Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności
Technologia Żywności i Żywienia Człowieka
Sem. V, grupa 1,
Wtorek, 8¹⁵ – 12⁰⁰

Laboratorium z Biochemii

AMINOKWASY

Iga Białasiewicz
Sara Nastałek
Daria Woźniak

Data wykonywania ćwiczenia: 13.10.2015
Data oddania sprawozdania: 20.10.2015

1. Wstęp teoretyczny.

Aminokwasy – należą do związków azotowych, to niskocząsteczkowe kwasy organiczne zawierające wolną grupę karboksylową oraz wolną grupę aminową, położoną przy α – atomie węgla.
W α – aminokwasach obie grupy są połączone z tym samym atomem węgla. Atom węgla połączony z czterema różnymi podstawnikami nazywamy węglem chiralnym. Wyjątek stanowi glicyna, która nie posiada węgla chiralnego, co wiąże się z tym, że jest nieczynna optycznie.

Tetraedryczne ułożenie czterech różnych podstawników wokół atomu węgla α nadaje aminokwasom aktywność optyczną tzn. zdolność do skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego.

Aminokwasy są podstawowymi elementami budulcowymi białek. W przyrodzie występuje około trzystu aminokwasów, jednak tylko dwadzieścia z nich może budować szkielet białek. Aminokwasy budujące białka nazywamy proteinogennymi. Zaliczamy do nich wszystkie aminokwasy oprócz proliny. Aminokwasy proteinogenne możemy podzielić na endogenne i egzogenne.
Endogenne to takie, które produkowane są przez organizm człowieka. Zaliczamy do nich na przykład: alaninę, cysteinę, glicynę.
Egzogenne – są to aminokwasy, których nasz organizm nie jest w stanie sam syntetyzować, więc muszę być one dostarczane do organizmu wraz z pożywieniem. Zaliczamy do nich na przykład: fenyloalaninę, leucynę, lizynę.

Ze względu na swoją budowę aminokwasy można podzielić na cztery grupy, w zależności od posiadanego łańcucha bocznego:

• kwasowe – takie, które zawierają dodatkową grupę karboksylową, na przykład asparginian, glutaminian

• zasadowe – zawierają dodatkową grupę aminową, na przykład lizyna, arginina, histydyna

• niepolarne – posiadające alifatyczny łańcuch boczny, na przykład glicyna, alanina, leucyna

• polarne – (niezjonizowane) na przykład aminokwasy zawierające siarkę cysteina i metionina, czy posiadające grupę hydroksylową seryna, treonina.

Ugrupowania występujące w łańcuchu bocznym aminokwasów biorą udział w tworzeniu wiązań stabilizujących przestrzenną strukturę białek. W praktyce natomiast zróżnicowany charakter podstawnika umożliwia analizę niektórych aminokwasów.

Ważną właściwością aminokwasów jest ich amfoteryczny charakter. Związkami amfoterycznymi nazywamy substancję, które mogą zachowywać się zarówno jak kwas i jak zasada. Aminokwasy są amfoterami ze względu na występowanie w cząsteczce grupy kwasowej i zasadowej. W zależności od odczynu środowiska, aminokwas może zachowywać się, jak kwas lub jak zasada. W środowisku kwaśnym występuje w postaci kationu (słaby kwas), a w środowisku zasadowym anionu (słaba zasada).

Każdy aminokwas ma charakterystyczną wartość punktu izoelektrycznego. Jest to pH roztworu, w jakim cząsteczka znajduje się w formie zjonizowanej. W tym punkcie aminokwas ma ładunek wypadkowy równy zero (występowanie jonu obojnaczego). Gdy pH odbiega od Pi, aminokwas zachowuje się odpowiednio, jak słaby kwas lub zasada.

Podczas wykonywania doświadczenia badaliśmy zachowanie glicyny, tryptofanu, histydyny, tyrozyny, cysteiny, białka kurzego i wody.

Glicyna – najprostszy spośród 20 aminokwasów proteinogennych. Jako jedyny nie jest czynny optycznie (ze względu na to, że z atomem węgla α związane są dwa atomy wodoru). Zalicza się do grupy aminokwasów niepolarnych, alifatycznych. Jest aminokwasem endogennym.

Jako samodzielny aminokwas występuje w roli przekaźnika w ośrodkowym układzie nerwowym. Działa hamująco na przekaźnik receptorów glicynowych. Bierze udział w biosyntezie puryn, w trakcie której zostaje wbudowana do pierścienia nukleotydowego.

Tryptofan - jest obojętny elektrycznie. Wchodzi w skład białek (białko mleka, krwi). Należy do aminokwasów niezbędnych, musi być dostarczony z pożywieniem.

Histydyna – zaliczana jest do aminokwasów zasadowych i aromatycznych. Często jest obecna jako kluczowy aminokwas w centrach aktywnych wielu enzymów.

Tyrozyna – zaliczana do aminokwasów polarnych. Spełnia ważne zadania biologiczne, jako wewnątrzkomórkowy przekaźnik. Jest prekursorem ważnych hormonów i biologicznie czynnych substancji. Jest aminokwasem endogennym. Jest bardzo ważna dla prawidłowego funkcjonowania tarczycy i przysadki mózgowej.

Cysteina – zaliczana do aminokwasów siarkowych. Jest aminokwasem endogennym. Występuje w białkach zbóż i kukurydzy. Po dekarboksylacji, znajduje się w koenzymie A. Utlenienie i dekarboksylacja cysteiny prowadzi do powstania tauryny, wchodzącej w skład soli kwasów żółciowych.

1. Część doświadczalna

   1. Amfoteryczne właściwości aminokwasów.

Zjawisko amfoteryczności można zaobserwować podczas zmiany pH roztworu.

W probówce rozpuściłyśmy szczyptę L- tyrozyny w kilkunastu kroplach HCl. Następnie ostrożnie dodawałyśmy roztworu NaOH do momentu pojawienia się osadu. Po czym zalkalizowałyśmy próbkę, używając mocnego roztworu NaOH.

W czasie dodawania mniej stężonego roztworu NaOH wytrącił się biały osad. W momencie kiedy było go najwięcej osiągnięty został punkt izoelektryczny. Po dodaniu mocnego NaOH osad rozpuścił się.

1. Odczyn ninhydrynowy.

Odczyn ninhydrynowy należy do metod ogólnych analizy aminokwasów. Istotą oznaczenia jest złożona reakcja aminokwasów z ninhydyrną, obejmująca dwa etapy. W pierwszym etapie pod wpływem ninhydyrny cząsteczka aminokwasu utlenia się i przemienia do uboższego o jeden atom węgla aldehydu. Wydziela się amoniak i dwutlenek węgla. Następnie w wyniku kondensacji, za pośrednictwem uwolnionej z aminokwasu cząsteczki amoniaku, cząsteczek zredukowanej i utlenionej ninhydyrny powstaje barwny związek. Intensywność zabarwienia próby jest wprost proporcjonalna do ilości uwolnionego amoniaku, a w konsekwencji do zawartości aminokwasu w próbie.

Do 0,5 ml roztworu badanego związku dodaliśmy taką samą ilość odczynnika nihydrynowego. Przygotowaną mieszaninę ogrzewałyśmy w łaźni wodnej przez 15 minut w 100°C.

Obserwacje:
woda
bezbarwna

1. Reakcja z kwasem azotowym wg. Van Slyke’a.

Aminokwasy pod wpływem kwasu azotowego (III), tworzącego się według reakcji pierwszej, ulegają reakcji deaminacji, której produktami są: azot cząsteczkowy (wydzielający się w formie gazowej) oraz odpowiedni hydroksykwas. Deaminacja α- aminokwasu przebiega zgodnie z drugą reakcją:

Do 2ml roztworu NaNO₂ dodałyśmy po 2ml roztworu CH₃COOH. Wymieszałyśmy i wprowadziłyśmy po 2,5ml odpowiednio: wody, roztworu białka jaja kurzego, glicyny, tryptofanu, histydyny, tyrozyny.

Obserwacje:
woda
bezbarwna

1. Reakcja ksantoproteinowa. (dla aminokwasów aromatycznych)

Podczas ogrzewania aminokwasów aromatycznych ze stężonym kwasem azotowym pierścień aromatyczny ich łańcucha bocznego ulega nitrowaniu. Powstałe nitrowe pochodne wykazują w środowisku zasadowym intensywnie żółtopomarańczowe zabarwienie.

Do probówek wlałyśmy po 1ml odpowiednio: wody, roztworu białka jaja kurzego, glicyny, tryptofanu, histydyny, tyrozyny. Do każdej probówki dolałyśmy po 0,5ml stężonego HNO₃ i ogrzewałyśmy próbki przez 30 sekund, we wrzącej łaźni wodnej. Po ochłodzeniu zalkalizowałyśmy próbki, dodając ok. 3ml roztworu NaOH.

Obserwacje:
woda
bezbarwna

1. Reakcja Millon’a. (dla tyrozyny)

Reakcja Millona jest charakterystyczna dla tyrozyny. Roztwór zabarwia się na czerwono. W przypadku białek zawierających tyrozynę powstają pomarańczowe lub czerwone strąty. Następuje reagowanie jonów rtęciowych ze słabo kwaśną grupą fenolową. Należy pamiętać, że dodatnią reakcję z odczynnikiem Millona dają fenole. Jest to tzw. rtęciowanie pierścienia fenolowego. Odczynnik Millona zawiera azotan rtęciowy, azotan rtęciawy i wolny kwas azotowy.

Do probówek wlałyśmy po 0,5ml odpowiednio: wody, roztworu białka jaja kurzego, glicyny, tryptofanu, histydyny, tyrozyny. Do każdej z probówek dodałyśmy po 0,5ml odczynnika Millon’a i ogrzewałyśmy we wrzącej łaźni wodnej, do powstania barwnego produktu.

Obserwacje:
woda
bezbarwna

1. Reakcje charakterystyczne dla tryptofanu. A – reakcja wg. Rosenheim’a, B – reakcja wg. Adamkiewicza Hopkins’a.

Pierścień indolowy, charakterystyczny dla łańcucha bocznego tryptofanu, tworzy w obecności czynnika utleniającego barwne produkty kondensacji, powstające za pośrednictwem reszty aldehydu mrówkowego lub kwasu glioksalowego.

1. Do probówek wlałyśmy po 1ml odpowiednio: wody, roztworu białka jaja kurzego, glicyny, tryptofanu, histydyny, tyrozyny. Dodałyśmy po 3-4 krople roztworu aldehydu mrówkowego, 1ml stężonego kwasu siarkowego i 2-4 krople nasyconego roztworu siarczanu rtęci. Następnie dokładnie wymieszałyśmy całość.

Obserwacje:
woda
bezbarwna

1. Do probówek wlałyśmy po 1ml odpowiednio: wody, roztworu białka jaja kurzego, glicyny, tryptofanu, histydyny, tyrozyny. Dodałyśmy tę samą objętość roztworu kwasu glioksalowego, wymieszałyśmy i ostrożnie odwarstwiłyśmy 1ml stęż. H₂SO₄.

Obserwacje:
woda
bezbarwna

1. Odczyn Pauly’ego dla histydyny.

Reakcja prowadząca do otrzymania barwnej pochodnej diazowej powstałej w wyniku sprzęgania wytworzonego z kwasu sulfanilowego di azozwiązku ze składową azową, którą stanowi reszta histydyny zawierająca silnie zasadowy pierścień imidazolowy. Wytworzony produkt wykazuje intensywnie czerwone (o odcieniu żółtoczerwonym) zabarwienie. Podobny odczyn daje również tyrozyna.

Do probówek wlałyśmy po 1ml odpowiednio: wody, roztworu białka jaja kurzego, glicyny, tryptofanu, histydyny, tyrozyny. Do każdej probówki dodałyśmy po 2ml roztworu kwasu sulfanilowego i 1ml roztworu azotynu sodu. Wymieszałyśmy i wprowadziłyśmy 1ml roztworu NaOH.

Obserwacje:
woda
bezbarwna

1. Reakcja cystynowa.

W trakcie ogrzewania białek z ługiem dochodzi do ich hydrolizy, zaś zawarta w cystynie i cysteinie siarka ulega uwolnieniu w postaci jonów siarczkowych, które to z jonami Pb2+ dają czarny osad PbS. Metionina (inny aminokwas siarkowy) nie daje dodatniego wyniku, gdyż jej atom siarki jest osłonięty grupą metylenową i w warunkach oznaczenia nie odłącza się od cząsteczki.

Szczyptę L-cysteiny rozpuściłyśmy w 0,5ml wody, dodałyśmy kilka kropli roztworu octanu ołowianego, 1ml roztworu NaOH. Próbkę umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej (na ok. pół godziny).

Obserwacje:
cysteina
czarno – szary osad

1. Wykrywanie aminokwasów – zadanie.

Iga Białasiewicz

1. Reakcja z ninhydryną.

W wyniku tej reakcji otrzymałam ciemnopomarańczowe zabarwienie, świadczące o obecności aminokwasu w próbce. Wykluczyłam w ten sposób obecność wody.

1. Reakcja ksantoproteinowa (przeprowadzona w celu ustalenia, czy w probówce znajduje się aminokwas aromatyczny).

W efekcie reakcji otrzymałam czerwony roztwór, co świadczyło o obecności aminokwasu aromatycznego. Patrząc na wyniki przeprowadzonych przez nas doświadczeń podejrzewałam, że w probówce może znajdować się tryptofan lub tyrozyna.

1. Reakcja Millon’a.

W wyniku przeprowadzenia reakcji charakterystycznej dla tyrozyny otrzymałam wynik pozytywny i roztwór o zabarwieniu ciemnobrunatnym. Świadczy to o obecności tyrozyny.

Wykryty aminokwas:

TYROZYNA

Daria Woźniak, Sara Nastałek

1. Reakcja z ninhydryną.

W wyniku tej reakcji otrzymałyśmy ciemnobrązowe zabarwienie roztworu, świadczące o obecności aminokwasu w próbce. Brak więc wody.

1. Reakcja ksantoproteinowa (przeprowadzona w celu ustalenia, czy w probówce znajduje się aminokwas aromatyczny).

W efekcie reakcji otrzymałyśmy ciemnoczerwony roztwór, co świadczyło o obecności aminokwasu aromatycznego. Patrząc na wyniki przeprowadzonych przez nas doświadczeń podejrzewałam, że w probówce może znajdować się tryptofan.

1. Reakcja wg Adamkiewicza-Hopkins’a.

W wyniku przeprowadzonej reakcji otrzymałam, widoczną na granicy faz, ciemną obrączkę. Reakcja ta potwierdziła obecność tryptofanu.

Wykryty aminokwas:

TRYPTOFAN

Wnioski.

Amfoteryczność.
Po dodaniu do L-tyrozyny roztworu kwasu świadczy o tym, że aminokwas w próbie znajdował się w formie kationu. W momencie, gdy osadu było najwięcej (w czasie alkalizowania słabym roztworem NaOH) został osiągnięty punkt izoelektryczny (obecność amfijonu). W tym momencie rozpuszczalność aminokwasu była najmniejsza. Po dodaniu mocnej zasady osad rozpuścił się, a więc pH odbiegło od wartości punktu izoelektrycznego (pH zasadowe, aminokwas w formie anionu).

Odczyn ninhydrynowy.

Dzięki reakcji z ninhydryną, możemy stwierdzić obecność aminokwasu w próbie. Pod wpływem ninhydryny, aminokwasy ulegają utlenieniu (do dwutlenku węgla, wody, aldehydu uboższego o jeden atom węgla). W wyniku kondensacji dwóch cząsteczek ninhydryny, powstaje barwny produkt (ciemne zabarwienie).

Reakcja z kwasem azotowym wg. Van Slyke’a.

Reakcja wg Van Slyke’a, podobnie do reakcji z odczynnikiem ninhydrynowym, pozwala stwierdzić obecność aminokwasów w roztworze. W próbkach zawierających aminokwasy zaobserwowałyśmy występowanie pęcherzyków gazu (wydziela się cząsteczkowy azot). Natomiast aminokwasy aromatyczne dają żółty kolor, co spowodowane jest powstaniem nitrowej pochodnej.

Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych.
Reakcja ksantoproteinowa pozwala wykryć obecność aminokwasów aromatycznych. W reakcji aminokwasów aromatycznych (tyrozyny, tryptofanu) ze stężonym kwasem azotowym, pierścień aromatyczny bocznego łańcucha ulega nitrowaniu. Po zalkalizowaniu próbki, obserwujemy zabarwienie roztworu (zabarwienie powstałych nitrowych pochodnych).

Reakcja Millon’a dla tyrozyny.
W wyniku przeprowadzonej reakcji, intensywnie zabarwiła się tylko próbka zawierająca tyrozynę (na kolor czerwo-brunatny). Reakcja pozwala wykryć ten konkretny aminokwas. W wyniku nitrowania tyrozyny w obecności jonów rtęci, powstaje sól rtęciowa, mająca charakterystyczne, ceglastoczerwone zabarwienie.

Reakcja charakterystyka dla tryptofanu. A – odczyn aldehydowy wg. Rosenheim’a.
Reakcja ta pozwala na wykrycie obecności tryptofanu. W wyniku tej reakcji, tworzy się barwny produkt kondensacji, dający widoczną, brunatnofioletową barwę.

Reakcja charakterystyka dla tryptofanu. B – reakcja wg. Adamkiewicza – Hopkins’a.
Reakcja ta pozwala na wykrycie obecności tryptofanu. Tylko w przypadku próbki zawierającej tryptofan, na granicy faz obserwujemy pojawienie się ciemnej obrączki. Pierścień indolowy, zawarty w łańcuchu bocznym tryptofanu, tworzy w obecności czynnika utleniającego barwne produkty kondensacji, które powstają przy udziale reszty kwasu glioksalowego.

Odczyn Pauly’ego dla histydyny.
Reakcja ta pozwala wykryć obecność histydyny. Tylko w tej próbce obserwujemy intensywne, czerwone zabarwienie. W wyniku reakcji otrzymujemy barwną pochodną diazową, wykazującą intensywne zabarwienie.

Reakcja cystynowa.
Reakcja ta pozwala na wykrycie obecności cysteiny w roztworze. Podczas ogrzewania w 100^oC i mocno zasadowym środowisku, w cząsteczce cysteiny siarka zostaje uwolniona i przechodzi do roztworu w postaci jonów siarczowych. W wyniku reakcji z obecnymi jonami ołowiawymi, powstaje ciemny osad siarczku ołowianego.