Wykład XV

Inżynieria genetyczna

Inżynieria genetyczna

0. Pod tym pojęciem rozumie się zabiegi prowadzące do powstania nowych, dziedzicznych właściwości organizmu.

0. Polegają na wprowadzeniu do komórek biorcy ściśle określonych fragmentów DNA (heterologicznych = obcych) w celu wywołania trwałej zmiany w cechach biorcy.

1. W tym celu inżynieria genetyczna stosuje rekombinacje i klonowanie, a które znalazły wiele zastosowań praktycznych w biologii i medycynie i często zabiegi te określa się również jako biotechnologia.

0. Rozwój genetyki molekularnej oraz inżynierii genetycznej spowodował, że bariery powstałe w wyniku milionów lat ewolucji, uniemożliwiające swobodne krzyżowanie się pomiędzy gatunkami zostały przełamane.

1. Stało się możliwe przenoszenie genów z organizmów eukariotycznych do prokariotycznych, ze zwierząt do roślin, od człowieka do bakterii, itd.

KLONOWANIE DNA

0. W klasycznym ujęciu klon rozumiemy jako potomstwo 1 komórki z podziału mitotycznego, ale w inżynierii genetycznej i biotechnologii znaczy również populacje identycznych odcinków DNA, czyli powielone fragmenty DNA.

1. Klonowanie DNA może odbywać się na dwóch poziomach:

2. - in vivo

3. - in vitro

Klonowanie DNA in vivo

0. polega na wprowadzeniu wybranego odcinka DNA do szybko dzielących się komórek, aby jednak nie uległo ono lizie konstruuje się wektory („czysty DNA” zostałby rozłożony w komórce biorcy).

Nośnikiem transgenu mogą być cząsteczki DNA lub RNA bakteriofagów lub DNA plazmidowy.

0. WEKTORY – DNA plazmidów lub DNA i RNA wirusów + DNA heterologiczmny. Bakteriofagi jak i plazmidy mają właściwość osłabiania ściany
   i błony komórkowej w celu uczynienia jej przepuszczalnej dla cząstek DNA bakteriofagowego i plazmidowego.

Wektor

wektory

0. -wektory bakteryjne – plazmidowe, klonowanie fragmentów do 10 kpz

1. -wektory wirusowe: DNA fagów (najczęściej są to fagi lambda – bardzo wydajne gdyż można pakować w nie duże odcinki DNA, do 18 - 25 kpz); retrowirusy –RTV; adenowirusy – ADV

2. - kosmidy: plazmid bakteryjny + sekwencja cos faga lambda (35-45 kpz)

0. WEKTORY ADENOWIRUSOWE – ADV infekują szeroki zakres komórek, w tym także komórki nie dzielące się; nie integrują się z genomem gospodarza; uzyskuje się wysoki poziom ekspresji wprowadzanego genu, ale krótkotrwały.

1. WEKTORY RETROWIRUSOWE – RTV wbudowują się w genom, stąd uzyskujemy długotrwałą ekspresję transgenu, jednak integracja z genomem może być przypadkowa, co wiąże się z możliwością mutacji inercyjnych; wektory RTV można wprowadzać tylko do komórek dzielących się (błona jądrowa uniemożliwia integrację).

FAGI LAMBDA

0. – to najczęściej stosowane w inżynierii genetycznej fagowe wektory. W całości fag ten nie nadaje się na wektor gdyż posiada zbyt wiele miejsc restrykcyjnych, dlatego też wycina się ok. 30% jego genomu, natomiast pozostawia się sekwencje cos.

1. Fagi lambda posiadają cząsteczki DNA o długości ok. 50 kpz, zawierają ok. 40 genów w cząsteczce, budowa cząsteczki – liniowa, na końcach sekwencje cos – 12-sto nukleotydowe, jednoniciowe, lepkie końce wzajemnie komplementarne – dlatego u bakterii fagi te stają się koliste. Właściwości te wykorzystuje się przy konstrukcji tzw. kosmidów.

Prawidłowo skonstruowany wektor powinien posiadać:

0. Sekwencje odpowiedzialne za inicjację replikacji (tzw. ori)

1. Markery – geny odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe (np. oporność na antybiotyk, zdolność syntezy określonego enzymu, zdolność świecenia w odpowiednich warunkach) – geny te nazywamy też genami reporterowymi

2. Polilinkery - odcinki DNA zawierające sekwencje rozpoznawane przez różne rodzaje restryktaz, co pozwala na łączenie z wektorem fragmentów DNA strawionego różnymi enzymami

Konstrukcja wektorów

0. Konieczne narzędzie to enzymy restrykcyjne = endonukleazy restrykcyjne = restryktazy → pozwalają wyizolować pożądany fragment DNA;

1. restryktazy przecinają cząsteczkę DNA w obrębie rozpoznanej sekwencji

2. powstają zawsze te same ilości określonych fragmentów z danego genu;

3. w wyniku cięcia powstają lepkie końce (1-no niciowe), które ligaza łączy komplementarnie do siebie.

Konstrukcja wektorów

0. Powielanie (amplifikacja) DNA w żywych komórkach czyli klonowanie in vivo - wymaga czasu, musimy uzyskać wiele pokoleń komórek, aby osiągnąć pożądaną ilość kopii DNA.

KLONOWANIE DNA IN VITRO

0. Jest wydajniejszą metodą, która daje możliwość uzyskanie licznych kopii DNA w krótkim czasie w warunkach in vitro – w probówce.

1. Metoda ta to łańcuchowa reakcja polimerazy PCR (Polymerase Chaim Reaction)

2. opracowana w 1986 roku przez Kary Mullisa, USA (Nagroda Nobla – 1993).

Łańcuchowa reakcja polimerazy oparta jest na cyklicznych zmianach temperatury.

0. PCR przeprowadza się w specjalnie skonstruowanych aparatach, tzw. termocyklerach.

1. Jest to urządzenie,

2. które umożliwia szybką

zmianę temperatur mieszaniny reakcyjnej.

ETAPY AMPLIFIKACJI DNA
in vitro czyli PCR

0. 1. Izolacja DNA

1. 2. Oczyszczanie DNA

2. 3. PCR:

3. -denaturacja DNA: wstępna i właściwa

4. -przyłączanie starterów

5. -elongacja i elongacja końcowa

6. 4. Analiza produktu PCR

PCR

KLONOWANIE CAŁYCH ORGANIZMÓW

0. polega na wytworzeniu kopii całego organizmu wielokomórkowego na podstawie materiału genetycznego znajdującego się w DNA pojedynczej komórki somatycznej.

1. Jądro komórki somatycznej wprowadza się do komórki, która wcześniej została pozbawiona własnego jądra komórkowego, z niej rozwija się zarodek, a z niego dojrzały organizm.

0. W 1996 roku po raz pierwszy w historii udało się sklonować ssaka- owcę, którą nazwano Dolly. Do dziś stworzono klony wielu innych gatunków ssaków, m. in. myszy, świń i krów.

Nie miała ojca, ale za to aż trzy matki.

0. Jedna dała materiał genetyczny, druga - komórkę jajową (a dokładniej - samą cytoplazmę bez jądra), trzecia nosiła Dolly w macicy, jako tzw. matka zastepcza.

1. "Główna matka", dawczyni materiału genetycznego (uzyskanego z wymienia) w chwili urodzenia się Dolly od dawna już nie żyła.
   
   Imię zawdzięcza Dolly Parton,

amerykańskiej piosenkarce o

obfitym biuście.

Jak sklonowano owcę Dolly?

DOLLY STARA OD URODZENIA - 1999 rok

0. dokładne badania wykazały, że komórki Dolly są starsze niż ona sama – o całe sześć lat! Dlaczego?

1. Wiek komórki wyznaczają telomery

2. Pierwowzór Dolly, owca rasy Finn Dorset miała 6 lat w momencie, kiedy pobierano od niej komórkę do sklonowania.

3. To właśnie dlatego Dolly w momencie urodzenia miała sześć lat.

DOLLY – WIERNA KOPIA MATKI? (1999 rok)

0. W jądrze komórki znajduje się ok. 99,9% informacji genetycznej, pozostałe 0,1% znajduje się w mitochondriach.

1. Jaką informację genetyczną i od kogo zawierały komórki Dolly?

2. OWCA 1 – rasy Finn Dorset – dawczyni jądra komórkowego komórki somatycznej (wymienia),

3. OWCA 2 – owca rasy Scottish Blackface- dawczyni komórki jajowej, to jej mitochondria znaleziono w komórkach Dolly

CELE KLONOWANIA ZWIERZAT
→

0. REPRODUKCJA (głównie powielanie zwierząt transgenicznych)
   oraz jako źródło KOMÓREK MACIERZYSTYCH

Embrionalne komórki macierzyste (potencjalnie mogą przekształcać się w każdy rodzaj komórek)

0. w ten sposób będzie można w przyszłości leczyć wiele nieuleczalnych dzisiaj schorzeń, jak choroba Alzheimera, Parkinsona, cukrzycę, czy uszkodzenia rdzenia kręgowego.

1. Przeciwnicy podkreślają problemy etyczne jakie wiążą się z tymi badaniami.

Istnieje potencjalna możliwość odtworzenia przedstawicieli gatunków zagrożonych wymarciem lub wymarłych metodą klonowania i ich reintrodukcja do środowiska naturalnego

Czternaście sklonowanych świń
Sklonowane dzikie koty mają 'zwykłe' potomstwo

0. Snuppy - pierwszy sklonowany pies - 04.08.2005

1. Sklonowano konia wyścigowego- 16.04.2005

2. Mięso i mleko ze sklonowanej krowy jest bezpieczne - 12.04.2005

3. Klonowanie ludzkich embrionów - 09.02.2005

4. Po raz pierwszy sklonowano owady - 05.11.2004

5. Coraz bliżej sklonowania naczelnych- 25.10.2004

6. Klonowanie mamuta-przywracanie gat. wymarłych

GMO

0. ORGANIZMY MODYFIKOWANE GENETYCZNIE

Organizmy zmodyfikowane genetycznie (inaczej organizmy transgeniczne)

0. to rośliny, zwierzęta i drobnoustroje których geny zostały celowo zmienione przez człowieka.

1. GMO - ORGANIZMY
   DO GENOMU, KTÓRYCH WPROWADZONO NOWY, HETEROLOGICZNY GEN, PRZEKAZYWANY NASTĘPNYM POKOLENIOM, ZGODNIE Z PRAWAMI GENETYKI.
   
   
   

Organizmy zmodyfikowane genetycznie (GMO)

0. *zawierają wstawione obce geny mogące pochodzić od nawet znacznie odległych ewolucyjnie gatunków,

1. *w naturze geny te nie miałyby możliwości wniknięcia do genomu rośliny.

2. *Ogólniej, GMO to organizmy poddane inżynierii genetycznej, w wyniku której nastąpiły u nich takie zmiany w genomie, jakie nie zdarzyłyby się w wyniku rozmnażania czy rekombinacji.

Dotychczas uzyskano bardzo wiele zmienionych genetycznie roślin, które mogą służyć do produkcji żywności -

0. są to m.in. żyto, ziemniaki, buraki cukrowe, kukurydza, pomidory, soja, dynia, papryka, winogrona i banany,

1. Najwięksi producenci GMO: USA, Kanadza, Argentyna, Brazylia, Chile, Australia i Meksyk.

GMO to nie tylko owoce czy warzywa -

0. organizmy transgeniczne lub wytwarzane przez nie substancje mogą stanowić także surowce do produkcji dodatków bądź składników żywności (maltodekstryna, lecytyna, skrobia).

1. Modyfikowane rośliny mogą być także wykorzystywane jako pasza lub jej składnik w karmieniu trzody chlewnej czy drobiu.

0. MODYFIKACJA GENOMU ROŚLIN W CELU UZYSKANIA NOWYCH KORZYSTNYCH CECH:

0. - tolerancja na herbicydy

1. - odporność na choroby wirusowe

2. - oporność na owady szkodniki

3. - oporność na zakażenia grzybicze

4. - jakość produktu

GMO

0. podwyższenie trwałości przechowywanych

1. podwyższenie tolerancji na zimno i zamarzanie,

2. zmiana spektrum lipidów pod kątem nasycenia kw. tłuszczowych,

3. zmiana proporcji cukru do skrobi w różnych tk. roślinnych,

4. zmiany w składzie aminokwasów

0. Podwyższenie plonów

1. Zmniejszenie zanieczyszczenia środowiska (herbicydami, środkami ochrony roślin)

2. Podniesienie jakości produktów

3. Spadek cen produktów spożywczych

4. Tanie źródło białek wykorzystywanych w medycynie

Metodyka transgenizacji komórek roślinnych

0. Zastosowanie maja dwie metody:

0. ·bezpośrednie wprowadzenie DNA do protoplastów przez wstrzeliwanie

0. ·transformację za pośrednictwem wektorów plazmidowych

TRANSGENIZACJA BEZPOŚREDNIA

0. 1. WSTRZELIWANIE DNA

1. wykorzystuje się w niej efekt balistyczny przez zastosowanie specjalnych działek, zwanych strzelbą genetyczną, albo armatką genetyczną.

2. DNA przeznaczony do przeniesienia opłaszcza się na mechanicznych nośnikach z metali szlachetnych i „wstrzeliwuje” do komórek przeznaczonych do transformacji

Transformacja za pośrednictwem wektorów plazmidowych Agrobacterium

0. Do ich konstrukcji wykorzystuje się duże plazmidy (Ti i Ri) bakterii z rodzaju

1. Rhizobium i

2. Agrobacterium (A. tumefaciens i A. rhizogenes),

3. które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin.

4. Plazmidy te zawierają zakodowaną informację o białkach niezbędnych do zaatakowania rośliny.

Odporność na choroby powodowane przez grzyby i bakterie

0. Odporność na grzybice i choroby bakteryjne uzyskuje się poprzez wprowadzenie transgenu kodującego enzymy - hitynaza, glukanaza,

1. które niszczą ich ścianę komórkową.

2. Inny transformowany gen, koduje osmotynę - białko wiążące się z błoną komórkową powodując jej zniszczenie.

ROŚLINY OPORNE NA OWADY

0. CECHY TE OSIĄGNIĘTO POPRZEZ:

1. - WPROWADZENIE GENU KODUJĄCEGO INHIBITOR PROTEAZ SERYNOWYCH

2. - WPROWADZENIE GENU KODUJĄCEGO TOKSYNĘ BACILLUS THURINGIENSIS

 
 
 
 
 

0. Rośliny transgeniczne

1. Zagrożenia:

0. -wbudowanie transgenów do bakterii przewodu pokarmowego ----- oporność na antybiotyki

0. -przekazanie genu oporności na herbicydy innym roślinom ---- katastrofa ekologiczna

0. -zmiana właściwości rośliny transgenicznej poprzez przypadkowe wbudowanie transgenu, który uaktywni inne geny lub je zinaktywuje

1. Rośliny transgeniczne są b. dobrze przebadane, lepiej niż nowe gatunki i odmiany nietransgeniczne

wprowadzane na

rynek

Żywność GMO nie jest niezdrowa

0. „Według dzisiejszej wiedzy, żywność zawierająca organizmy genetycznie zmodyfikowane nie jest dla zdrowia szkodliwa, ale oczywiście wybór należy do konsumenta”

GMO-zwierzęta

0. Pierwsze doniesienie o udanej próbie transgenizacji pojawiło się w 1980r.

1. Była to mysz z genem wzrostu szczura, i do tej pory służy jako przykład doświadczenia modelowego.

2. Transgenizacja myszy była przeprowadzona metodą

mikroiniekcji do przedjądrzy.

Transgenizacja zwierzat hodowlanych

0. ma na celu głównie uzyskanie zwierząt o pożądanych cechach w hodowli:

1. szybciej rosnące (zwiększenie masy ciała),

2. o wyższej wydajności mlecznej,

3. poprawa zdrowotności przez wprowadzenie genów odporności lub tolerancji na określone choroby

4. zastosowaniu ich do produkcji białek, enzymów, innych substancji wykorzystanych w przemyśle farmaceutycznym (jako bioreaktory).

Uzyskanie szybszego wzrostu zwierząt hodowlanych.

0. 
   Modyfikacje polegające na wprowadzeniu genów produkujących hormon wzrostu.
   W ten sposób modyfikowane były głównie ryby: karpie, łososie, ale także

zwierzęta gospodarskie,

świnie, króliki, owce.

Produkcja białek heterologicznych o znaczeniu terapeutycznym dla człowieka w gruczole mlecznym zwierząt transgenicznych

0. Modyfikowane w tym celu są głównie krowy, kozy, owce, gdyż pożądane białka wytwarzane są w gruczołach mlecznych i wydzielane z mlekiem.

1. Produkowana jest antytrombina - ludzki enzym - czynnik krzepliwości krwi, pozwala na kontrolę powstawania zakrzepów,

2. produkcja antytrypsyny - stosowanej w leczeniu rozedmy płuc, erytropoetyny - leczenie anemii.
   
   
   

Zwierzęta transgeniczne w produkcji związków leczniczych

0. 
   Króliki wykorzystywane są m.in. do produkcji związków takich jak: interleukina, czynnik IGF1, ludzki hormon wzrostu, alfa-glukozydaza, czy białko C biorące udział w krzepnięciu krwi.

1. Z mleka kóz uzyskuje się ludzką antytrombinę.

Zwierzęta transgeniczne
Zagrożenia

0. Możliwość krzyżowania

1. i przekazywania transgenów

2. Potencjalne zaburzenie równowagi ekosystemu i spadek bioróżnorodności

3. Problemy natury etycznej

4. Brak akceptacji społeczeństwa dotyczącej badań na organizmach zwierzęcych

Terapia genowa

0. leczenie polegające na wprowadzeniu obcego genu do komórek.

- Mechanizmy działania wprowadzonego DNA mogą być następujące:

0. zmuszenie komórki do produkcji białka kodowanego przez wprowadzony gen

1. produkcja białek potrzebnych, których w organizmie brakuje lub występują w niedomiarze (np. w defektach metabolicznych, takich jak hemofilia)

2. produkcja białek prowadzących do śmierci komórki (apoptozy) - potencjalne zastosowanie do terapii przeciwnowotworowych

3. hamowanie lub modulację ekspresji genów

Terapia genowa - zespół SCID (ang. Severe Combined Immuno Deficiency) - ciężki złożony niedobór immunologiczny

0. - to choroba dziedziczna, o sposobie dziedziczenia autosomalnym recesywnym spowodowany mutacją w obrębie genów RAG-1 lub RAG-2 (tzw. agammoglobulinemia typu szwajcarskiego) bądź sprzężonym z chromosomem X, w którym dochodzi do nieprawidłowego różnicowania tymocytów i braku limfocytów T i NK.

1. Może także występować jako cecha nabyta, niezwiązana z predyspozycją genetyczną.

2. Charakteryzuje się poważnym upośledzeniem odporności komórkowej i humoralnej z następową podatnością za zakażenia wirusowe, bakteryjne i grzybicze.

3. Choroba nieleczona doprowadza do śmierci przed ukończeniem 1 roku życia.

4. W terapii stosuje się przeszczep szpiku kostnego. Ponadto w kilkunastu przypadkach zadziałała terapia genowa.

W sierpniu 2006 na łamach pisma Science dr Steven A. Rosenberg z amerykańskiego Narodowego Instytutu Raka

0. poinformował o 2 przypadkach czerniaka złośliwego, które ustąpiły w 100% pod wpływem terapii genowej,

1. która polegała na izolacji limf. T od chorych, ich namnożeniu, oraz wprowadzeniu do nich poprzez retrowirus genu umożliwiającego rozpoznanie komórek nowotworowych.

2. Tak modyfikowane limfocyty T były podawane chorym.

3. Pełen efekt leczniczy uzyskano jednak tylko u 2 z 17 pacjentów poddanych temu typowi leczenia[4]

Terapia genowa