Biofizyka- wykład 2: BIOFIZYCZNA ANALIZA BIAŁEK
1.Dlaczego oczyszczamy białka?
-Oczyszczone białka są niezbędne do badania funkcji enzymów
-oczyszczone białka są wykorzystywane do strukturalnej analizy (krystalografia, NMR, spektroskopia)
-oczyszczone białka wykorzystywane są w sekwencjonowaniu
-w celu zrozumienia ich struktury i funkcji
2.etapy w oczyszczeniu białek:
-opracowanie metody
-wybranie źródła białka
-otrzymanie ekstraktu tkanki: rozbicie komórek, wewnątrzkomórkowe frakcjonowanie
-frakcjonowanie białek (kilka etapów)
-ocena czystości
3.metoda wirowania:
Cząsteczki poruszają się po okręgu o promieniu r, z prędkością kątową ωr ²
Cząsteczki podczas wirowania ulęgają osadzaniu (sedymentacji). Współczynnik sedymentacji s+ v/r², v- szybkość sedymentacji.
4. co to jest chromatografia?
Chromatografia jest techniką wykorzystywaną podczas rozdzielania mieszanin biologicznych w wyniku różnic własności poszczególnych jej składników. Rozdział następuje w dwóch rożnych fazach: mobilnej i stacjonarnej
Chromatografia kolumnowa- rysunek, wyklad nr 2
Chromatografia jonowymienna- rysunek, wyklad nr 2
Wymiana jonowa: chromatografia kationowa. Dodatnio naładowane białka wiążą się do ujemnie naładowanego złoża. Ujemnie naładowane białka są wymywane.
5 chromatografia powinowactwa:
-wiąże specyficznie
-ligandy
-stężenie soli
-do złoża przyczepiony ligand
6. filtracja żelowa:
-wielkość białek
-brak wpływu soli
-ziarna polimeru- brak ładunku
Za pomocą filtracji żelowej możemy określić masę cząsteczkową. Mechanizmem rozdziału cząsteczek w filtracji żelowej zależy od wielkości cząsteczek w roztworze. Małe cząsteczki są zdolne wnikać w większe ilości por, dlatego pozostają dłużej w złożu niż duże.
7. co wpływa na wzrost rozdzielczości?
-wzrost długości kolumny
-zmniejszenie średnicy kolumny
-zmniejszenie szybkości wypływu
-kolumna musi być zapakowana jednolicie
-używamy jednolitej stacjonarnej fazy
-zmniejszyć wielkość próby
-użyć prawidłowej fazy stacjonarnej
-użyć prawidłowej fazy ruchomej
-użyć odpowiedniego ciśnienia
-użyć odpowiedniego gradientu do Lucji
8. elektroforeza żelowa:
-użycie elektryczności
-żel poliakrylamidowy (polymer)
-zasadą jest migracja białek w zależności od ładunku w polu elektrycznym
- pI białek
-ładunek, masa, struktura
Cząsteczki obdarzone ładunkiem poruszają się w polu elektrycznym. Szybkość wędrówki (v) białka zależy od natężenia pola elektrycznego (E), od wypadkowego ładunku cząsteczki (z) i współczynnika tarcia (f)
V=Ez/f
Elektroforezę prowadzi się na stałym nośniku (żelowe agarozowe lub poliakryloamidowe)
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z SDS, SDS- denaturowane białka otoczone negatywnym ładunkiem
Używamy standardów mas cząsteczkowych w celu identyfikacji białka.
Wizualizacja białek po rozdziale elektroforetycznym:
-barwienie
-odbarwianie roztworze kwasu octowego
-białka mniejsze i z większym ładunkiem poruszają się szybciej
9. ogniskowanie izoelektryczne:
-określa wartość pI białek
-roztwór amfolitu
-białka rozdzielane są w gradiencie pH zgodnie z ich pI
-pI białek zależy od – R-grup
10. elektroforeza kierunkowa:
Rysunek wykład 2