zasada metody:
    W tym doświadczeniu, badamy właściwości kwasów nukleinowych, a dokładniej ich rozpuszczalność, poprzez zmianę pH roztworu (zakwaszenie środowiska 1N kwasem solnym, zalkalizowanie środowiska roztworem NaOH).

    1. Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych:

  1. Wykonanie:
    We wrzącej łaźni wodnej ogrzewaliśmy 2,5ml 1% roztworu kwasów nukleinowych z 2,5ml 10% kwasu siarkowego (VI) w ciągu 1 godziny. Uzyskane w ten sposób hydrolizaty używaliśmy do kolejnych doświadczeń.

  2. Zasada metody:
    Kwasy nukleinowe ogrzewane z kwasami mineralnymi ulegają hydrolizie do wolnych zasad purynowych i nukleotydów pirymidynowych. Z rozpadu nukleotydów purynowych w hydrolizacie znajduje się też kwas fosforowy i składnik cukrowy kwasów nukleinowych: ryboza i deoksyryboza.

    1. Wykrywanie pentoz w hydrolizatach kwasowych:

      1. Reakcja orcynolowa:

  1. Wykonanie:
    Do probówek zawierających po 1 ml:
    1) hydrolizatu RNA
    2) hydrolizaty DNA
    3) 0,1% roztworu RNA
    4) 0,1% roztworu DNA
    5) 1% roztworu rybozy
    6) 1% roztworu deoksyrybozy
    dodaliśmy po 1ml odczynnika orcynolowego, a następnie umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po wyjęciu z łaźni i ostudzeniu do każdej próby dodaliśmy po 5ml wody destylowanej, a następnie określiliśmy barwę powstałego kompleksu.

  2. Obserwacje:
    We wszystkich 6 probówkach pojawiło się zielone zabarwienie roztworu o różnych odcieniach.

  3. Wnioski:
    We wszystkich probówkach stwierdzamy obecność pentoz (wolnych lub związanych w nukleozydach).
    Ogrzewanie prób we wrzącej łaźni wodnej, ze stężonym kwasem solnym, zawarty w odczynniku orcynolowym, doprowadziło do odwodnienia zawartych w roztworach pentoz do furfuralu – cyklicznego aldehydu, który to z orcynolem (pochodną fenolową), w obecności jonów Fe3+ pochodzących również z odczynnika orcynolowego, utworzył barwne połączenie o barwie zielonej.

  4. Zasada metody:
    Pentozy wolne oraz związane w nukleozydach, ogrzewane ze stężonym roztworem kwasu solnego przechodzą w furfural, który z oryną i jonami Fe3+ tworzy trwały kompleks o barwie zielonej.

  5. Równanie reakcji:

  1. Wykonanie:
    Do probówek zawierających po 1 ml:
    1) hydrolizatu RNA
    2) hydrolizaty DNA
    3) 0,1% roztworu RNA
    4) 0,1% roztworu DNA
    5) 1% roztworu rybozy
    6) 1% roztworu deoksyrybozy
    dodaliśmy po 2ml odczynnika difenyloaminowego, a następnie umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.

  2. Obserwacje:
    W probówkach numer: 2, 4 i 6 pojawiło się niebieskie zabarwienie, natomiast w probówkach numer: 1, 3 i 5, roztwory pozostały bezbarwne.

  3. Wnioski:
    W probówkach numer: 2, 4 i 6 wykryliśmy obecność DNA lub deoksyrybozy wolnej oraz związanej z zasadą purynową. Deoksyryboza w reakcji z difenyloaminą daje niebieskie zabarwienie, w przeciwieństwie do RNA i rybozy, które pozostają bezbarwne. Właściwość tą możemy wykorzystać do odróżnienia DNA od RNA (gdyż DNA zawiera deoksyrybozę, a RNA rybozę – nie barwiącą się w reakcji z difenyloaminą).

  4. Zasada metody:
    DNA i deoksyryboza wolna oraz związana z zasadą purynową ulegają barwnej reakcji z difenyloaminą.

  5. Równanie reakcji:

    1. Wykrywanie kwasu fosforowego:

  1. Wykonanie:
    0,5ml hydrolizatu kwasu nukleinowego (DNA) zobojętniliśmy roztworem amoniaku, dodając 3 krople stężonego roztworu tego odczynnika. Następnie dodaliśmy 0,5ml stężonego roztworu kwasu azotowego (V) i 2ml molibdenianu amonowego. Zawartość probówek ogrzaliśmy do wrzenia.

  2. Obserwacje:
    W probówce z hydrolizatem DNA wystąpiło wytrącenie się żółtego osadu.

  3. Wnioski:
    W probówce z hydrolizatem DNA wykryliśmy obecność kwasu fosforowego. Potwierdza to fakt wydzielenia się żółtego osadu fosfomolibdenianu amonowego. Kwas ten był więc obecny w DNA.

  4. Zasada metody:
    W obecności kwasu fosforowego, w reakcji tej, wytrąca się żółty osad fosfomolibdenianu amonowego.

    1. Wykrywanie zasad purynowych:

  1. Wykonanie:
    Do 1ml hydrolizatu kwasu nukleinowego (RNA) dodaliśmy 6 kropli stężonego amoniaku i 3ml amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra.

  2. Obserwacje:
    W probówce z hydrolizatem RNA nastąpiło wytrącenie się szarego osadu.

  3. Wnioski:
    W probówce z hydrolizatem RNA wykryliśmy obecność zasad purynowych. Potwierdza to fakt powstania szarego osadu nierozpuszczalnych w amoniaku soli srebrowych puryn. Zasady purynowe były więc obecne w RNA.

  4. Zasada metody:
    W obecności zasad purynowych, w reakcji tej, wytraca się nierozpuszczalny w amoniaku osad soli srebrowych puryn.

    1. Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną:

  1. Wykonanie:
    Zasady purynowe oznaczaliśmy spektrofotometrycznie uzyskując je z kostek bulionowych.
    Przygotowanie surowca do pomiaru spektrofotometrycznego:
    Do 5g kostki bulionowej („Bulion na włoszczyźnie”) dodaliśmy około 75ml wody destylowanej, gotowaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut, a następnie po ostudzeniu przesączyliśmy do kolby miarowej o pojemności 100ml przez gazę młyńską i uzupełniliśmy wodą destylowaną do kreski. Po wymieszaniu roztwór jeszcze raz przesączyliśmy, ale tym razem przez sączek bibułowy. W tak przygotowanym roztworze oznaczyliśmy zawartość zasad purynowych (adeniny i guaniny) dokonując pomiaru absorbancji przy określonych długościach fali. W celu wyeliminowania wpływy zanieczyszczeń (np. aromatycznych aminokwasów) na wartość absorbancji, pomiar wykonywaliśmy przy dwóch długościach fali: maksymalnego pochłaniania (adenina przy 262, guanina przy 249) i przy 290 nm.

  2. Obliczenia i wyniki doświadczenia:
    Tabela numer 1: Wyniki zmierzonej absorbancji roztworów (dla różnych kostek bulionowych).

Kostka bulionowa Różnica ekstynkcji roztworów w maksimum absorbancji i w długości fali równej 290 nm dla adeniny Różnica ekstynkcji roztworów w maksimum absorbancji i w długości fali równej 290 nm dla guaniny
ΔE(262-290) ΔE(249-290)
Bulion grzybowy Knorr 0,248 0,175
Bulion grzybowy Winiary 0,311 0,258
Rosół drobiowy Winiary 0,143 0,144
Bulion na włoszczyźnie 0,118 0,115
Rosół z kury Kucharek 0,235 0,241
Bulion cielęcy Knorr 0,322 0,311
Rosół wołowy Knorr 0,081 0,046
Rosół z kury Knorr 0,146 0,071


Stężenie zasad purynowych z różnicy ekstynkcji w maksimum absorpcji i w innej długości fali określa się na podstawie porównania z roztworami wzorcowymi.
Dla roztworów standardowych zawierających 10 µg zasady w 1ml 0,1N HCl różnice ekstynkcji są następujące:

Znając absorbancję roztworów wzorcowych adeniny i guaniny o danym stężeniu (10µg/ml), absorbancję prób badanych, oraz sposób przygotowania prób do badań, obliczam zawartość poszczególnych zasad purynowych w analizowanych kostkach bulionowych, wyrażając ją w mg/g tego produktu.

Przykładowe obliczenia wykonuje dla kostki bulionowej: „Bulion na włoszczyźnie”:

  1. Zawartość adeniny w analizowanym surowcu („Bulionie na włoszczyźnie”):


$$x = \frac{0,118 \bullet 10\ \frac{\text{μg}_{\text{adeniny}}}{\text{ml}}}{0,900} = 1,31\frac{\text{μg}_{\text{adeniny}}}{\text{ml}}$$

  1. Zawartość guaniny w analizowanym surowcu („Bulionie na włoszczyźnie”):

Układam proporcję, w skład której wchodzi różnica ekstynkcji roztworu wzorcowego guaniny o znanym stężeniu guaniny oraz różnica ekstynkcji roztworu badanego.


$$x = \frac{0,115 \bullet 10\ \frac{\text{μg}_{\text{guaniny}}}{\text{ml}}}{0,457} = 2,52\frac{\text{μg}_{\text{guaniny}}}{\text{ml}}$$

Tabela numer 2: Zawartość adeniny i guaniny w analizowanych surowcach (kostkach bulionowych).

Kostka bulionowa Zawartość adeniny w analizowanej kostce bulionowej Zawartość guaniny w analizowanej kostce bulionowej
y [mgadeniny/gbadanego surowca] y [mgguaniny/gbadanego surowca]
Bulion grzybowy Knorr 1,102 1,532
Bulion grzybowy Winiary 1,382 2,258
Rosół drobiowy Winiary 0,636 1,260
Bulion na włoszczyźnie 0,524 1,007
Rosół z kury Kucharek 1,044 2,109
Bulion cielęcy Knorr 1,431 2,722
Rosół wołowy Knorr 0,360 0,403
Rosół z kury Knorr 0,649 0,621
  1. Wnioski:
    Zasady purynowe, spożywane w dużych ilościach są szkodliwe dla zdrowia człowieka. Wnioskując z wyników analizy ilościowej (zebranych w tabeli numer 2) zawartości poszczególnych zasad purynowych (adeniny i guaniny) w badanych surowcach – kostkach bulionowych stwierdzić można że:

  1. Zasada metody:
    Kwasy nukleinowe oraz produkty ich rozkładu (zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy) intensywnie pochłaniają promieniowanie ultrafioletowe w obszarze 250 – 280 nm. Właściwość ta jest wykorzystywana do ilościowego oznaczenia tych związków.

    1. Oznaczanie zawartości DNA metodą difenyloaminową:
      Ćwiczenie obejmuje ekstrakcję kwasów nukleinowych z tkanki zwierzęcej lub mleczu z ryb i oznaczenie zawartości DNA na podstawie stężenia składnika cukrowego.

      1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych:

  1. Wykonanie:

5g tkanki zwierzęcej (wątroby) lub 2g mleczu z ryb zhomogenizowaliśmy z 50ml zimnego 10% kwasu trójchlorooctowego, który to ekstrahuje niskocząsteczkowe związki kwasorozpuszczalne (nukleotydy, aminokwasy, estry fosforanowe). Homogenat odwirowaliśmy. W osadzie pozostały białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe. Supernatant (ciecz nadosadową) usunęliśmy, a do osadu dodaliśmy 30ml 0,6M roztworu kwasu nadchlorowego i ogrzewaliśmy mieszaninę w ciągu 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 90°C stele mieszając. W wyniku ogrzewania z roztworem HClO4 kwasy nukleinowe zostają uwolnione od białka, ulegają hydrolizie do związków kwasorozpuszczalnych i przechodzą do roztworu. Kwas nadchlorowy jest mocniejszy od kwasu siarkowego zatem hydroliza kwasów nukleinowych zachodzi dalej, rozpadają się zarówno nukleotydy purynowe jak i pirymidynowe. W roztworze mamy wolne zasady purynowe, pirymidynowe, kwas fosforowy i składniki cukrowe: rybozę i deoksyrybozę. Po ostudzeniu odwirowaliśmy osad zawierający białko, a supernatant przenieśliśmy ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50ml. Zawartość kolby uzupełniliśmy kwasem nadchlorowym do kreski i dokładnie wymieszaliśmy. W tak otrzymanym ekstrakcie oznaczaliśmy zawartość DNA.

  1. Oznaczanie zawartości DNA metodą z difenyloaminą:

  1. Wykonanie:

  1. 1ml ekstraktu kwasów nukleinowych i 1ml wody destylowanej (próba badana),

  2. 1ml wzorcowego roztworu DNA (o stężeniu 200 µg/ml) i 1ml wody destylowanej (próba wzorcowa),

  3. 2 ml wody destylowanej (próba odczynnikowa),

Do każdej z probówek dodaliśmy po 4ml odczynnika difenyloaminowego. Wszystkie próby wstawiliśmy jednocześnie do wrzącej łaźni wodnej i inkubowaliśmy w ciągu 10 minut. Po tym czasie próby ochłodziliśmy i zmierzyliśmy absorbancję prób badanych i wzorcowej wobec próby odczynnikowej na spektrokolorymetrze „Spekol” przy długości fali 600 nm.

  1. Obliczenia i wyniki doświadczenia:
    Tabela numer 3: Zmierzone wartości absorbancji prób badanych i wzorcowej wobec próby odczynnikowej ekstraktów kwasów nukleinowych (z wątroby lub mleczu z ryb) przy długości fali 600 nm.

Badany surowiec

Absorbancja roztworu

1

Absorbancja roztworu

2

Średnia absorbancja roztworu
Próba wzorcowa 0,245 - 0,245

Mlecz ze śledzia

próba 1

0,570 0,599 0,591

Mlecz ze śledzia

próba 2

0,647 0,548

Wątroba

wieprzowa

próba 1

- 0,268 0,239

Wątroba

wieprzowa

próba 2

0,207 0,242


$$x = \frac{0,239 \bullet 200\frac{\text{μg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}}}{0,245} = 195,1\frac{\text{μg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}} = 0,195\frac{\text{mg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}}$$


$$x = \frac{0,591 \bullet 200\frac{\text{μg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}}}{0,245} = 482,4\frac{\text{μg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}} = 0,482\frac{\text{mg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}}$$

Tabela numer 4: Zawartość DNA w badanych surowcach (wątrobie i mleczu ze śledzia) w mgDNA/1mlekstraktu i mgDNA/100gwyjściowego surowca.

Badany surowiec Zawartość DNA w badanym surowcu
[mgDNA/1mlekstraktu]
Wątroba 0,195
Mlecz ze śledzia 0,482
  1. Wnioski:
    Z wyników doświadczenia zebranych w tabeli numer 4, wnioskujemy, że mlecz ze śledzia zawiera o wiele więcej (ponad 6 razy więcej) DNA niż wątroba wieprzowa (1205 mgDNA/100gwyjściowego surowca : 195 mgDNA/100gwyjściowego surowca). Z zawartością DNA wiąże się tym samym obecność zasad purynowych, które spożywane w nadmiarze są szkodliwe dla zdrowia człowieka.

  2. Zasada metody:
    Deoksyryboza, będąca składnikiem kwasu deoksyrybonukleinowego, z odczynnikiem difenyloaminowym, zawierającym stężony kwas octowy, daje niebieskie zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do ilości DNA a próbie.


Wyszukiwarka