Biochemia
laboratorium
Ćwiczenie 4:
Kwasy nukleinowe
Sprawozdanie poprawione 27.06.2011
Katarzyna Kędzierska 144530
Sprawozdanie dodatkowe zaliczające nieobecność
kierunek Biotechnologia
grupa dziekańska: III
semestr: IV
data wykonania ćwiczenia: 24.03.201
data oddania sprawozdania 31.03.2011
Wstęp teoretyczny:
Kwasy nukleinowe są to wielocząsteczkowe związki - podstawowe składniki wszystkich żywych komórek. Składają się one ze składnika cukrowego, zasady azotowej (purynowej lub pirymidynowej) i reszt kwasu ortofosforowego.
Kwasy nukleinowe dzielimy na:
Kwasy rybonukleinowe – RNA – zbudowane z β-D-rybofuranozy połączonej wiązaniem glikozydowym z zasadą purynową bądź pirymidynową, oraz wiązaniem estrowym z resztą kwasu ortofosforowego,
Kwasy deoksyrybonukleinowe – DNA – zbudowane z 2-deoksy-β-D-rybofuranozy połączonej wiązaniem β-glikozydowym z zasadą purynową bądź pirymidynową, oraz wiązaniem estrowym z resztą kwasu ortofosforowego.
Składniki cukrowe kwasów nukleinowych:
β-D-rybofuranoza 2-deoksy-β-D-rybofuranoza
![]()
Do podstawowych zasad azotowych występujących w kwasach nukleinowych należą:
Zasady purynowe występujące zarówno w RNA jak i w DNA:
Adenina
Guanina
Zasady pirymidynowe, z których tymina występuje w DNA, uracyl zastępujący tyminę w RNA:
Cytozyna
Uracyl
Tymina
Część doświadczalna:
Rozpuszczalność kwasów nukleinowych:
Wykonanie:
Do 0,5ml 0,1% roztworów RNA i DNA dodaliśmy kroplami 1N HCl, a następnie roztwór NaOH.
Do 1ml 0,1% roztworów DNA i RNA dodaliśmy podwójną objętość 96% etanolu.
Obserwacje:
Po dodaniu kwasu solnego (1N) do probówek z roztworem RNA i DNA, w obu przypadkach, wytrącił się biały osad kwasów nukleinowych, który to następnie rozpuścił się po wprowadzeniu roztworu NaOH.
Po dodaniu etanolu (96%) do probówek, w których znajdowały się roztwory RNA i DNA, w obu przypadkach, wytrącił się biały osad kwasów nukleinowych.
Wnioski:
Kwasy nukleinowe, ze względu na wielkość cząsteczek, tworzą w roztworach wodnych układy koloidowe, a dzięki dużej zawartości reszt kwasu ortofosforowego, mają odczyn kwaśny. Dzięki temu rozpuszczają się dobrze w środowisku zasadowym, natomiast dodanie kwasu i obniżenie pH roztworu doprowadza do odwracalnego wytrącenia kwasów nukleinowych. Tą właśnie właściwość kwasów nukleinowych obserwujemy w pierwszej części tego doświadczenia. Mianowicie po dodaniu, do 0,1% roztworów zawierających DNA lub RNA, kwasu solnego (czyli zakwaszeniu środowiska) wytrąca się biały osad kwasów nukleinowych, a po wkropleniu roztworu NaOH (czyli zalkalizowaniu środowiska), osad rozpuszcza się. Również dodanie czynników odwadniających np. alkoholu powoduje wytracenie kwasów nukleinowych, co potwierdza druga cześć doświadczenia. Po wprowadzeniu 96% etanolu, do roztworów zawierających 0,1% roztwory DNA lub RNA, wytrąca się biały osad kwasów nukleinowych.
Zasada metody:
W tym doświadczeniu, badamy właściwości kwasów nukleinowych, a dokładniej ich rozpuszczalność, poprzez zmianę pH roztworu (zakwaszenie środowiska 1N kwasem solnym, zalkalizowanie środowiska roztworem NaOH).
Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych:
Wykonanie:
We wrzącej łaźni wodnej ogrzewaliśmy 2,5ml 1% roztworu kwasów nukleinowych z 2,5ml 10% kwasu siarkowego (VI) w ciągu 1 godziny. Uzyskane w ten sposób hydrolizaty używaliśmy do kolejnych doświadczeń.
Zasada metody:
Kwasy nukleinowe ogrzewane z kwasami mineralnymi ulegają hydrolizie do wolnych zasad purynowych i nukleotydów pirymidynowych. Z rozpadu nukleotydów purynowych w hydrolizacie znajduje się też kwas fosforowy i składnik cukrowy kwasów nukleinowych: ryboza i deoksyryboza.
Wykrywanie pentoz w hydrolizatach kwasowych:
Reakcja orcynolowa:
Wykonanie:
Do probówek zawierających po 1 ml:
1) hydrolizatu RNA
2) hydrolizaty DNA
3) 0,1% roztworu RNA
4) 0,1% roztworu DNA
5) 1% roztworu rybozy
6) 1% roztworu deoksyrybozy
dodaliśmy po 1ml odczynnika orcynolowego, a następnie umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po wyjęciu z łaźni i ostudzeniu do każdej próby dodaliśmy po 5ml wody destylowanej, a następnie określiliśmy barwę powstałego kompleksu.
Obserwacje:
We wszystkich 6 probówkach pojawiło się zielone zabarwienie roztworu o różnych odcieniach.
Wnioski:
We wszystkich probówkach stwierdzamy obecność pentoz (wolnych lub związanych w nukleozydach).
Ogrzewanie prób we wrzącej łaźni wodnej, ze stężonym kwasem solnym, zawarty w odczynniku orcynolowym, doprowadziło do odwodnienia zawartych w roztworach pentoz do furfuralu – cyklicznego aldehydu, który to z orcynolem (pochodną fenolową), w obecności jonów Fe3+ pochodzących również z odczynnika orcynolowego, utworzył barwne połączenie o barwie zielonej.
Zasada metody:
Pentozy wolne oraz związane w nukleozydach, ogrzewane ze stężonym roztworem kwasu solnego przechodzą w furfural, który z oryną i jonami Fe3+ tworzy trwały kompleks o barwie zielonej.
Równanie reakcji:
I etap reakcji: odwodnienie składnika cukrowego kwasów nukleinowych: rybozy pod wpływem stężonego kwasu solnego (zawartego w odczynniku orcynnolowym) do cyklicznego aldehydu: furfuralu
ryboza
II etap reakcji: kondensacja cyklicznego aldehydu: furfuralu z dwoma cząsteczkami orcyny i utworzenie barwnego połączenia
furfural + 2 cząsteczki → barwny związek + 2 cząsteczki
orcyny wody
Reakcja Dischego:
Wykonanie:
Do probówek zawierających po 1 ml:
1) hydrolizatu RNA
2) hydrolizaty DNA
3) 0,1% roztworu RNA
4) 0,1% roztworu DNA
5) 1% roztworu rybozy
6) 1% roztworu deoksyrybozy
dodaliśmy po 2ml odczynnika difenyloaminowego, a następnie umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.
Obserwacje:
W probówkach numer: 2, 4 i 6 pojawiło się niebieskie zabarwienie, natomiast w probówkach numer: 1, 3 i 5, roztwory pozostały bezbarwne.
Wnioski:
W probówkach numer: 2, 4 i 6 wykryliśmy obecność DNA lub deoksyrybozy wolnej oraz związanej z zasadą purynową. Deoksyryboza w reakcji z difenyloaminą daje niebieskie zabarwienie, w przeciwieństwie do RNA i rybozy, które pozostają bezbarwne. Właściwość tą możemy wykorzystać do odróżnienia DNA od RNA (gdyż DNA zawiera deoksyrybozę, a RNA rybozę – nie barwiącą się w reakcji z difenyloaminą).
Zasada metody:
DNA i deoksyryboza wolna oraz związana z zasadą purynową ulegają barwnej reakcji z difenyloaminą.
Równanie reakcji:
Wykrywanie kwasu fosforowego:
Wykonanie:
0,5ml hydrolizatu kwasu nukleinowego (DNA) zobojętniliśmy roztworem amoniaku, dodając 3 krople stężonego roztworu tego odczynnika. Następnie dodaliśmy 0,5ml stężonego roztworu kwasu azotowego (V) i 2ml molibdenianu amonowego. Zawartość probówek ogrzaliśmy do wrzenia.
Obserwacje:
W probówce z hydrolizatem DNA wystąpiło wytrącenie się żółtego osadu.
Wnioski:
W probówce z hydrolizatem DNA wykryliśmy obecność kwasu fosforowego. Potwierdza to fakt wydzielenia się żółtego osadu fosfomolibdenianu amonowego. Kwas ten był więc obecny w DNA.
Zasada metody:
W obecności kwasu fosforowego, w reakcji tej, wytrąca się żółty osad fosfomolibdenianu amonowego.
Wykrywanie zasad purynowych:
Wykonanie:
Do 1ml hydrolizatu kwasu nukleinowego (RNA) dodaliśmy 6 kropli stężonego amoniaku i 3ml amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra.
Obserwacje:
W probówce z hydrolizatem RNA nastąpiło wytrącenie się szarego osadu.
Wnioski:
W probówce z hydrolizatem RNA wykryliśmy obecność zasad purynowych. Potwierdza to fakt powstania szarego osadu nierozpuszczalnych w amoniaku soli srebrowych puryn. Zasady purynowe były więc obecne w RNA.
Zasada metody:
W obecności zasad purynowych, w reakcji tej, wytraca się nierozpuszczalny w amoniaku osad soli srebrowych puryn.
Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną:
Wykonanie:
Zasady purynowe oznaczaliśmy spektrofotometrycznie uzyskując je z kostek bulionowych.
Przygotowanie surowca do pomiaru spektrofotometrycznego:
Do 5g kostki bulionowej („Bulion na włoszczyźnie”) dodaliśmy około 75ml wody destylowanej, gotowaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut, a następnie po ostudzeniu przesączyliśmy do kolby miarowej o pojemności 100ml przez gazę młyńską i uzupełniliśmy wodą destylowaną do kreski. Po wymieszaniu roztwór jeszcze raz przesączyliśmy, ale tym razem przez sączek bibułowy. W tak przygotowanym roztworze oznaczyliśmy zawartość zasad purynowych (adeniny i guaniny) dokonując pomiaru absorbancji przy określonych długościach fali. W celu wyeliminowania wpływy zanieczyszczeń (np. aromatycznych aminokwasów) na wartość absorbancji, pomiar wykonywaliśmy przy dwóch długościach fali: maksymalnego pochłaniania (adenina przy 262, guanina przy 249) i przy 290 nm.
Obliczenia i wyniki doświadczenia:
Tabela numer 1: Wyniki zmierzonej absorbancji roztworów (dla różnych kostek bulionowych).
Kostka bulionowa | Różnica ekstynkcji roztworów w maksimum absorbancji i w długości fali równej 290 nm dla adeniny | Różnica ekstynkcji roztworów w maksimum absorbancji i w długości fali równej 290 nm dla guaniny |
---|---|---|
ΔE(262-290) | ΔE(249-290) | |
Bulion grzybowy Knorr | 0,248 | 0,175 |
Bulion grzybowy Winiary | 0,311 | 0,258 |
Rosół drobiowy Winiary | 0,143 | 0,144 |
Bulion na włoszczyźnie | 0,118 | 0,115 |
Rosół z kury Kucharek | 0,235 | 0,241 |
Bulion cielęcy Knorr | 0,322 | 0,311 |
Rosół wołowy Knorr | 0,081 | 0,046 |
Rosół z kury Knorr | 0,146 | 0,071 |
Stężenie zasad purynowych z różnicy ekstynkcji w maksimum absorpcji i w innej długości fali określa się na podstawie porównania z roztworami wzorcowymi.
Dla roztworów standardowych zawierających 10 µg zasady w 1ml 0,1N HCl różnice ekstynkcji są następujące:
Adenina ΔE(262-290) = 0,900
Guanina ΔE(249-290) = 0,457
Znając absorbancję roztworów wzorcowych adeniny i guaniny o danym stężeniu (10µg/ml), absorbancję prób badanych, oraz sposób przygotowania prób do badań, obliczam zawartość poszczególnych zasad purynowych w analizowanych kostkach bulionowych, wyrażając ją w mg/g tego produktu.
Przykładowe obliczenia wykonuje dla kostki bulionowej: „Bulion na włoszczyźnie”:
Adenina ΔE(262-290) = 0,292 – 0,174 = 0,118
Guanina ΔE(249-290) = 0,457 – 0,174 = 0,115
Zawartość adeniny w analizowanym surowcu („Bulionie na włoszczyźnie”):
$$x = \frac{0,118 \bullet 10\ \frac{\text{μg}_{\text{adeniny}}}{\text{ml}}}{0,900} = 1,31\frac{\text{μg}_{\text{adeniny}}}{\text{ml}}$$
Zawartość guaniny w analizowanym surowcu („Bulionie na włoszczyźnie”):
Układam proporcję, w skład której wchodzi różnica ekstynkcji roztworu wzorcowego guaniny o znanym stężeniu guaniny oraz różnica ekstynkcji roztworu badanego.
$$x = \frac{0,115 \bullet 10\ \frac{\text{μg}_{\text{guaniny}}}{\text{ml}}}{0,457} = 2,52\frac{\text{μg}_{\text{guaniny}}}{\text{ml}}$$
Tabela numer 2: Zawartość adeniny i guaniny w analizowanych surowcach (kostkach bulionowych).
Kostka bulionowa | Zawartość adeniny w analizowanej kostce bulionowej | Zawartość guaniny w analizowanej kostce bulionowej |
---|---|---|
y [mgadeniny/gbadanego surowca] | y [mgguaniny/gbadanego surowca] | |
Bulion grzybowy Knorr | 1,102 | 1,532 |
Bulion grzybowy Winiary | 1,382 | 2,258 |
Rosół drobiowy Winiary | 0,636 | 1,260 |
Bulion na włoszczyźnie | 0,524 | 1,007 |
Rosół z kury Kucharek | 1,044 | 2,109 |
Bulion cielęcy Knorr | 1,431 | 2,722 |
Rosół wołowy Knorr | 0,360 | 0,403 |
Rosół z kury Knorr | 0,649 | 0,621 |
Wnioski:
Zasady purynowe, spożywane w dużych ilościach są szkodliwe dla zdrowia człowieka. Wnioskując z wyników analizy ilościowej (zebranych w tabeli numer 2) zawartości poszczególnych zasad purynowych (adeniny i guaniny) w badanych surowcach – kostkach bulionowych stwierdzić można że:
Najwięcej zasad purynowych zawiera „Bulion cielęcy Knorr”: 1,431 mg adeniny w jednym gramie kostki i 2,722 mg guaniny w jednym gramie kostki. Zatem kostka ta będzie najbardziej szkodliwa i powinno się ograniczać jej stosowanie.
Najmniej zasad purynowych zawiera „Rosół wołowy Knorr”: 0,360 mg adeniny w jednym gramie kostki i 0,403 mg guaniny w jednym gramie kostki. Zatem kostka ta będzie najmniej szkodliwa z badanych produktów.
Zasada metody:
Kwasy nukleinowe oraz produkty ich rozkładu (zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy) intensywnie pochłaniają promieniowanie ultrafioletowe w obszarze 250 – 280 nm. Właściwość ta jest wykorzystywana do ilościowego oznaczenia tych związków.
Oznaczanie zawartości DNA metodą difenyloaminową:
Ćwiczenie obejmuje ekstrakcję kwasów nukleinowych z tkanki zwierzęcej lub mleczu z ryb i oznaczenie zawartości DNA na podstawie stężenia składnika cukrowego.
Ekstrakcja kwasów nukleinowych:
Wykonanie:
5g tkanki zwierzęcej (wątroby) lub 2g mleczu z ryb zhomogenizowaliśmy z 50ml zimnego 10% kwasu trójchlorooctowego, który to ekstrahuje niskocząsteczkowe związki kwasorozpuszczalne (nukleotydy, aminokwasy, estry fosforanowe). Homogenat odwirowaliśmy. W osadzie pozostały białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe. Supernatant (ciecz nadosadową) usunęliśmy, a do osadu dodaliśmy 30ml 0,6M roztworu kwasu nadchlorowego i ogrzewaliśmy mieszaninę w ciągu 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 90°C stele mieszając. W wyniku ogrzewania z roztworem HClO4 kwasy nukleinowe zostają uwolnione od białka, ulegają hydrolizie do związków kwasorozpuszczalnych i przechodzą do roztworu. Kwas nadchlorowy jest mocniejszy od kwasu siarkowego zatem hydroliza kwasów nukleinowych zachodzi dalej, rozpadają się zarówno nukleotydy purynowe jak i pirymidynowe. W roztworze mamy wolne zasady purynowe, pirymidynowe, kwas fosforowy i składniki cukrowe: rybozę i deoksyrybozę. Po ostudzeniu odwirowaliśmy osad zawierający białko, a supernatant przenieśliśmy ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50ml. Zawartość kolby uzupełniliśmy kwasem nadchlorowym do kreski i dokładnie wymieszaliśmy. W tak otrzymanym ekstrakcie oznaczaliśmy zawartość DNA.
Oznaczanie zawartości DNA metodą z difenyloaminą:
Wykonanie:
1ml ekstraktu kwasów nukleinowych i 1ml wody destylowanej (próba badana),
1ml wzorcowego roztworu DNA (o stężeniu 200 µg/ml) i 1ml wody destylowanej (próba wzorcowa),
2 ml wody destylowanej (próba odczynnikowa),
Do każdej z probówek dodaliśmy po 4ml odczynnika difenyloaminowego. Wszystkie próby wstawiliśmy jednocześnie do wrzącej łaźni wodnej i inkubowaliśmy w ciągu 10 minut. Po tym czasie próby ochłodziliśmy i zmierzyliśmy absorbancję prób badanych i wzorcowej wobec próby odczynnikowej na spektrokolorymetrze „Spekol” przy długości fali 600 nm.
Obliczenia i wyniki doświadczenia:
Tabela numer 3: Zmierzone wartości absorbancji prób badanych i wzorcowej wobec próby odczynnikowej ekstraktów kwasów nukleinowych (z wątroby lub mleczu z ryb) przy długości fali 600 nm.
Badany surowiec | Absorbancja roztworu 1 |
Absorbancja roztworu 2 |
Średnia absorbancja roztworu |
---|---|---|---|
Próba wzorcowa | 0,245 | - | 0,245 |
Mlecz ze śledzia próba 1 |
0,570 | 0,599 | 0,591 |
Mlecz ze śledzia próba 2 |
0,647 | 0,548 | |
Wątroba wieprzowa próba 1 |
- | 0,268 | 0,239 |
Wątroba wieprzowa próba 2 |
0,207 | 0,242 |
$$x = \frac{0,239 \bullet 200\frac{\text{μg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}}}{0,245} = 195,1\frac{\text{μg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}} = 0,195\frac{\text{mg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}}$$
$$x = \frac{0,591 \bullet 200\frac{\text{μg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}}}{0,245} = 482,4\frac{\text{μg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}} = 0,482\frac{\text{mg}_{\text{DNA}}}{\text{ml}}$$
Tabela numer 4: Zawartość DNA w badanych surowcach (wątrobie i mleczu ze śledzia) w mgDNA/1mlekstraktu i mgDNA/100gwyjściowego surowca.
Badany surowiec | Zawartość DNA w badanym surowcu |
---|---|
[mgDNA/1mlekstraktu] | |
Wątroba | 0,195 |
Mlecz ze śledzia | 0,482 |
Wnioski:
Z wyników doświadczenia zebranych w tabeli numer 4, wnioskujemy, że mlecz ze śledzia zawiera o wiele więcej (ponad 6 razy więcej) DNA niż wątroba wieprzowa (1205 mgDNA/100gwyjściowego surowca : 195 mgDNA/100gwyjściowego surowca). Z zawartością DNA wiąże się tym samym obecność zasad purynowych, które spożywane w nadmiarze są szkodliwe dla zdrowia człowieka.
Zasada metody:
Deoksyryboza, będąca składnikiem kwasu deoksyrybonukleinowego, z odczynnikiem difenyloaminowym, zawierającym stężony kwas octowy, daje niebieskie zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do ilości DNA a próbie.