bromelaina EC 3.4.22.32 tj. 3- hydrolaza, 4-proteaza, 2% - proteaza tioiowa, 32-jako 32 enzym oznaczony historycznie

15. Immobilizacia enzymów - zasada, cel zaletv. wariv ■ Im mobilizacja enzymów

Polega na unieruchomieniu go na stałym podłożu, przez co uzyskuje on właściwości fizyczne nośnika. Ze względu na typ immobiłizacji, można wyróżnić:

1. unieruchomienie we wnętrzu nośnika (pułapko wanie),

2. osadzanie na powierzchni nośnika, które może zachodzić na zasadzie oddziaływań niekowalencyjnych lub z utworzeniem wiązań kowalencyjnych.

Korzyści immobiłizacji:

3. zatrzymanie biokataiizatora na nośniku,

4. wyższe stężenie biokataiizatora,

5. możliwość kontroli mikrośrodowiska,

6. wyższa stabilność struktury białka, a przez to wyższa odporność na warunki środowiska.

7. możliwość wielokrotnego użycia biokataiizatora, łatwość oddzielania go od mieszaniny reakcyjnej po zakończeniu procesu,

8. ograniczenie inhibicji enzymu. Ograniczenie wynikające z immobiłizacji:

9. utrata aktywności enzymu,

10. możliwe utrudnienie w dopływie substratu i odpływie produktu,

11. ograniczony czas życia układu w wyniku obniżenia aktywności biokataiizatora i zmiany (degradacji) złoża, podczas użytkowania,

15. Cele enzymatyczne; modyfikacji składników żywności.

Cele stosowania enzymatycznej modyfikacji żywności:

^s Poprawa wartości odżywczych żywności f ³ Wytwarzanie bioaktywnych peptydów i oligosacharydów z małocennych surowców

12. Wytwarzanie specyficznych enzymów

³ Modyfikacja właściwości Teologicznych i restrukturyzacja żywności ^H Poprawa smaku i zapachu żywności, a także barwy

⁵ Modyfikacja właściwości funkcjonalnych surowców pomocniczych i dodatków do żywności

13. Enzymatyczna degradacja substancji antyżywieniowych ^a Przedłużenie trwałości żywności

17. Enzymatyczna hydroliza białek żywności, iei cele i zastosowanie.
Hydroliza białek

Jedną z najważniejszych form modyfikacji żywności jest przekształcanie białek, a najważniejsze znaczenie ma hydroliza białek. Bezpośrednio wykorzystywana jest do profilowania właściwości białek np. rozpuszczalności, hydrofobowości, zdolności pianotwórczych oraz do produkcji hydrolizatów białkowych. Pośrednio wykorzystywana jest jako wstępny proces przygotowujący białka do dalszej modyfikacji, np. sieciowania. W zależności od stopnia hydrolizy wyróżniamy:

s> Hydrolizę łagodną (limitowaną, ograniczoną), w której stopień hydrolizy osiąga zwykle kilka do kilkunastu procent

* Hydrolizę pełną (głęboką), jaką można uzyskać przy działaniu danego enzymu w optymalnych warunkach

Hydroliza łagodna stosowana jest zwykle w celu:

» Poprawy właściwości funkcjonalnych białek - zwiększenie rozpuszczalności, obniżenie lepkości, zmianę właściwości żelujących, wzrost aktywności powierzchniowej (właściwośi emulgujące i pianotwórcze) * Obniżenia alersenności «> Poprawy smaku i zapachu

Hydroliza łagodna zachodzi głównie pod wpływem endoproteaz działających na powierzchni cząsteczek białka, często odcinających jedynie boczne łańcuchy

Hydroliza pełna stosowana jest do wytwarzania preparatów aminokwasowych i hydrolizatów białkowych.

Hydroliza pełna zachodzi zarówno pod wpływem endoproteaz, jak i egzopeptydaz, przy czym druga grupa ma istotne znaczenie dla usunięcia gorzkości, wynikającej z obecności peptydów hydrofobowych. Metody hydrolizy:

- chemiczna: kwasowa i alkaliczna, - enzymatyczna.

Ponieważ białka są cząsteczkami zawierającymi 'różne ilości grup kwasowych i zasadowych, ich rozpuszczalność zależy od stężenia rozpuszczonej soli, polarności i pH rozpuszczalnika oraz temperatury. Dlatego pewne białka wypadają z roztworu, podczas gdy inne w tych samych warunkach nadal tworzą roztwór koloidalny.

Przez odpowiedni dobór stężenia soli odwadniających można przeprowadzić ich stopniowe wytrącanie np. odwodnienie globulin nastąpi już przy 50% wysyceniu roztworu siarczanem amonu, a albumin dopiero przy całkowity wysyceniu roztworu siarczanem amonu.

Mieszające się z wodą rozpuszczalniki organiczne, takie jak etanol czy aceton, obniżają zdolność działania wody jako rozpuszczalnika, dzięki czemu bardzo dobrze strącają białka.

Mieszane z wodą w różnych proporcjach pozwalają na wybiórcze strącanie białek. Proces ten należy prowadzić w temperaturze 0°C lub poniżej, ponieważ w wyższych temperaturach nastąpi ich denaturacja (nieodwracalne). Otrzymane osady białkowe oddzielone są metodami filtracji lub wirowania. Następnie są rozpuszczane, a w przypadku wykorzystywania procesów wysalania mogą być poddawane dializie. 3. Oczyszczanie

Jako kolejny etap otrzymywania enzymów, szerokie zastosowanie ma obecnie:

14. chromatografia (wymiany jonowej, adsorpcyjna, podziałowa, sączenie molekularne, afinitywna),

15. elektroforeza,

16. ultrawirowanie,

17. krystalizacja.

Wśród metod elektroforetycznych wyróżniamy:

18. elektroforezę bibułową,

19. elektroforezę żelową (w żelu poliakrylamidowym łub agarozowym),

20. elektroforezę swobodną (bez nośnika).

Obecnie najczęściej stosuje się elektroforetyczny rozdział białek zależny tylko od ich masy cząsteczkowej. Polega on na rozdziale białek w żelu poliakrylamidowym z SDS - dodecylosiarczan sodu).

15. Aktywność katalityczna enzymów, jednostki.

Aktywność katalityczną enzymów Opisujemy z zastosowaniem bezwzględnej międzynarodowej jednostki standardowej (U), która została wprowadzona przez Komisję Enzymową Międzynarodowej Unii Biochemicznej w celu umożliwienia porównania aktywności tych samych i różnych enzymów ze sobą. Określono również warunki standardowego testu dla jej oznaczenia. Jednostką U każdego enzymu jest ta jego ilość, która katalizuje przemianę 1 u.mola substratu (lub 1 umola odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30°C i w optymalnych warunkach (zwłaszcza pH i stężenie substratu)

Ze względu na rząd różnic między aktywacją enzymów, stosuje się zwykle przedrostki metryczne, przy określaniu aktywności np. milijednostka, (mU), kilo jednostka (kU) itd. Obecnie Międzynarodowa Unia Biochemiczna IUB zaleca stosowanie nowej jednostki - 1 katal. Odpowiada ona aktywności enzymu, przy której jest on zdolny przekształcić 1 mol substratu w produkt w czasie ls, w temperaturze 30°C i pozostałych warunkach optymalnych. Stąd 1 Kat = 6*10⁷ jednostek międzynarodowych, a jedna jednostka międzynarodowa = 16,67 nKat (nanokatal)

15. Klasyfikacja EC. Jedno z tvch pytań będzie na egzaminie!

Numer EC tworzy kolejno liczby oddzielone kropkami oznaczające:

21. klasę ustaloną według typu reakcji

22. podklasę według typu substratu

23. podpodklasę według centrum aktywnego

24. numer wynikający z kolejności historycznej przypisania do danej grupy. WzorECX.XX.XX.XX

15. Na podstawie zasad klasyfikacji EC oraz znajomości właściwości i budowy enzymów podać, co oznaczają poszczególne liczby w nazwie (ogólnie i w podanych przykładach):

pepsyna EC 3.4.23.1 tj. 3- hydrolaza, 4-proteaza, 23 - proteaza aspartylowa, 1-jako pierwszy enzym oznaczony historycznie

chymotrypsyna EC 3,4.21.1 tj. 3- hydrolaza, 4-proteaza, 21 - proteaza serynowa, 1-jako pierwszy enzym oznaczony historycznie

trypsyna EC 3.4.21.4 tj. 3- hydrolaza, 4-proteaza, 21 - proteaza serynowa, 4-jako czwarty enzym oznaczony historycznie

papaina EC 3.4.22.2 tj. 3- hydrolaza, 4-proteaza, 22 - proteaza cysternowa (tioiowa), 2-jako drugi enzym oznaczony historycznie

katepsyna D EC 3.4.23.5 tj. 3- hydrolaza, 4-proteaza, 23 - proteaza aspartylowa, 5-jako piąty enzym oznaczony historycznie

18. Enzymatyczna hydroliza białek łagodna - zasada, cel, zastosowanie.

Hydroliza łagodna (limitowana, ograniczona), w której stopień hydrolizy osiąga zwykle kilka do kilkunastu procent

Hydroliza łagodna stosowana jest zwykłe w celu:

25. Poprawy właściwości funkcjonalnych białek - zwiększenie rozpuszczalności, obniżenie lepkości, zmianę właściwości żelujących, wzrost aktywności powierzchniowej (właściwośi emulgujące i pianotwórcze)

® Obniżenia alergenności

26. Poprawy smaku i zapachu

Hydroliza łagodna zachodzi głównie pod wpływem endoproteaz działających na powierzchni cząsteczek białka, często odcinających jedynie boczne łańcuchy

Hydroliza pełna (głęboka), jaką można uzyskać przy- działaniu danego enzymu w optymalnych warunkach Hydroliza pełna stosowana jest do wytwarzania preparatów aminokwasowych i hydrolizatów białkowych. Hydroliza pełna zachodzi zarówno pod wpływem endoproteaz, jak i egzopeptydaz, przy czym druga grupa ma istotne znaczenie dla usunięcia gorzkości. wynikającej z obecności peptydów hydrofobowych.

20. Podział enzymów proteolitycznych (pod względem mechanizmu działania, centrum aktywnego itd.) -podać przykłady.

a. Podział ze względu na pochodzenie, enzymy proteolityczne dzielimy na:

27. enzymy pochodzenia zwierzęcego np. pepsyna, trypsyna, chymotrypsyna, katepsyny

28. enzymy pochodzenia roślinnego np. papaina, bromelaina, ficyna

29. enzymy pochodzenia mikrobiologicznego np. Alkalaza, Neutraza, Protamex

b. ze względu na środowisko działania:

30. kwaśne np. pepsyna - optymalne pH około 2 - (proteazy karboksylowe - kwaśne -aktywacja uwarunkowana niezdysocjowaną grupą karboksylową) np.katepsyny - pH około 5-6 (proteazy cysternowe)

31. zasadowe np. trypsyna - optymalne pH około 8 - (proteazy serynowe - alkaliczne)

np. chymotrypsyna ~ pH około 8 -

np. kapaliny - opt. pH 6,5 - 8 (obojętne proteinazy aktywowane są wapniem)

c, ze względu na mechanizm działania

32. endoprotezy (endopeptydazy) = proteinazy - hydrolizują wiązania peptydowe wewnątrz cząsteczki białka

33. egzopeptydazy - enzymy odszczepiające końcowe aminokwasy

34. aminopeptydazy

35. karboksypeptydazy

36. di peptydazy

37. peptydylo-peptydazy

38. tripeptydylo-peptydazy

39. peptydylo-dipeprydazy Endopeptydazy: białko, peptyd - powstaje ołigopeptydy

® Proteinazy trawienne: Pepsyna pH = i - 2 Podpuszczka pH = 4 Trypsyna pH = 7,9 Chymotrypsyna pH = 8

® Proteinazy wewnątrzkomórkowe: Zwierzęce hydrol azy

Roślinne - papaina, bromelta, ficyna, kwaśne proteinazy karboksylowe 'Egzopeptydazy:

■-> Aminopeptydazy - działają na N - koniec łańcucha peptydowego, wymagają dodatniego ładunku grupy aminowej

peptyd, ołigopeptydy - powstają aminokwasy N-końcowe + peptyd © Karboksypeptydazy - działają na C - koniec łańcucha peptydowego i wymagają ujemnego ładunku grupy karboksylowej

peptyd, ołigopeptydy-powstają aminokwasy C - końcowe + peptyd

karboksypeptydazy ze względu na centrum aktywne dzielą się na: - karboksypeptydazy serynowe (katepsyna A)

-metalokarboksypeptydazy - karboksypeptydazy cysteinowe (katepsyny B2) » Dipeprydazy-hydrolizują dipeptydy do wolnych aminokwasów

di peptyd-powstają wolne aminokwasy ^s (di)Peptydylo-peptydazy- odszczepiają di peptydy z N - końca łańcucha peptydowego

peptyd, ołigopeptydy -powstaje di peptyd z N - końca + peptyd • Tripeptydylo-peptydazy - odszczepiają tri peptydy z N - końca łańcucha peptydowego

Peptyd, ołigopeptydy- powstaje tri peptyd'z N'— końca + peptyd © Peptydylo-dipepfydazy - - odszczepiają dipeptydy z C - końca łańcucha peptydowego ^ Peptyd, ołigopeptydy- powstaje dipeptydz C - końca + peptyd Najważniejsze egzopeptydazy:

40. aminopeptydazy — leucyłoaminopeptydaza, akrylaminaza

41. karboksypeptydazy - katepsyna A, katepsyna B₂

42. di peptydazy (czyli dipeptydylo-peptydazy) - katepsyna C

Podział ze względu na resztę aminokwasu w centrum aktywnym, endoproteazy dzielą się na:

• Proteinazy serynowe - w centrum aktywne Ser, His i Asp, np. trypsyna, chymonypsyna, elastaza, niektóre proteazy z lizosomów zwierzęcych i roślinnych oraz niektóre bakteryjne

* Proteinazy cysteinowe (tiolowe) - w centrum aktywnym Cys i His. Należą tu enzymy lizosomalne (katepsyny B, L, H, S) oraz cytozołowe (kałpainy), papaina, ficyna. bromelaina

» Proteinazy aspartylowe (karboksylowe, kwasowe) - centrum aktywnym Asp, działają tylko w pH

poniżej 5 np. katepsyna D, pepsyna, chymozyna 9 Metaloproteinazy - w centrum aktywnym jon metalu dwuwartościowego, najczęściej Zn²⁺, rzadziej

Mn²⁺, Co"⁺.,np. termolizyna. Większość metaioproteina to jednak egzopeptydazy.

21. Enzymy proteolityczne - opisać np. pepsynę, trypsyne i chvmotrvpsyne (różnica miedzy nimi), preparaty pochodzenia mikrobiologicznego (zwrócić uwagę np. na to, które działają jako endoproteazy. które powodują powstawanie goryczki, a które nie itć.) Enzymy pochodzenia zwierzęcego:

PEPSYNA- pH 1-2, aktywowana przez jony H" kwasu solnego (aktywacja z pepsynogenu przez odszczepaenie fragmentu zasłaniającego centrum aktywne). Wchodzi w skład soku żołądkowego, endoproteaza aspartylowa. Hydrolizuje wiązania peptydowe w sąsiedztwie aminokwasów aromatycznych ieucyny i kwasu glutaminowego. W przemyśle spożywczym pepsyna wieprzowa i wolowa zastępuje reninę przy produkcji serów. Pepsynę otrzymuje się z błony śluzowej żołądka świń lub bydła. W celu osiągnięcia jej stabilizacji przechowuje sieją czasami w nasyconym roztworze siarczanu... RENNINA (PODPUSZCZKA) - pH 5,5 - 7,0, w obecności jonów wapnia, endoproteinaza aspartylowa. Występuje w żołądku młodych ssaków. Przekształca kazeinę w parakazeinian wapnia - ścina białka mleka, ułatwiając trawienie przez pepsynę. Preferuje rozszczepianie wiązań peptydowych utworzonych przez jedną lub dwie reszty Ieucyny. W technologii żywności utworzone do ścinania mleka „na słodko", hydrolizuje także dalej frakcje kazeinowe w czasie dojrzewania sera, powodując ich częściowe doprowadzenie do stadium peptydów. Podpuszczka cielęca zastępowana jest pepsyną wołową lub wieprzową oraz enzymami pochodzenia mikrobiologicznego. c^flfc*^

TRYPSY NA - pH = 7,9 (aktywacja z irypsynogenu). Składnik soku trzustkowego, endoproteaza serynowa. Hydrolizuje wiązania peptydowe utworzone przez lizynę i argininę we wszystkich białkach. CHYMOTRYPSYNA - pH = 8,0, aktywowana przez trypsyne z chymotrypsynogenu. Składnik soku trzustkowego, endoproteaza serynowa. Atakuje wiązania peptydowe w sąsiedztwie aminokwasów aromatycznych, Ieucyny, metJoniny, aminokwasów hydrofobowych - powoduje powstanie gorzkich peptydów.

KATEPSYNY - pH = 5 - 6, ale różni się w zależności od typu katepsyny. Katepsyny są najbardziej aktywne w środowisku kwasowym, lecz wiele z nich zachowuje dużą aktywność, także przy pH oddalonym od optymalnego o 2 - 3 jednostki. Wiele katepsyn wymaga dla uaktywnienia obecności pewnych substancji redukujących, np. cysteiny, glutationu, siarkowodoru, kwasu askorbinowego. Hydrolizują białka: peptydy w miejscach wiązania aminokwasu przyległego do wolnej grupy a-aminowej (hydrolizuje wiązania peptydowe w cząsteczce białkowej, lecz mogą także rozszczepiać odpowiednio proste peptydy i ich pochodne). Katepsyny są enzymami tkankowymi, głóv/nie endopeptydazami. Występują w łizosomach (tam pH = 3,8 - 4,5, podczas gdy w sarkoplazmie około 7), gdzie przenika białko i jest hydrolizo wane.

Enzymy pochodzenia roślinnego:

Wszystkie 3 endoproteazy - pH około 6-7 (okołoobojętne), Cys w centrum aktywnym

PAPAINA - pH = 5 - 9, opt. 6-7, w zależności od substratu. Endoproteaza cysteinowa, Cys i His w centrum

aktywnym. Preferuje rozszczepianie wiązań peptydowych utworzonych przez aminokwasy zasadowe i

hydrofobowe. Podczas hydrolizy może wchodzić w interakcję z produktami pośrednimi, dlatego niemożliwe jest prognozowanie składu produktów hydrolizy.

Papainę otrzymuje się z zielonych owoców drzewa melonowego - papai (Carica papaya). Papaina służy np. do produkcji odpornych na niskie temperatury gatunków piwa, do produkcji preparatów zmiękczających mięsa, w medycynie.

FICYNA - pH = 4,5 - 8,3, pod względem specyficznej aktywności jest podobna do papainy, też endoproteaza cysternowa z Cys i His w centrum aktywnym. Preferuje rozszczepianie wiązań peptydowych utworzonych przez aminokwasy zasadowe i hydrofobowe. Jednak rozcina inne wiązania w tym samym substracie np. w insulinie. Ficynę otrzymuje się z mlecznego soku pewnych odmian drzew figowych.

BROMELAINA - pH= 6,8. endoproteaza cysteinowa, pcdobna do papainy, glikoproteina. Preferuje rozszczepianie wiązań peptydowych utworzonych przez Arg w przypadku małych cząsteczek lub reszty aminokwasów polarnych w przypadku białek. Uzyskuje się z łodyg i owoców ananasa .jest to kilka proteaz, z których 80 - 90% aktywności enzymatycznej przypada na główną endoproteazę, która determinuje właściwości preparatu.

Enzymy pochodzenia mikrobiologicznego:

Ze względu na łatwość pozyskania, w technologii żywności najczęściej stosuje się preparaty pochodzenia mikrobiologicznego.

Alkalaza- preparat endopeptydazy, produkowanej przez Bacillus licheniformis. Głównym składnikiem jest gliceryna, gdzie rozpuszczalna jest subty lizyna A. Alkalaza jest stosunkowo termooporna, opt. temp to 60°C, przy pH 7,5 - 8. Wraz ze spadkiem pH jej term oporność maleje. Może ona równocześnie atakować 7 różnych typów wiązań, utworzonych zarówno przez reszty aminokwasów hydrofobowych (szczególnie od strony karboksylowej) jak i przez reszty aminokwasów obojętnych łub kwaśnych. Powodują powstanie gorzkich peptydów. dlatego stosuje się ją jako pierwszy etap hydrolizy

Flavourzyme to mieszanka proteazy i peptydazy, otrzymywane za pomocą wybranych szczepów Aspergillus ... . stosuje sieją do intensywnej hydrolizy białek (do 70% DH) i gorzkich hydrolizatów białkowych w celu usunięcia z nich goryczki, w obojętnym lub lekko kwaśnym środowisku. Optymalne pH dla FIavourzyme mieści się w zakresie 5,0-7,0, przy czym dla egzopeptydazy wynosi ok. 7,0. Optymalna temperatura to ok. 50°C, chociaż w temperaturze 30°C i 60°C Flavoukrzyme zachowuje 50-60% pierwotnej aktywności. Ne utraci jest preparatem metaloendoproteaz wytwarzanych przez Bacillus amyio ... .optymalne pH ok. 6,5 przez co zaliczana jest do proteaz obojętnych. Optymalna temperatura hydrolizy wynosi od 45 do 55°C, lecz w praktyce lepiej jest nie przekraczać 50°C. Jest ona mniej odporna na wysokie temperatury. Całkowitą inaktywacje otrzymuje się obniżając pH do 3,0 do 4,0 przy jednoczesnym trzydziestominutowym ogrzewaniu w temperaturze 50°C.

Protamex jest kompleksem proteaz otrzymywanym ze szczepu bakterii Bacillus. Protamex umożliwia otrzymanie bezgoryczkowych hydrolizatów białkowych , stopień hydrolizy nie jest zbyt wysoki. Optymalne warunki hydrolizy pod wpływem enzymu zachodzą przy pK 5,5-7,5, w temperaturze 35-60°C. Dla inaktywaęji enzymu przy pH 4,0 niezbędne jest trzydziestominutowe ogrzewanie w temperaturze 50°C, jeżeli natomiast pH mieszaniny zostanie obniżone poniżej pH 4,0, inakty wacja enzymu zachodzi bez ogrzewania.

22. Enzymatyczne sieciowanie białek, transglutammaza.

Głównym enzymem wykorzystywanym w technologii żywności do sieciowania białek jest tj-ansglutaminai|a (TG). Sieciowanie jest to tworzenie się wiązań kowalencyjnych między różnymi cząsteczkami. Proces sieciowania zachodzi zwykle w dość długim czasie, dlatego konieczne jest zapewnienie warunków uniemożliwiających wzrost bakterii, to znaczy niskiej temperatury lub temperatury na tyle wysokiej by zahamować wzrost bakterii psychrofilnych. Należy przy/ tym uwzględnić właściwości enzymu oraz temperaturę denaturacji białek surowca zw)?iszcza miozyny (miozyna rybna zaczyna denaturować w temperaturze 37-45°C, kończy w 57°C; ryby z wód zimnych nawet niższa, kryl Rodzaje transglutaminazy:

-T Gaza Ca²^ - zależna (5-15 mM CaCl₂), stabilna w 40°C - występuje w tkankach i płynach ustrojowych zwierząt, roślin i mikroorganizmów; to czynnik XIII krzepliwości krwi, najlepszym źródłem jest wątroba świnki morskiej; Pi 4,5.

-T Gaza niezależna od jonów wapnia (pochodzenia mikrobiologicznego) - optymalna aktywność w 50°C, pH 6, stabilna przy pH 5-7; zawiera Cys w centrum aktywnym. Pi 8,9.

Transgłutaminaza (TG) jest acylotransferazą, katalizuje reakcje połączenia reszty aminowej glutaminy w białku

z grupą E-aminową lizyny w białku lub peptydzie.

Wiązania mogą łączyć dwa różne białka lub peptydy, aibo mogą powstać w obrębie jednej cząsteczki. W zależności od ilości powstałych wiązań, w efekcie następują większe lub mniejsze zmiany właściwości Teologicznych surowca. Produktem ubocznym reakcji jest amoniak, który' wykorzystuje się jako wskaźnik procesu sieciowania białek.

Transgiutaminaza na skutek sieciowania układu, powoduje wzrost twardości, gumowatości i zżuwałności. poprawia elastyczność, nie zmienia natomiast sprężystości.

Gdy siatka wytworzona dzięki TG jest luźna, wodochłonność układu wzrasta.

Silne sieciowanie prowadzące do synerezy, powoduje wysychanie układu. TG może być stosowane do teksturowania odkostnionego mięsa ryb (w celu zmniejszenia ubytków podczas obróbki cieplnej), do produkcji zamienników tłuszczowych, jako dodatek do deserów, kremów, jako polepszam do pieczywa, itp

15. Reakcja plasteinowa- zasada, cel, zastosowanie.

Istotne znaczenie w modyfikacji żywności ma reakcja plasteinowania. Wykorzystywana jest na przykład do:

43. wytwarzania peptydów aktywnych biologicznie,

44. usuwania niepożądanych aminokwasów w żywności dietetycznej (obniżenie zawartości fenyloalaniny),

45. wbudowywanie aminokwasów egzogenicznych w białka (na przykład wbudowanie lizyny w gluten),

46. usuwanie gorzkiego smaku z koncentratów białkowych oraz niepożądanych związków zapachowych z surowców białkowych,

47. teksturowanie mięsa odkostnionego mechanicznie.

Białko —* hydroliza( pepsyna) —► oligopeptydy( do 10 AA) —^zagęszczanie oligopeptydów (30-40%), poprzez usunięcie wody —►zmiana pH (zwykle z 4 do 7) —> dodanie enzymu proteolitycznego —> nierozpuszczalny żel PLASTEINA (peptydy wielocząsteczkowe, nierozpuszczalne w 10% TCA, acetonie lub 70% etanolu)

Początkowo sądzono, że plasteliny powstają, głównie a skutek resyntezy - powstają wiązania peptydowe. Obecnie stwierdzono jednak, że następuje wiązanie aminokwasów hydrofobowych w słabe ale liczne połączenia zwane agregatami, które „wyłapują hydrofobowe komórki" aminokwasów. Prawdopodobnie zachodzi transpeptydacja, która formuje nowe wiązania kosztem starych, powoduje przestawienie wiązań, a nie tworzenie nowych.

Jeśli w hydrolizacie białkowym jest dużo aminokwasów hydrofobowych, to bardzo łatwo powstaje plastelina. Jeżeli w hydrolizacie jest dużo aminokwasów niehydrofobowych Ser, Ala, Glu, Asp, to nie powstaje plastelina.

15. Enzymy lipolityczne

Do najczęściej stosowanych enzymów lipołitycznych należą lipazy i fosfolipazy A i D.

Lipazy są szeroko rozpowszecmiione w przyrodzie, występują nasionach i organach wegetatywnych wielu roślin, w niektórych mikroorganizmach oraz w organizmach ludzi i zwierząt (trzustka, wątroba, ściana żołądka i jelit).

Hydrolizują one wiązania estrowe występujące pomiędzy glicerolem i kwasami tłuszczowymi w obrębie różnorodnej grupy lipidów.

Lipazy katalizują hydrolizę nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli (TAG). Reakcja ta zachodzi na

granicy faz, a produktami są kwasy tłuszczowe, diacyloglicerole, monoacyloglicerole oraz glicerol.

Lipazy charakteryzują się większą aktywnością w stosunku do substratów nierozpuszczalnych w wodzie niż do

rozpuszczalnych estrów, co jest cechą odróżniającą lipazy od esteraz.

Triacyloglicerole - diacyloglicerole + kw. tł.

Diacyloglicerole - monoacyloglicerole + kw. tł.

Monoacyloglicerole - glicerol + kw. tł.

Hydroliza TAG jest reakcją odwracalną, kierunek reakcji jest zależny od środowiska, przy czym nadmiar wody wywołuje hydrolizę, natomiast niska zawartość wody wywołuje estryfikację glicerolu - reakcja odwrotna. Szybkość hydrolizy TAG wzrasta z liczbą reszt kw. tł., długością łańcucha oraz stopniem nienasycenia kw. tł. Reakcja katalizowana przez lipazy można prowadzić w rozpuszczalnikach organicznych oraz roztworach buforowych, możliwa jest yytedy kontrola zawartości wody (współczynnik aktywności wodnej).

15. Działanie lipaz w zależności od środowiska

Lipazy katalizują następujące typy reakcji:

48. hydroliza (środowisko wodne, z nadmiarem wody),

49. estryfikacja (środowisko z małym udziałem wody lub środowisko bezwodne),

50. transestryfikacja (wymiana kw. tł. w TAG):

o Acydoliza (grupy acyłowe pochodzą od wolnych kwasów), o Interestryfikacja (wymiana grup acylowych pomiędzy estrami),

o Alkoholiza (reakcja pomiędzy alkoholem i estrem w wyniku której powstaje nowy alkohol i ester). Lipazy roślinne pH ok. 5,0, temp. 35-37°C. Lipazy mikrobiologiczne pH 7,0-9,0, temp. 30-40°C. Lipazy zwierzęce pH 7,0-8,0, temp. 35-37°C.

Najczęściej stosowane temperatury w przemyśle i laboratorium (mikrobiologiczne lipazy) 60-80°C.

26. Cele i zastosowanie strukturyzowania triacylogłicerołiisTAG)

Strukturyzowane triacylogiicerole to TAG zawierające dokładnie określoną kompozycję i położenie kw. tł. zestryfikowanych z glicerolem. Mogą one być otrzymane metodami enzymatycznymi lub chemicznymi. Zastosowanie lipaz charakteryzujących się stereoselektywnością pozycyjną oraz selektywnością w stosunku do kw. tł. umożliwia uzyskanie czystych sTAG. Metodami chemicznymi otrzymuje się tylko mieszaninę TAG. Zastosowanie sTAG:

51. zastosowanie kliniczne i przemysł kosmetyczny,

52. prod. niskokałorycznych składników cukierków, batonów itp,

15. Metody strukturyzowania triacylogliceroli (sTAG).

Enzymatyczna synteza sTAG może być prowadzona metodą I lub II stopniową.

15. Metody enzymatycznej syntezy sTAG - wymienić, opisać, określić różnice i podać produkty.

Enzymatyczna synteza sTAG może być prowadzona metodą I lub II stopniową.

Metoda jednostopniowa polega na interestryfikacji dwóch triacylogliceroli, zawierających ważne kw. tł. przy użyciu sn-l,3-regioselektywnej lipazy albo na prowadzeniu acydolizy triacyłoglicerolu z dwoma ekwiwalentami kw. tł. lub ich estrów. Wydajność interestryfikacji jest zbliżona do metody chemicznej. Problemem jest trudność w oddzieleniu sTAG od pozostałych triacylogliceroli. Wydajność acydolizy TAG z kw, tł. jest większa, gdyż powstaje mniej produktów ubocznych.

W metodzie dwustopniowej czyste triacylogiicerole lub tłuszcze naturalne poddawane są najpierw alkoholizie z użyciem sn-l,3-regioselektywnej lipazy w celu uzyskania czystych 2-monoacyło-sn-gliceroli (2-MAG), które następnie należy prostą, szybką metodą wydzielić z mieszaniny np. za pomocą krystalizacji. Otrzymane czyste 2-MAG są następnie estryfikowane kw. tł. celem uzyskania sTAG o pożądanych właściwościach. Zastosowanie alkoholizy zamiast hydrolizy zapobiega migracji grup acyłowych z pozycji Sn-1 łub Sn-3. Istotny jest też dobór nośnika do immobiłizacji lipaz, gdyż niektóre materiały mogą wpływać na migrację grup acyłowych.

15. sTAG - co to jest, zastosowanie.

Strukturyzowane triacylogiicerole to TAG zawierające dokładnie określoną kompozycję i położenie kw. tł. zestryfikowanych z glicerolem. Mogą one być otrzymane metodami enzymatycznymi lub chemicznymi. Zastosowanie lipaz charakteryzujących się stereoselektywnością pozycyjną oraz selektywnością w stosunku do kw. tł. umożliwia uzyskanie czystych sTAG. Metodami chemicznymi otrzymuje się tylko mieszaninę TAG. Zastosowanie sTAG:

53. zastosowanie kliniczne i przemysł kosmetyczny,

54. prod. niskokałorycznych składników cukierków, batonów itp.

15. sTAG - co to iest. zastosowanie, metody enzymatycznej syntezy.

Strukturyzowane triacylogiicerole to TAG zawierające dokładnie określoną kompozycję i położenie kw. tł. zestryfikowanych z glicerolem. Mogą one być otrzymane metodami enzymatycznymi lub chemicznymi. Zastosowanie lipaz charakteryzujących się stereoselektywnością pozycyjną oraz selektywnością w stosunku do kw. tł. umożliwia uzyskanie czystych sTAG. Metodami chemicznymi otrzymuje się tylko mieszaninę TAG. Zastosowanie sTAG:

55. zastosowanie kliniczne i przemysł kosmetyczny,

56. prod. niskokałorycznych składników cukierków, batonów itp. Enzymatyczna synteza sTAG może być prowadzona metodą I lub II stopniową.

Metoda jednostopniowa polega na interestryfikacji dwóch triacylogliceroli, zawierających ważne kw. tł. przy użyciu sn~l,3-regioselektywnej lipazy albo na prowadzeniu acydolizy triacyłoglicerolu z dwoma ekwiwalentami kw. tł. lub ich estrów. Wydajność interestryfikacji jest zbliżona do metody chemicznej. Problemem jest trudność w oddzieleniu sTAG od pozostałych triacylogliceroli. Wydajność acydolizy TAG z kw. tł. jest większa, gdyż powstaje mniej produktów ubocznych.

W metodzie dwustopniowej czyste triacylogiicerole łub tłuszcze naturalne poddawane są najpierw alkoholizie z użyciem sn-l,3-regioselektywnej lipazy w celu uzyskania czystych 2-monoacylo-sn-gliceroli (2-MAG), które następnie należy prostą, szybką metodą wydzielić z mieszaniny np. za pomocą krystalizacji. Otrzymane czyste 2-MAG są następnie estryfikowane kw. tł. celem uzyskania sTAG o pożądanych właściwościach.

Zastosowanie alkoholizy zamiast hydrolizy zapobiega migracji grup acyłowych z pozycji Sn-1 lub Sn-3. Istotny jest też dooor nośnika do immobiłizacji lipaz, gdyż niektóre materiały mogą wpływać na migrację srup

31. Enzvmv hydrolizujace wiązania glikozydowe.

-Alfaamylaza to glukonohydrolaza alfa-1,4- glukonu, rozkłada ona skrobię do alfa dekstryn o małych cząsteczkach, oligosacharydów o różnej długości łańcuchów konfiguracji alfa,

-Beta amylaza - maltohydrolaza alfa-1,4 - glukanu, która rozkłada co drugie wiązanie alfa-1,4- glikozydowe poczynając od nie redukcyjnego końca łańcucha, co prowadzi do szybkiego wzrostu redukcyjności. w wyniku jej działania powstają dekstryny o dużych cząsteczkach tak zwane amylodekstryny oraz znaczna ilość maltozy. Nie hydrolizuje wiązań alfa-1,6- glikozydowych, więc całkowicie hydrolizuje do maltozy tylko amylozę, a amylopektynę tylko w około 65%- powstają tak zwane dekstryny graniczne. Nie hydrolizują nieuszkodzonych ziarenek skrobi (np. roztarcie lub zgniecenie ziarenek skrobi podczas przemiału zwiększa ich podatność na działanie teao enzvmu)

- Amylogłukozydazy i glukoamylazy, które rozkładają wiązania alfa-1,4 jak i alfa-1,6 glikozydowe:

9 Glukoamylaza- glukohydrolaza alfa-1,4- glukanu- rozkłada dhigołańcuchowe polisacharydy do glukozy od nieredukującego końca cząsteczki

- Enzymy rozkładające wyłącznie wiązanie a!fal,6- glikozydowe

» Izoamylaza- glikogen- 6-gluanohydrolaza - usuwa rozgałęzienie w glikogen ie i dekstrynach, nie działa na pulłulan

• Puliulanaza typu I- rozkłada najefektywniej wiązania w pullulanie, mniej w amylopektynie, nie działa na glikogen

-beta- D- gałaktozydaza jest enzymem katalizującym reakcje hydrolizy wiązań D- glikozydowych w beta- D-galaktozydach. Najbardziej znanym galaktozydem jest laktoza występująca w mleku.

32. Enzymatyczna modyfikacja węglowodanów, cele i zastosowanie. ??? Obejmuje Hydrolizę i syntezę sacharydów

Znaczenie amylaz. w technologii zbóż jest duże przy produkcji pieczywa a także przy produkcji piwa. Natomiast enzymy pochodzące z drożdży, aktywne w zakresie pH 6-7 wykorzystuje się w przetwórstwie mleka i słodkiej serwatki

Hydroliza laktozy i powstawanie oligosacharydów

beta-D- gałaktozydaza
laktoza _> Mieszanina galakto oligosacharydów

93. Klasyfikacja CAZy.

34. Enzymy amylolityczne - działanie, substraty i produkty, optymalne warunki środowiska.
ENZYMY AMYLOLITYCZNE

Amylazy to ogólna nazwa enzymów hydrolizujących skrobię, do , których należą: alfa amylaza, zaliczana do endoamylaz oraz beta amylaza wszystkie rodzaje amylaz katalizują hydrolizę wiązań alfa-1,4- glikozydowych. przy czym alfa amylaza jako endoamylaza atakue wiązania znajdujące się wewnątrz łańcucha, natomiast beta amylaza i glukoamylaza jako egzoamylazy rozrywają odpowiednio co drugie lub kolejne wiązania glikozydowe, poczynając od nieredukującego końca łańcucha.

W wyniku działania alfa amylazy powstają alfa dekstryny o małej masie cząsteczkowej i niewielka ilość maltozy.

W wyniku działania beta amylazy powstają duże amylodekstryny i znaczna ilość maltozy Środowisko działania

Alfa amylaza jest najbardziej aktywna w środowisku mało kwaśnym (pH 4,7-5) i w temperaturze 51-66 stopni Celsjusza, natomiast beta amylza jest aktywniejsza w środowisku bardziej kwaśnym ale w temp. Około 48-51C. wszystkie alfa amylazy zbożowe są aktywne do 70stopni, powyżej tej temperatury ulegają dezaktywacji.

35. Enzymatyczna hydroliza skrobi w przemyśle - etapy, enzymy, produkty, zastosowanie.

Przemysłowa modyfikacja skrobi obejmuje upłynnianie, scukrzanie i inwersję. Wykorzystywane są w tym celu; a-amylaza, p-amylaza, glukoamylaza, izoamylaza, puliulanaza, izomeraza glukozowa i GGTaza. Po degradacji węglowodanów strukturalnych stosowane są enzymy macerujące, do których zaliczane są celulazy, hemicelulozy i pektynozy

Najczęściej prowadzona jest hydroliza skrobi do glukozy, która dalej jest poddawana enzymatycznej izomeryzacji do fruktozy. Produkcja syropu cukrowego przebiega w dwóch etapach:

-upłynnianie skrobi- przy użyciu termo stabilnej alfa amylazy, wynikiem są dekstryny, głównie maltodekstryny -scukrzanie dekstryn i małtodekstryn- na skutek działania glukoamyłazy często łącznie z izoamylaza lub puliulanaza, jak również puliulanaza i alfa amylaza łączne( dla lepszego efektu)

36. Amylazy- podział, działanie, środowisko. Wśród enzymów katalizujących konwersję skrobi wyróżniamy:

-endoamylazę (amylazy dekstrynujące tak zwane alfa amylazy rozcinające przypadkowo wewnętrzne wiązania alfa- 1,4- glikozydowe amylozy i amyłopektyny).Alfaamyłaza to głukonohydrolaza alfa-1,4- glukonu, rozkłada ona skrobię do alfa dekstryn o małych cząsteczkach, oligosacharydów o różnej długości łańcuchów konfiguracji alfa, w tym niewielkiej ilości maltozy w skutek czego silnie spada lepkość produktów skrobiowych, ale następuje powolny wzrost redukcyjności.

- egzoamylazy- amylazy scukrzające- rozkładające skrobię od końca łańcucha, wśród nich wyróżniamy:

® Beta amyiazę - maltohydrolaza alfa-1 ,4 - glukanu. która rozkłada co drugie wiązanie alfa-1,4-glikozydowe poczynając od nie redukcyjnego końca łańcucha, co prowadzi do szybkiego wzrostu redukcyjności. w wyniku jej działania powstają dekstryny o dużych cząsteczkach tak zwane amylodekstryny oraz znaczna ilość maltozy. Nie hydrolizuje wiązań alfa-1,6- glikozydowych, więc całkowicie hydrolizuje do maltozy tylko amyłozę, a amylopektynę tylko w około 65%- powstają tak zwane dekstryny graniczne. Nie hydrolizują nieuszkodzonych ziarenek skrobi (np. roztarcie lub zgniecenie ziarenek skrobi podczas przemiału zwiększa ich podatność na działanie tego enzymu)

- Amyloglukozydazy i glukoamyłazy, które rozkładają wiązania alfa-1,4 jak i alfa-1,6 glikozydowe:

*> Glukoamylaza- glukohydroiaza alfa-1,4- glukanu- rozkłada długołańcuchowe polisacharydy do glukoz) od nieredukującego końca cząsteczki

- Enzymy rozkładające wyłącznie wiązanie alfa 1,6- glikozydowe

• Izoamylaza- glikogen- 6-gluanohydrolaza - usuwa rozgałęzienie w głikogenie i dekstrynach, nie działa na pullulan

» Puliulanaza typu I- rozkłada najefektywniej wiązania w puliułanie, mniej w amylopektynie, nie działa na giikogen

Środowisko działania

Alfa amylaza jest najbardziej aktywna w środowisku mało kwaśnym (pH 4,7-5) i w temperaturze 51-66 stopni Celcjusza, natomiast beta amylzajest aktywniejsza w środowisku bardziej kwaśnym ale w temp. Około 48-51C. wszystkie alfa amylazy zbożowe są aktywne do 70stopni, powyżej tej temperatury ulegają dezaktywacji.

37. (3-gałaktozydaza - działanie, produkty reakcji.

beta- gałaktozydaza jest enzymem katalizującym reakcje hydrolizy wiązań D- glikozydowych w beta- D-galaktozydach. Najbardziej znanym galaktozydem jest laktoza występująca w mleku. Katalizowana enzymatycznie reakcja hydrolizy wiązania beta- 1,4, glikozydowego w laktozie prowadzi do powstania cząsteczek D- glukozy i D- galaktozy. Niektóre beta-D -galaktozydazy wykazują również zdolność syntezy wiązań glikozydowych, która prowadzi do powstania łańcucha oJigosacbarydowego beta-D- gałaktozydaza

laktoza .-> D- glukoza + D- galaktoza

beta-D- gałaktozydaza

laktoza _> Mieszanina galakto oligosacharydów

Działanie enzymu obejmuje 3 etapy, a ostami z nich decyduje czy zachodzi reakcja hydrolizy czy transglikozydacji

-enzym + laktoza powstaje enzym- laktoza (i)

-enzym- laktoza powstaje galaktozylo- enzym glukoza (II)

-galaktozyl- enzym + akceptor powstaje galaktozyłoakceptor + enzym (III)

38. Galaktooiigosacharydy - co to jest, jak powstaje, znaczenie dla zdrowia, zastosowanie. GALAKTOOLIGOSACHARYDY (GOS)

To węglowodory złożone z cząsteczek D- glukozy i D-galaktozy połączonych wiązaniami głikozydowymi. Tak jak inne NDOS tak i GOS nie ulegają hydrolizie pod wpływem działania ludzkich enzymów trawiennych. Są natomiast substratem reakcji fermentacji prowadzonej przez specyficzne gatunki bakterii zasice([^|gelito grube. Podstawową zaletą GOS i innych oligosacharydów jest zdolność do stymulowania rozwoju i aktywności szczepów Bifidobacterium i Lactobaciłius w okrężnicy. Sprzyja to utrzymaniu równowagi w składzie mikroflory jelitowej, hamuje rozwój bakterii chorobotwórczych np. E. coli i w efekcie zapobiega infekcjom.

Spożywanie oligosacharydów pomaga też w odbudowie naturalnej mikroflory po kuracji antybiotykowej ponadto dieta zawierająca GOS sprzyja obniżeniu poziomu cholesterolu we krwi, zapobiega nadciśnieniu oraz zmniejsza ryzyko powstawania nowotworów jelita grubego. GOS nie ulegają hydrolizie pod wpływem ludzkich enzymów trawiennych i posiadają wartość energetyczna niższą od sacharozy.Stąd GOS stosuje się jako dodatek do żywności głównie jogurtów, słodyczy, napojów, dżemów a także pieczywa. Ich duża zdolność wiązania wody powoduje, że pieczywo długo pozostaje świeże. GOS są odporne na wysoką temp. Czyli zachowują swoje właściwości po obróbce cieplnej żywności. na skale przemysłową GOS produkowane są z laktozy z zastosowaniem enzymów beta- D- galaktozydaz wykazujących aktywność transglikozyiacyjną. Komercyjnie dostępne GOS są mieszaniną galaktooligosacharydów o różnej długości, laktozy oraz D-glukozy i D- galaktozy. Procentowy skład mieszaniny i budowa chemiczna oligosacharydów uzależnione są od źródła enzymu- stężenia substratu i warunków prowadzenia reakcji.

Będą na pewno: białka, lipidy, węglowodany, budowa enzymu, oczyszczanie pyt nr 13-15 któreś ale 14 aa 100% 11 -15 jedno

26-30 będzie z przewaga na 24 lob 25 34-36jedno