stężenie DNA Qubit

1. Przygotuj odpowiednią ilość 0,5 ml probówek potrzebnych do kalibracji oraz na próbki DNA (zwykle 2 probówki do standardów + 1 do badanego DNA)

2. Stwórz roztwór roboczy poprzez zmieszanie 1ul odczynnika EtBr z 199ul buforu.

-przy wykonywaniu kalibracji potrzebne będą 2 próbówki (2x190ul) roztworu roboczego

-dla pojedynczej próby potrzebujemy od 180-199ul roztworu roboczego

Czyli przygotowujemy roztwór na 4 próby (2 standardy + 1 do analizy + 1 próba "na zaś"):

  1. 4 ul EtBr

  2. 4*199 = 796ul buforu

3. Standardy. Oznacz 2 probówki ze standardami:

  1. Do dwóch probówek dodajemy po 190ul roztworu roboczego

  2. do jednej probówki dodaj 10ul jednego standardu

  3. do drugiej probówki dodaj 10 ul drugiego standardu

  4. wymieszaj probówki przez worteksowanie

  5. Na ekranie urządzenia wybierz "dsDNA High Sensivity"

  6. wykonaj procedurę kalibracji "new calibration" na urządzeniu Qubit:

  1. włóż #1 standard, zamknij pokrywę i naciśnij przycisk "read"

  2. włóż #2 standard, zamknij pokrywę i naciśnij przycisk "read"

4. Próby. (Ilość dodawanego DNA jest w zakresie 1-20ul, roztworu roboczego: 180-199ul):

  1. Przenieś po 199ul roztworu roboczego do probówki do której dodasz DNA.

  2. uzupełnij próbę ilością odpowiednią ilościa DNA (tutaj: 1ul); w probówce ma być 200ul

  3. Próbę inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty

  4. Na ekranie urządzenia wybierz "dsDNA High Sensivity" i pomiń kalibrację.

  5. włóż pierwszą próbę i naciśnij przycisk "read"

  6. urządzenie wyświetli wynik w ug/ml

  7. można go przekształcić na ng/ul w celu użycia do PCR, po naciśnięciu przycisku "convert" i wybraniu ilości DNA jaką użyliśmy w próbie (tutaj: 1ul)



Zamiast dokonywania obliczeń przez komputer, możemy sami obliczyć ilość DNA z proporcji:

wynik urządzenia (0,238 ug/ml) --- dodana objętość DNA (1ul)

(szukana wartość ng/ml) --- 200ul (objętość całkowita próby)

wynik = 47,6 ng/ml

Aby wykorzystać te dane do reakcji PCR odczytujemy z jej metodyki jakie stężenie matrycy jest nam potrzebne (np. 40ng/ml):

użyta objętość DNA (tutaj: 1ul) ------- wynik (47,6 ug/ml)

szukana objętość do PCR ------- stężenie matrycy (tu: 40ng/ml)

Do PCR-u potrzebujemy: 0,84 ul DNA


Wyszukiwarka