1.Budowa genomu E. Coli.

Genom E. coli to dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA o wielkości 4700000 pz.

Brak wolnych końców 5’ i 3’

Cząsteczka DNA jest bardzo skondensowana, czyli superzwinięta- tworzy jajowatą strukturę- nukleoid

Upakowanie DNA jest efektem działania białek HU, HNS, SMC

Białka HU i HNS są w genomie E. coli reprezentowane w obfitości, łączą się z DNA tworząc superzwinięte domeny ( 20000- 100000 pz). Połowa z tych domen nigdy się nie rozwija, zwinięcie to jest negatywne, czyli niezgodne z ruchem wskazówek zegara.

Negatywne superzwoje są utrzymywane przez topoizomerazy.

Szczególnym rodzajem topoizomeraz jest enzym gyraza, który usuwa pozytywne superzwoje, powstające podczas replikacji DNA oraz transkrypcji.

2. W jaki sposób jest upakowany DNA w nuklenoidzie bakterii.

Organizacja genomów protokariotycznych jest zasadniczo różna od organizacji genów eukariotycznych. Występuje tu nukleoid, w którym jest upakowana cząsteczka kolista DNA. U E. coli jest on długości ok. 15000 um DNA.

Konsekwencją kulistej natury genomu bakterii jest to, że wszystkie geny są genetycznie sprzężone. U eukariontów genom podzielony jest na chromosomy, a geny w jednym chromosomie są sprzężone, a więc jest tyle grup genów sprzężonych ile jest chromosomów.

Prawie cały DNA bakteryjny ma charakter kodujący. Elementy 3’ lub 5’ kontrolują transkrypcję.

Większość genów jest zgrupowana i tworzy jednostki transkrypcyjne zwane operonami, kontrolowane wspólnie przez 5’ flankujące elementy kontrolne.

Bardzo rzadko występują sekwencje powtarzalne i introny. Ma to związek z małymi wymiarami komórek bakteryjnych, które nie mają miejsca na lokalizację większej ilości sekwencji nukleotydowych DNA. Czas replikacji jest także ograniczony przez bardzo szybkie cykle komórkowe.

Obecność plazmidów

Geny pochodzące z tej samej bakterii lub z innego gatunku, czy z wirusa infekującego bakterię mogą zostawać wstawiane w plazmid.

Bakteryjne plazmidy często zawierają transpozony, genetyczne elementy ruchome

Protokariota mają prostą budowę genów, bez intronów. Nie oznacza to jednak, że ich mechanizm działania i regulacja ich funkcji są proste i uniwersalne.

Genom bakteryjny, jako całość zorganizowany jest od 50 do 100 wielkich pętli lub domen. Wielkość domen (50000- 100000 pz). Końce tych domen łączą się z kompleksem białek błonowych tworząc macierz nukleoidową, swoiste rusztowanie dla genomu bakteryjnego.

Genom jest ujemnie zwiniętą superhelisą. Domeny mogą być niezależne od siebie pod względem położenia- mogą utrzymywać różny poziom superhelikalności.

3.W jaki sposób wiekszość wirusów wnika do komórki gospodarza.

Na drodze pinocytozy – wiropeksji wnika cały winion do wnętrza komórki. W tym pośredniczy białko klatryna, która otacza wirus i w pęcherzykach wnika do komórki. Uwolnienie wirusa z otoczki następuje przy pomocy białka wirusowego hemaglutyniny (HA). Po uwolnieniu wirus migruje do jądra komórkowego i tam ulega transkrypcji i replikacji. Nie wiadomo jak jest zabezpieczany kwas nukleinowy wirusa w cytoplazmie przed nukleazami.

4.Plan replikacji wirusowego RNA po zakażeniu komórki.

Plan replikacji wirusowej:

1.Wirus przyłącza się do komórki

2.Wnika do jej wnętrza

3.Odpłaszcza się, tzn. traci otoczkę białkową

4.DNA jest przepisywane na różnorodne mRNA kodujące albo 5’ wczesne albo późne białka. Oba typy białek są syntetyzowane na rybosomach komórkowych. Białka wczesne mogą być…

Wszystkie wirusy mają na swojej powierzchni białko, które ma miejsce wiążące receptor znajdujący się na powierzchni komórki.

Po przyłączeniu się do komórki następuje fuzja otoczki wirusa z błoną plazmatyczną komórki i uwolnienie kwasu nukleinowego wirusa. Wirusy mają specjalne białko fuzyjne pośredniczące w zlewaniu się lipidów osłonki wirusa i błony komórkowej.

Na drodze pinocytozy – wiropeksji wnika cały winion do wnętrza komórki. W tym pośredniczy białko klatryna, która otacza wirus i w pęcherzykach wnika do komórki. Uwolnienie wirusa z otoczki następuje przy pomocy białka wirusowego hemaglutyniny (HA). Po uwolnieniu wirus migruje do jądra komórkowego i tam ulega transkrypcji i replikacji. Nie wiadomo jak jest zabezpieczany kwas nukleinowy wirusa w cytoplazmie przed nukleazami.

5.Budowa operonu laktozowego.

Geny kodujące mRNA są rozmieszczone wokół cząsteczki DNA i są zorganizowane w operony. W operonie może znajdować się kilka genów kodujących jeden do kilku polipeptydów. Maja one wspólny promotor i są transkrybowane, jako całość.

dwie klasy enzymów u E. coli: enzymy konstytutywne i enzymy indukowane, które powstawały tylko w obecności substratu- induktora. Zasugerowało to istnienie mechanizmu regulacyjnego, który później nazwany został operonem.

W operonie geny nie są rozdzielone od siebie. Nawet niektóre sekwencje kodujące w operonie zachodzą na siebie.

OPERON LAC- przykład budowy genów kodujących mRNA u bakterii

3 geny strukturalne lacZ, lacY, LacA. LacZ koduje B-galaktozydazę, enzym, który tnie laktozę na galaktozę i glukozę, które są źródłem energii dla bakterii.

LacY koduje permeazę laktozową, białko błonowe systemu transportu laktozy i B- galaktozydazy do komórki.

LacA koduje transacetylazę, która oczyszcza komórkę z toksycznych tiogalaktozydów pobranych przez permeazę.

W górę od tych genów jest gen regulatorowy, kodujący rep resor Lac. Jest on stale aktywny pod kontrolą własnego promotora.

Operon lac E. coli zawiera wewnętrzne terminatory transkrypcji zależne od Rho i białko to kończy transkrypcję w przypadku niedoboru aminokwasów w komórce. Wewnątrzgenowe terminatory nie funkcjonują w warunkach normalnej ekspresji, dlatego, że przeszkadza im obecność rybosomów, które prowadzą translację równocześnie niemal z transkrypcją. Jednak, kiedy jest brak aminokwasów biosynteza białek zostaje zahamowana, a wtedy zostaje eksponowana sekwencja rut na transkrypcie i przyłącza się tam białko Rho i kończy transkrypcję. Dla komórki jest to energetycznie korzystne gdyż zapobiega wydatkowi energii na transkrypt, który nie będzie ulegał translacji.

OPERON TRYPTOFANOWY

Operon tryptofanowy składa się z genów kodujących syntezę tryptofanu. Jest on regulowany przez białko represorowe, które aktywowane jest przez połączenie się z tryptofanem i w tej sytuacji tryptofan jest korepresorem. W związku, z tym, że sam tryptofan jest korepresorem i jest zaangażowany w regulację to poziom transkrypcji jest stopniowany, w zależności od poziomu tryptofanu w komórce.

Ekspresja tego operonu jest regulowana attenuacją. Sekwencje nukleotydowe budują obszar attenuatora i te sekwencje są obecne w transkrybowanym mRNA i są one zaangażowane w regulację transkrypcji po tym jak polimeraza RNA zainicjuje syntezę RNA. Sekwencje attenuatorowe w RNA występują w pobliżu końca 5’ obszaru liderowego RNA. Sekwencje liderowe są ulokowane przed startem obszaru kodującego pierwszego genu w operonie- trpE. Obszar attenuatora ma kodony dla małego liderowego polipeptydu tandemami kodonów tryptofanowych. Ten obszar jest zdolny do tworzenia różnych stabilnych struktur pień- pętla. Zależnie od poziomu tryptofanu i poziomu trp- tRNA i pozycja rybosomów na liderowym polipeptydzie i częstość na translacji pozwalają na tworzenie tych struktur.

6.Opisać punkt startu replikacji DNA u bakterii.

U eukariotów i prokariotów replikacja DNA zawsze poprzedza podział komórkowy i ma miejsce w fazie s cyklu komórkowego.

Replikacja DNA jest procesem syntezy Dna na podstawie wzorca, którym jest jedna z nici DNA

Replikacja jest procesem enzymatycznym, który jest prowadzone przez różne białka enzymatyczne i czynniki niezbędne do działania tych enzymów i procesu replikacji zwane czynnikami replikacyjnymi.

Proces replikacji DNA składa się z fazy: startu, elongacji i zakończenia.

Model startu replikacji proponuje istnienie dwóch składników: replikator i inicjator, które kontrolują start replikacja.

Replikatorem są sekwencje DNA wystarczające do kierowania inicjacją replikacji. Ori jest zawsze częścią replikatora, a czasami szczególnie w kom eukariotycznych, ori jest tylko frakcją sekwencji nukleotydowych koniecznych do kierowania startem replikacji.

Inicjatorem jest to kompleks białkowy, który rozpoznaje specyficzne sekwencje DNA w replikatorze, czyli w punktach ori i aktywuje inicjację replikacji. To inicjatorowe białko występuje we wszystkich organizmach.

U bakterii punkt startu replikacji nazywa się ori C. W tym punkcie są dwa motywy powtórek nukleotydowych bardzo ważnych do funkcjonowania tego miejsca ori- cztery powtórki sekwencji 9 pz, które są miejscami łączenia białka DnaA, 3 powtórki 13 pz, które inicjują powstanie ssDNA w czasie inicjacji. Punkt ten ma długość 245 pz.

7.Jak zachowują się polimerazy DNA w widełkach replikacyjnych u bakterii w porównaniu do eukariota.

RÓŻNICE W WIDEŁKACH REPLIKACYJNYCH MIĘDZY BAKTERIAMI A EUKARIOTAMI

U bakterii dwie polimerazy III replikują razem, jako dimer

U eukariontów nie ma struktury dimerowej a polimerazy sigma i eta replikują oddzielnie nić wiodącą i opóźnioną. Nad tym czuwa kompleks białkowy- czynnik replikacyjny C, który kontroluje odłączanie się i włączanie się enzymu na nici opóźnionej.

W kom. eukariotycznych nie ma replisomu. Są natomiast liczne kompleksy białkowe replikacyjne na stałe związane z macierzą jądrową tworzące tzw. fabryki replikacyjne.

Eukariotyczna polimeraza alfa zawiera aktywność prymazową i może budować startery na początku nici wiodącej jak i na początku fragmentów Okazaki.

Usuwanie starterowego RNA odbywa się za pomocą endonukleaz FEM1, a u bakterii czyni to polimeraza z aktywnością egzonukleazy 5’ > 3’

U eukariotów nie ma sekwencji DNA kończących replikację DNA.

8.Zakończenie replikacji DNA u bakterii.

Sekwencje DNA terminatorowe u E. coli- jest ich 7. Do nich przyłącza się białko, Tus, które pozwala na przejście widełek replikacyjnych tylko w jednym kierunku, a zatrzymuje przejście widełek w kierunku przeciwnym. Zatrzymuje działanie helikazy odpowiadającej za ruch widełek.

Po replikacji kolistej cząsteczki DNA, potomna cząsteczka jest połączona z wzorcem jako katenan. Aby cząsteczki mogły segregować top II rozłącza je;

Cząsteczka liniowa kończy replikacje na nici opóźnionej w ten sposób, że dl ostatniego fragmentu Okazaki używa jako startera białko z grupą OH przy C5’. Takie białko występuje w liniowych chromosomach niektórych bakterii i wirusów zwierzęcych.

ZAKOŃCZENIE REPLIKACJI U EUKARIOTA

Brak sekwencji terminacyjnych. Jest replikowany w kompleksach replikacyjnych i każdy kompleks replikuje określony fragment DNA w uporządkowanej strukturze. U Eukariota DNA jest upakowany w chromosomach. Każdy chromosom zawiera jedną cząsteczkę DNA. Końce takiej cząsteczki i chromosomu nazywają się telomery. Replikacja DNA telomerowego prowadzona jest przez telomerazę. Enzym telomeraza zawiera cząsteczkę RNA, która służy za matrycę do syntezy DNA.

RÓŻNICE W WIDEŁKACH REPLIKACYJNYCH MIĘDZY BAKTERIAMI A EUKARIOTAMI

U bakterii dwie polimerazy III replikują razem, jako dimer

U eukariontów nie ma struktury dimerowej a polimerazy sigma i eta replikują oddzielnie nić wiodącą i opóźnioną. Nad tym czuwa kompleks białkowy- czynnik replikacyjny C, który kontroluje odłączanie się i włączanie się enzymu na nici opóźnionej.

W kom. eukariotycznych nie ma replisomu. Są natomiast liczne kompleksy białkowe replikacyjne na stałe związane z macierzą jądrową tworzące tzw. fabryki replikacyjne.

Eukariotyczna polimeraza alfa zawiera aktywność prymazową i może budować startery na początku nici wiodącej jak i na początku fragmentów Okazaki.

Usuwanie starterowego RNA odbywa się za pomocą endonukleaz FEM1, a u bakterii czyni to polimeraza z aktywnością egzonukleazy 5’ > 3’

U eukariotów nie ma sekwencji DNA kończących replikację DNA.

9.Jak jest zbudowana bakteryjna polimeraz RNA .

Zbudowana z rdzenia i czynnika transkrypcyjnego σsigma --> holoenzym.

Rdzeń enzymu katalizuje polimeryzację RNA z każdego Dna i jest to kompleks podjednostek białkowych alfa 1 i alfa 2, beta, beta’ i omega. Te podjednostki i ich struktura i funkcja są ewolucyjnie zakonserwowane. Występują i u bakterii i człowieka. Mają powinowactwo do większości DNA, bez względu na źródło DNA.

Czynnik sigma wyznacza specyficzność łączenia się polimerazy z promotorem danego genu. Bez sigma rdzeń enzymu może inicjować transkrypcję z każdego DNA promotora, natomiast jego obecność redukuje niespecyficzność łączenia się polimerazy RNA.

Polimeraz RNA została wyizolowana z Thermus aquaticus. Kształtem przypomina kraba. Zamknięcie szczypiec przyczynia się do zwiększenia intensywności polimerazy RNA. Miejsce aktywne znajduje się w tyle tunelu. UZUPEŁNIĆ!

Czynnik sigma zaangażowany jest w rozpoznawanie promotorów, a w nich sekwencji -35 i -10. Sekwencja -10 odpowiedzialna za rozdział nici DNA- topnienie nici i ekspozycja promotora, czyli nici wzorcowej. Czynnik sigma ma 4 domeny, której dalej się dzielą na subdomeny odgrywając rolę w rozpoznaniu promotora.

Najbardziej powszechny jest czynnik sigma 70, który przyłącza Pol RNA do większości genów u E. coli. U E. coli występują także inne czynniki sigma, ta różnorodność może wpływać na zdolności adaptacyjne bakterii.

10. Co to są plazmidy + episomy

Forma dwuniciowego DNA

Stanowi od 0, 1 do 5% ilości całego DNA w nukleoidzie, występuje w cytoplazmie bakteryjnej

Wielkość plazmidu waha się od 2 000 do 100 000 pz.

Wyróżnia się także rzadziej spotykane plazmidy liniowe

Plazmidy są autonomiczne- same replikują swoje DNA, w czasie podziału komórkowego jedna kopia informacji zawartej w plazmidzie trafia do komórki potomnej

Plazmidy mają wiele genów posiadających odporność na antybiotyki, stąd stanowią nośniki w technologii

Plazmidy w stosunku do komórki gospodarza mogą mieć charakter pasożytniczy lub symbiotyczny

Oprócz plazmidów w komórce bakteryjnej występują episomy. Są one również autonomiczne, jednakże mogą integrować z bakteryjnym chromosomem. Przykładem episomu jest czynnik F, który kontroluje koniugację bakterii oraz wymianę pomiędzy nimi genów.

11. SV40

DNA SV40 jest połączony z nukleosomami komórki gospodarza i tworzy minichromosomy wewnątrz wirionu i w jądrze zainfekowanej komórki. Obie nici DNA są używane jako matryce. Jedna nić jest replikowana wcześniej w cyklu replikacyjnymi wirusa i z niej jest syntetyzowane białko, konieczne do replikacji wirusowego DNA. Uważa się, że wczesny mRNA wirusa, transkrybowany jest z wolnego rodzicielskiego DNA, co oznacza, że integracja wirusowego DNA z DNA gospodarza nie jest konieczna dla ekspresji wczesnego genu wirusowego.

12. Transpozony

GENETYCZNE ELEMENTY RUCHOME U EUCARYOTA

Genetyczne elementy ruchome należą do klasy sekwencji powtarzalnych DNA.

Ich cechą unikatową jest to, że są ruchome- skaczące geny, elementy transpozycyjne.

Transpozony są wszechobecne. Elementy te mogą wywoływać zmiany mutacyjne w genomie, jednak ich sposób działania różni się od działania poznanych czynników mutagennych.

Są zdolne do włączania się w różnych miejscach w genomie, nie wymagają do tego sekwencji homologicznych DNA dla rekombinacji. Wpływają na funkcje genów, w których są włączone.

Można je odróżnić od mutacji tym, że ich działanie ma charakter komórkowy oraz na podst. Niezwykle częstego powrotu fenotypu zmutowanego do jego postaci pierwotnej.

Jeżeli element zostanie włączony w obszar genu warunkującego kolor czerwony, to wtedy zabarwienie danej partii rośliny będzie białe. Jeżeli jednak w określonych komórkach nastąpi wycofanie się elementu z obszaru tego genu to w tym miejscu pojawi się czerwony barwnik na białym tle. Powstanie fenotyp mozaikowy.

Bezwzględnym warunkiem poruszania się transpozonów jest obecność sekwencji kodującej enzym- transpozazę. Poruszanie jest także możliwe dzięki enzymom kodującym duplikacją, wycinaniem, integracją i sposobem transkrypcji.

Wyróżniamy dwie klasy transpozonów:

TRANSPOZONY- replikują się za pośrednictwem DNA, zawierają sekwencje kodujące enzym- transpozazę i tak jak wszystkie elementy ruchome sekwencje nukleotydowe na końcach transpozonów mają charakter odwróconych powtórek.

RETROTRANSPOZONY- pozostałości infekcji wirusowych. Replikują za pośrednictwem RNA, przy pomocy enzymu- odwrotnej transkryptazy. Ruch tych elementów jest realizowany poprzez wytwarzanie kopii RNA, którą odwrotna transkryptazy przepisuje na DNA. Dopiero DNA może integrować w losowym miejscu w genomowym DNA.

Mogą być pochodzenia wirusowego (spokrewnione z retrowirusami). Wszystkie kodują własną, odwrotną transkryptazy. Mogą pochodzić z genów komórkowych RNA.