TRAWIENIE WEKTORA, ENZYMY RESTRYKCYJNE

1. enzymy restrykcyje (jak działają, czego potrzebują do swojej aktywności, definicja jednostki aktywności, warunki przechowywania i ich konsekwencje, aktywność gwiezdna, jak zatrzymać reakcje trawienia)*

2. metylacja DNA i jej konsekwencje

3. izoschozomery

4. neoschizomery

5. izokaudamery

6. palindrom

7. cechy dobrych wektorów ekspresyjnych (przypomnieć sobie dyskusje na temat zadania 8 z listy 2 z BM)

8.końce lepkie, tępe, kohezyjne, komplementarne, kompatybilne

9. fosfatazy

10. superskręcony DNA

Enzymy restrykcyjne do swojej aktywności wymagają:
-kationu dwuwartościowego

-buforu (TrisxCl) dla utrzymania optymalnego pH

-odczynniki tiolowe mogą być użyteczne dla stabilizacji enzymu a także potencjalnych zanieczyszczeń
-niektóre er są bardzo wrażliwe na stężenie jonów sodowych lub potasowych (siła jonowa-im wyższa, tym słabsze oddziaływania elektrostatyczne)

Zatrzymywanie reakcji trawienia:

-dodanie EDTA, który chelatuje jony Mg2+

-ekstrakcja (fenol/chloroform) - inaktywacja białek w próbce, DNA zostaje w fazie wodnej, na granicy faz= zdenaturowane białko. nieodwracalne metody inaktywacji enzymu oraz usuwanie
-wytrącanie w etanolu wszystkich cz. er

-inaktywacja pod wpływem temperatury-inkubacja w 65C przez 20 min. (żeby nie dopuścić do wzrostu bakterii)-niektóre pozostaję aktywne w 65C ale tracą swoją zdolność do cięcia w wyższej temperaturze, enzymy termofilne, których optimum zawiera się w 50-55C mogą być inaktywowane-80C przez 20 min.

Bufor do ER:

- MgCl (Mg 2+ potrzebne do aktywności enzymu) , NaCl/KCl

- TrisxCl - optymalne pH dla funkcjonowania enzymu

- 2-merkaptoetanol (2-ME) lub DTT ditiotreitol - uzyteczne przy stabilizacji niektórych ER lub mogą stabilizować potencjalne zanieczyszczenia

- BSA - używane jako nośnik i stabilizator białka w trawieniu enzymem restrykcyjnym; odmiareczkowuje zanieczyszczenia i imituje “warunki naturalne” - bo białko lubi towarzystwo innych białek, dodatkowo BSA jest białkiem inertnym tzn. jest w układzie, ale nie oddziałuje z nim.

Obniżoną wydajność reakcji powiązaną z zanieczyszczonymi próbkami DNA możemy znieść przez:

-zwiększnie ilości jednostek enzymu dodanego do mieszaniny reakcyjnej

-zwiększenie objętości mieszaniny reakcyjnej w celu rozpuszczenia potencjalnych inhibitorów

-zwiększenie czasu inkubacji

Niektóre próbki DNA (często miniprepy) mogą być zanieczyszczone DNazami, które wymagają jonów Mg2+ do swojej aktywności. Takie próbki przechowuje się w buforze zawierającym EDTA.

Trawienie genomowego DNA może być ułatwione poprzez dodanie polikationu spermidyny, która wiąże ujemnie naładowane zanieczyszczenia.

Aktywność gwiezdna

Obniżenie lub zanik specyficzności działania enzymów restrykcyjnych objawiajęce się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne; nazwa pochodzi od oznaczenia alternatywnej aktywności znakiem *, np. EcoRI*

Czynniki wpływające na pojawienie się aktywności gwiezdnej:

- wysokie stężenie glicerolu - zmienia stałą dielektryczną środowiska

- nadmiar enzymu w stosunku do DNA

- wydłużony czas inkubacji

- niska siła jonowa - im wyższa siła jonowa tym mniejszy wpływ oddziaływań elektrostatycznych (niespecyficznych)

- obecność odczynników organicznych, np. DMSO, etanol, glikol

- zastąpienie jonów Mg2+ innymi dwuwartościowymi, np. Mn2+

- wysokie pH (>8)

W przypadku aktywności gwiezdnej dodatkowe prążki DNA w żelu będą znajdowały się poniżej oczekiwanego prążka, nie powinno być żadnych dodatkowych prążków powyżej największego spodziewanego prążka.

Jednostka aktywności-jedna jednostka endonukleazy restrykcyjnej to ilość wymagana do całkowitej hydrolizy 1 ug testowego DNA w ciągu 60 min w całkowitej maksymalnej objętości reakcyjnej-50 ul w warunkach optymalnych podanych przez producenta.

Przechowywanie
Wszystkie enzymy przechowujemy w -20C oprócz Hin1 II, który jest bardziej stabilny w -70C

Izoschizomery-endonukleazy rozpoznające tę samą sekwencję. Mogą lub nie ciąć DNA identycznie produkując te same końce. Mogą produkować końce kompatybilne:
BamHI
5’-G|GATCC-3’

3-CCTAG|G-5’

BglII

5’-A|GATCT-3’

3’-TCTAG|A-5’

Neoschizomery-er rozpoznające tą samę sekwencę, ale mającą różną specyficzność cięcia, tną te rozpoznawane rejony w różnych miejscach.

Izokaudamery-er rozpoznające różne sześcionukleotydowe sekwencje, ale tworzące identyczne wystające końce (BamHI,BglIII

końce kompatybilne-identyczne końce DNA powstałe przez cięcie endonukleaz restrykcyjnych rozpoznających identyczne lub różne sekwencje (BamHI,BglII)

końce kohezyjne-końce lepkie, końce produktów trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi o niesparowanych odcinkach jednoniciowych; końce lepkie mogą ulegać hybrydyzacji z innym fragmentem restrykcyjnym o komplementarnym końcu.

Metylacja DNA-organizmy produkujące enzymy restrykcyjne chronią swoje własne DNA dzięki metylacji nukleotydów w miejscach rozpoznawanych przez endonukleazy. Specyficzna metylaza kowalencyjnie łączy grupy metylowe (kofaktor: S-adenozylometionina) z nukleotydami adeninowymi i cytozynowymi czyniąc je odpornymi na cięcia enzymów restrykcyjnych. Metylacja może nie wpływać, redukować lub całkowicie blokować skuteczność cięcia specyficznych sekwencji przez ER.

Metylazy u E.coli: dam - metyluje A w GATC; dcm - metyluje C w CC(A/T)GC

ssacze DNA - metylacja G i C

Aby rozciąć superkolisty plazmid lub wirusowe DNA potrzeba wiele jednostek ER.

Na działanie enzymów restrykcyjnych ma wpływ:

-zanieczyszczenia DNA (białka, fenole, chloroform, etanol, EDTA, SDS, wysokie stężenie soli). Najczęściej obecne zanieczyszczenia występują na etapie próbek przygotowanych podczas procedury miniprep.

Cechy dobrych wektorów ekspresyjnych:

- autonomiczna replikacja - własne miejsce ori - żeby mieć dużo kopii

- unikalne miejsca cięcia - umożliwiają wbudowanie insertu w dokładnie jedno określone miejsce

- polilinker

- geny kodujące oporność na antybiotyk - łatwiejsza selekcja

- system kontroli transkrypcji

- znaczniki umożliwiające wydzielenie bialka

skręcenie toroidalne (w lewo, ujemne)-na histonach

skręcenie plektonomiczne (w prawo, ujemne) -bakteryjne

Glicerol zmienia stałą dielektryczną ośrodka, zapewnia środowisko reakcji, pomaga zachować

enzym w postaci stabilnej.

Superskręcony DNA porusza się szybciej w elektroforezie.