Opisz PCR
PCR jest metodą replikacji DNA w warunkach in vitro. Materiałem wyjściowym jest dwuniciowy DNA. Do reakcji dodawane są w dużych ilościach dwa startery, z których każdy ma sekwencję komplementarmną do jednej z nici DNA, na końcach amplifikowanego rejonu. Do reakcji dodawane są też dNTP i termostabilna polimeraza DNA. W I cyklu DNA jest denaturowany w 95stopniach, a nast. temp obniża się do 55-65stC. , aby umożliwić hybrydyzację starterów z komplementarnymi sekwencjami w docelowym DNA. Polimeraza Taq wydłuża startery od końca 5’ do 3’ tworząc nowo zsyntetyzowane nici, które wystają poza amplifikowany rejon. Wydłużanie jest prowadzone w temp 72 st. C. W drugim, cyklu pierwotny i nowo utworzony DNAsą denaturowane w 95 stC, a startery hybrydyzują do komplementarnych sekwencji w temop 55-65. Każdy starter jest znowu wydłużany przez Taq. W trzecim cyklyu powst dwie cząst dwiniciowego DNA.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest reakcją przeprowdzaną przez polimerazę DNA. Wymaga matrycy DNA i wolnego końca 3’-OH, aby polimeraza mogła rozpocząć reakcję. Reakcja składa się z trzech etapów. Etap I: DENATURACJA. Sekwencja DNA zostaje zdenaturowana pod wpływem temperatury, aby uzyskać jednoniciową matrycę DNA. Etap II: PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW. DNA zostaje schłodzony, co umożliwia przyłączenie się starterów do końców komplementarnej niki. Etap III: WYDŁUŻANIE STARTERÓW. W obecności jonów Mg2+, w wyniku aktywności polimerazowej, polimeraza DNA wydłuża startery na obu niciach od końca 5’ do końca 3’. Najbardziej popularnym enzymem jest polimeraza Taq (wyizolowana z bakterii ternmkofilnych. Te etapy są powtarzane od 28 do 35 razy. Po 25 cyklach w automatycznym aparacie do PCR (termocyklerze) powstaje 2^25 kopii docelowej sekwencji.
2. Enzymy restrykcyjne. Opis działania i przyklad
enzymy restrykcyjne to enzymy z grupy endonukleaz które przecinają dna w mijsca ze specyficznymi sekwencjami zwanymi miejscami restrykcyjnymi; np. EcoRI, BamHI. Są dwie kategorie enzymów: endonukleazy restrykcyjne i ligazy DNA. ER rozpoznają i przecinają specyficzne, krótkie sekwencje w dwuliniowej cząsteczce DNA, które nazywane są miejscami restrykcyjnymi.
3. Zbior materiału roślinnego na izolację DNA
ta truskawka ze po zbiorze w 196 minus w ciekłym azocie głębokie mrożenie potem gnieciesz potem enzymy lizujace potem etanol i SDS potem przemywanie etanolem potem chyba pod wodą destylowana
Do woreczka z truskawką – detergent i woda kropla. Macerujemy i przesączamy przez gazę, żeby oddzielić ciecz od tego. Dodajemy 99,8% alkohol
IZOLACJA DNA z roślin cucurbitaceae
1.mechaniczne rozdrobnienie – ucieranie tkanki w moździerzu (żeby zniszczyć ściany komórkowej
4. Przygotowanie żelu agarozowego
Przygotowanie żelu agarozowego: przygotować 50 ml 1% roztworu agarozy
w
buforze 0,5x TBE. Ogrzewać roztwór w kuchence mikrofalowej do całkowitego
rozpuszczenia agarozy.
Odczekać aż roztwór ochłod
zi się do około 60°C ( naczynie
można utrzymać w dłoni) i dodać 1
0
μl roztworu bromku etydyny. Żel wylać do
aparatu, nałożyć grzebienie i pozostawić do polimeryzacji.
Po polimeryzacji
wyciągnąć grzebień i zalać żel buforem 0.5x TBE
albo
Ustalamy stężenie żelu agarozowego (w zależności od wymogów można użyć poliakrymidu) w jakim ma być przeprowadzona elektroforeza, najczęściej 1%.
Odważamy np. 0,7 g agarozy, wsypujemy do pojemnika i dopełniamy do 70 ml buforu 1x TBE (raz stężonego).
Wkładamy pojemnik do mikrofalówki na 1minutę po to by rozpuścić agarozę. Po minionym czasie wyjmujemy zlewkę z rozpuszczonym żelem, by lekko zamieszać i wkładamy na kolejne 30-60 sekund do podgrzania.
Następnie stawiamy pojemnik na stole na ok. 5 – 10 minut aby się ostudziła do ok. 60˚C.
Dodajemy 5 μl bromku etydyny w odpowiednim stężeniu, np. 10 mg/ml, który wchodzi między zasady kwasu nukleinowego (interkaluje) i pozwala na późniejszym etapie po światłem UV zlokalizować fragmenty DNA lub RNA. Mieszamy dodany odczynnik zasłaniająć najlepiej wylot zlewki. Bromek etydyny ze względu na opisane właściwości ma toksyczne, rakotwórcze właściwości – powoduje szkodliwe w skutkach mutacje. Dlatego czynność dodawania bromku robi się przy założonych rękawicach i minimalizując parowanie roztworu.
Wlewamy żel do sanek (wcześniej wkładamy przekładki, które decydują o rozmiarze żelu. Szerszą końcówką zużytego tipsa usuwamy powstałe bąbelki, które mogą zakłócić wynikowy obraz.
Wkładamy grzebień, który uformuje w żelu dołki (studzienki) w które nałożone zostaną próbki.
Czekamy aż żel stężeje – około 20 – 30 minut. Następnie wkładamy żel z sankami do naczynia od elektroforezy.
Jeśli trzeba dolewamy raz stężonego buforu TBE, tak by żel był pokryty 2-5 mm warstwą cieczy (to tzw. running Buffet – bufor w którym dojdzie do rozwinięcia próbek na żelu).
Dodajemy do pierwszego dołka marker, około 2 μl . Służy nam do określenia długości rozwijanego produktu.
Załadowujemy próbki z właściwym, badanym materiałem – DNA, RNA, np. po PCR. Zwykle wstrzykuje się około 10 μl.
Zamykamy aparat do elektroforezy. Podłączamy ją do prądu I ustawiamy np. na 5V/cm. Elektroforeza trwa w zależności od ustawionego napięcia, ilości nakładanej próbki i stężenia żelu, zwykle około 30 – 45 min.
Co jakiś czas sprawdzamy, czy próbki migrują w żelu oraz na stan rozwinięcia markera.
Po minionym czasie wyłączamy aparat z prądu.
Przenosimy żel do ciemni, gdzie obserwujemy w świetle UV (uwaga na oczy!) próbki z żelem zawierającym bromek etydyny.