Spektrometria

Sprawozdanie

Spektrometria

Zestaw 4

Wykonali:

---- Ocena 5,0

Ćwiczenie 1: Wyznaczanie molowego współczynnika absorpcji.

Celem ćwiczenia jest eksperymentalne wyznaczenie molowego współczynnika absorpcji przy wykorzystaniu prawa Lamberta-Beera.

Użyte materiały:

spektrofotometr
kuwety
pipety automatyczne
końcówki do pipet
probówki szklane
tryskawka
DCIP

Wykonanie:

Do wykonania tego ćwiczenia użyliśmy roztworu DCIP przygotowanego przez naszych kolegów z innej podgrupy.
Przygotowaliśmy 10 probówek szklanych i sporządziliśmy w nich po 10ml roztworu DCIP o różnym stężeniu, według poniższej tabeli:

Nr probówki	100 μM DCIP [ml]	Woda dejonizowana [ml]
0	0,00	10,00
1	0,25	9,75
2	0,50	9,50
3	0,75	9,25
4	1,00	9,00
5	1,25	8,75
6	1,50	8,50
7	1,75	8,25
8	2,00	8,00
9	2,50	7,50

Zmierzyliśmy absorbancję przygotowanych roztworów DCIP przy długości fali 600nm stosując probówkę nr 0 jako próbę odniesienia. Pomiary zaczynaliśmy od najniższych stężeń do najwyższych. Dla każdego stężenia wykonaliśmy po trzy pomiary.

Opracowanie wyników:

$$c = \frac{V_{100\text{μM\ DCIP}\ } \bullet \ 100\text{μM}}{V_{100\text{μM\ DCIP}\ } + \ V_{\text{wody\ dejonizowanej}}}$$

Nr probówki	Pomiar 1	Pomiar2	Pomiar3	Stężenie DCIP [µM]	Średnia absorbancja
0	0,000	0,000	0,000	0,000	0,000
1	0,022	0,063	0,046	2,5	0,044
2	0,077	0,070	0,071	5	0,073
3	0,061	0,077	0,081	7,5	0,073
4	0,105	0,078	0,084	10	0,089
5	0,113	0,107	0,112	12,5	0,111
6	0,114	0,161	0,157	15	0,144
7	0,114	0,152	0,151	17,5	0,139
8	0,119	0,205	0,212	20	0,179
9	0,261	0,300	0,292	25	0,284

Stosując metodę najmniejszych kwadratów wyznacz współczynniki regresji liniowej (Y = aX + b). Współczynnik a jest poszukiwanym molowym współczynnikiem absorpcji ε.

$$a = \frac{sr.y - b}{sr.x}$$

Y = 0,0095x + 0,0037

Molowy współczynnik absorpcji ε = 0,0095 $\frac{\text{dm}^{3}}{\text{mol}\ x\ \text{cm}}$ ZŁA JEDNOSTKA

$$b = \frac{(\Sigma x_{i}\ \bullet \ \Sigma x_{i}y_{i}\ \ \Sigma\left( x_{i}^{2} \right)\ \bullet \ \Sigma y_{i})}{{(\Sigma x_{i})}^{2} - \ n\ \Sigma(x_{i}^{2})}$$

b = 0,0037

Oceń jakość sporządzonej krzywej wyznaczając współczynnik korelacji liniowej Pearsona r).

R²=0,9291
Porównaj uzyskane wartości ε i R² z wartościami uzyskanymi przez inne grupy:

GRUPA	ε	R²
1	0,0095	0,9291
2	0,0344	0,9587
3	0,0083	0,9331

Wnioski: Różnice pomiędzy wynikami poszczególnych grup mogą wynikać z niedokładności pomiarów wykonanych przez grupy, bądź też niedokładności przygotowywania roztworów DCIP.

Nasze wyniki wartości ε i R² są najbardziej zbliżone do wyników grupy trzeciej, co świadczy o podobnej jakości wykonywania ćwiczenia.

Ćwiczenie 2: Wpływ pH na własności spektralne związków chemicznych.

Celem ćwiczenia jest pokazanie na przykładzie błękitu bromofenolowego, że właściwości spektralne związków chemicznych zależą od pH.

Użyte materiały:

Spektrofotometr
Kuwety
Pipety automatyczne
Końcówki do pipet
Probówki szklane
0,1% roztwór błękitu bromofenolowego
kwas cytrynowy (m.cz. wynosi 192,12 g/mol)
wodorofosforam dipotasu K₂HPO₄ (m.cz. wynosi 141,96 g/mol)

Wykonanie:

Mieliśmy przygotować 50ml 0,1M kwasu cytrynowego i 50ml 0,2M Na₂HPO₄. Aby to zrobić musieliśmy najpierw obliczyć masę obu tych substancji. Obliczenia zostały przedstawione poniżej:

Kwas cytrynowy:

0,1 mol – 1000ml

x – 50ml

x = 5 ∙ 10^-3 mola

1 mol – 192,12g

5 ∙ 10^-3 mola - x

x = 0,9606g

Na₂HPO₄:

0,2 mola – 1000ml

x – 50ml

x = 0,01 mola

1 mol – 141,96g
0,01 mola – x

x = 1,4196g

Odważoną ilość poszczególnych substancji wsypaliśmy do zlewki, następnie rozpuściliśmy ją w 40 ml wody destylowanej. W cylindrze miarowym roztwór uzupełniliśmy wodą destylowaną do 50ml.

Przygotowaliśmy 9 probówek szklanych i sporządziliśmy w nich po 5ml buforu cytrynianowo-fosforanowego o różnych wartościach pH według poniższej tabeli:

pH	0,1M kwas cytrynowy [ml]	0,2M Na2HPO4 [ml]
2,6	4,45	0,55
3,2	3,75	1,25
3,8	3,20	1,80
4,4	2,80	2,20
5,0	2,40	2,60
5,6	2,10	2,90
6,2	1,70	3,30
6,8	1,15	3,85
7,4	0,45	4,55

Do każdej probówki dodaliśmy po 50μl 0,1% roztworu błękitu bromofenolowego, a następnie każdą z nich wymieszaliśmy.
Naszym celem była obserwacja kolorów, jakie przybrał błękit bromofenolowy w probówkach o różnych wartościach pH. Roztwory o pH równym 2,6 oraz 3,2 przybrały kolor żółtawy, kolejna probówka o pH równym 3,8 była koloru przezroczystego (podchodzącego odrobinę pod szary/błękitny/niezidentyfikowany). Pozostałe probówki, czyli probówki o pH równym 4,4; 5,0; 5,6; 6,2; 6,8; 7,4 miały barwę fioletową.
Przygotowaliśmy 4 kuwety. Do pierwszej wlaliśmy 1,5ml wody, do drugiej 1,5ml roztworu z probówki o pH 2,6, do trzeciej 1,5ml roztworu z probówki o pH 7,4, a do czwartej roztworu z probówki o kolorze przejściowym, czyli o pH 3,8.
Ustawiliśmy spektrometr na długość fali λ=400nm i wyzerowaliśmy go względem kuwety z wodą. Zmierzyliśmy i zanotowaliśmy abosrbancję kuwet nr 2, 3 i 4. Pomiary absorbancji powtarzaliśmy zmniejszając za każdym razem długość fali o 20nm. Przy długości fali λ=700nm pomiary przerwaliśmy.

Poniżej znajduje się tabela naszych pomiarów:

Nr	Długość fali	pH=2,6	pH=3,8	pH=7,4
1	400	0,192	0,236	0,067
2	420	0,238	0,261	0,028
3	440	0,251	0,27	0,028
4	460	0,22	0,253	0,046
5	480	0,16	0,211	0,073
6	500	0,116	0,185	0,116
7	520	0,078	0,177	0,186
8	540	0,068	0,2	0,299
9	560	0,062	0,338	0,425
10	580	0,066	0,287	0,632
11	600	0,06	0,287	0,623
12	620	0,044	0,112	0,19
13	640	0,035	0,051	0,048
14	660	0,027	0,044	0,037
15	680	0,029	0,042	0,024
16	700	0,028	0,038	0,025

Opracowanie wyników:

Sporządź wykresy zależności absorbancji A (oś y) od długości fali λ (oś x) dla roztworów błękitu bromofenolowego o trzech różnych wartościach pH (dane zebrane w punkcie 6).

WYKRES ZALEŻNOSCI ABSORBANCJI OD DŁUGOŚCI FALI

Metodą graficzną wyznacz punkt izozbestyczny błękitu bromofenolowego, oraz maksima absorpcji dla jego formy kwasowej i zasadowej.

Punkt izobestyczny znajduje się w wartości λ równej ok. 505nm.
Maksimum absorpcji dla formy kwasowej znajduje sie w punkcie 440nm, a dla formy zasadowej w punkcie 580nm.

Ćwiczenie 3: Wpływ stopnia utlenienia na własności spektralne związków
chemicznych.

Celem ćwiczenia jest pokazanie na przykładzie cytochromu c, że właściwości spektralne związków chemicznych zależą od ich stopnia utlenieni.

Potrzebne materiały:

Spektrofotometr
Kuwety
Pipety automatyczne
Końcówki do pipet
Probówki szklane
Roztwór cytochromu c 0,4 mg/ml
0,1 M bufor fosforanowy pH 7,0
5 mM roztwór K3[Fe(CN)6]
10 mM roztwór kwasu askorbinowego

Wykonanie:

Przygotowaliśmy w trzech szklanych probówkach zgodnie z instrukcją roztwory o następującym składzie:

1 probówka: 1 ml buforu fosforanowego (0.1 M, pH=7), 1ml roztworu cytochromu c (C=0.4 mg/ml), 0.1ml wody dejonizowanej.

2 probówka: 1 ml buforu fosforanowego (0.1 M, pH=7), 1 ml roztworu cytochromu c (C=0.4 mg/ml), 0.1 ml K3[Fe(CN)6], (5mM).

3 probówka: 1 ml buforu fosforanowego (0.1 M, pH=7), 1 ml roztworu cytochromu c, 0.1ml roztworu kwasu askorbinowego, (10mM).

Następnie obserwowaliśmy zmianę zabarwienia roztworów

1 probówka – kolor cielisty

2 probówka – kolor żółty

3 probówka – kolor jasnoróżowy

Przygotowaliśmy 4 kuwety. Pierwszą napełniliśmy wodą, a pozostałe wypełniliśmy roztworami cytochromu z poszczególnych probówek.
Ustawiliśmy spektrometr na zakres długość fal λ=390-610nm i wykonaliśmy tzw. „próbę ślepą” umieszczając w kuwecie wodę dejonizowaną. Następnie zmierzyliśmy i zanotowaliśmy absorbancję kuwet nr 2, 3 i 4.

Długość fali	Probówka I	Probówka II	Probówka III
390	0,812	0,646	0,449
395	1,008	0,815	0,6
400	1,286	1,076	0,838
405	1,53	1,316	1,181
410	1,55	1,339	1,598
415	1,249	1,041	1,698
420	0,969	0,76	1,346
425	0,731	0,523	0,81
430	0,559	0,364	0,417
435	0,45	0,288	0,24
440	0,361	0,239	0,137
445	0,298	0,213	0,085
450	0,255	0,195	0,065
455	0,201	0,167	0,051
460	0,167	0,146	0,048
465	0,139	0,13	0,047
470	0,121	0,116	0,049
475	0,109	0,107	0,048
480	0,101	0,1	0,046
485	0,095	0,094	0,045
490	0,09	0,092	0,047
495	0,088	0,09	0,055
500	0,089	0,091	0,076
505	0,092	0,095	0,106
510	0,102	0,105	0,146
515	0,119	0,122	0,182
520	0,137	0,139	0,21
525	0,148	0,148	0,156
530	0,151	0,151	0,121
535	0,147	0,146	0,107
540	0,136	0,136	0,133
545	0,122	0,126	0,234
550	0,111	0,117	0,35
555	0,102	0,105	0,153
560	0,097	0,096	0,059
565	0,086	0,085	0,029
570	0,07	0,071	0,02
575	0,057	0,057	0,017
580	0,048	0,047	0,015
585	0,041	0,04	0,014
590	0,035	0,034	0,012
595	0,03	0,031	0,012
600	0,028	0,03	0,011
605	0,024	0,025	0,012
610	0,022	0,023	0,011

Opracowanie wyników:

Na podstawie sporządzonych widm absorpcji wyznacz maksima absorpcji dla formy utlenionej i zredukowanej cytochromu c.

Maksima absorbancji dla próbówki 1 (roztwór cytochromu z wodą dejonizowaną):

Absorbancja - 1.550 przy długości fali 410nm
Absorbancja – 0.151 przy długości fali 530nm

Maksima absorbancji dla probówki 2 (forma utleniona cytochromu c):

Absorbancja – 1.339 przy długości fali 410nm
Absorbancja – 0.151 przy długości fali 530nm

Maksima absorbancji dla probówki 3 (forma zredukowana cytochromu c):

Absorbancja – 1.698 przy długości fali 415nm
Absorbancja – 0.210 przy długości fali 520nm
Absorbancja – 0.350 przy długości fali 550nm

Porównaj wszystkie 3 uzyskane widma absorpcyjnej i zastanów się, czy przygotowany wyjściowy roztwór cytochromu c w większym stopniu składa się z formy utlenionej, czy zredukowanej

Widmo absorpcyjne probówki 3, roztwór z kwasem - formą zredukowaną cytochromu c ma najmniejszą absorbancję. Natomiast widmo absorpcyjne– kuwety z roztworem K3[Fe(CN)6] – formą utlenioną cytochromu c ma większą absorbancję. Widmo absorpcyjne probówki 1 – z wodą dejonizowaną jest wyraźnie zbliżone do widma formy utlenionej cytochromu c, czyli roztworu z probówki 2. Dla tych samych długości fali (tj. 485nm, 525nm ) roztwór cytochromu c z wodą dejonizowaną ma takie same bądź bardzo zbliżone wartości absorbcji do roztworu z formą utlenioną. Dla długości fali 525nm forma utleniona ma absorbcję równą 0.148 a roztwór wyjściowy również 0.148, natomiast dla 485nm absorbcja formy utlenionej wynosi 0,094, a roztworu wyjściowego 0,095.

Przygotowany roztwór wyjściowy cytochromu c w większym stopniu składa się z formy utlenionej.

Wyszukiwarka