Genetyka molekularna KONTROLA POCHODZENIA PRZY POMOCY ANALIZY SEKWENCJI MIKROSATELITARNYCH

Charakterystyka sekwencji mikrosatelitarnych - zbudowane z 1-6 nukleotydowych powtorzen, tandemowo ulozonych, tworzacych sekwencje o dlugosi kilkuset par zasad, moga wystepowac jako identyczne powtorzenia np (AGAT)8, (CA)15 lub podzielona kretokimi wstawkami np (AT)5(GC)7(AT)4
Mikrosatelity to sekwencje wysoce polimorficzne - nawet kilkadziesiąt alleli w danym locus. Zmiennosc ta zalezy od liczby kopii powtorzonego w danym locus motywu

Dwie teorie powstawania polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych :

1) Błąd polimerazy podczas replikacji DNA (tzw. slizganie się polimerazy)

2) Błąd podczas wymiany chromatyd chromosomów homologicznych - niesymetryczny crossing-over

Sekwencje występują w genomach ssaków z dużą czestością i rownomiernym rozproszeniem (np w genomie czlowieka raz na 6kpz). Najczęstszym powtrarzającym się motywem jest (CA)n/(GT). W genomie ludzkim i swini domowej sekwencja ta pojawia się w 50 000 - 10 000 loci tzn ze srednia odleglosc miedzy kolejnymi mikrosdatelitami wynosi ok 30kpz

Dla porownania u szczura, myszy i owcy odległosci te wynoszą odpowiednio 21 kpz, 18 kpz, 65 kpz.

W celu określenia stopnia przydatności mikrosatelitów do kontroli pochodzenia oraz mapowania genetycznego a takze oceny wiarygodności uzyskiwanych wyników oblicza się następujące wskazniki: HET ( heterozygotycznosc), PIC (indeks stopnia polimorfizmu), PE (wspolczynnik wykluczenia)

Wspolczynnik heterozygotyczności HET:: parametr charakteryzujący zmiennosc genetyczną populacji. Jest to prawdopodobienstwo, ze przypadkowy osobnik jest heterozygotą pod względem alleli wystepujacych w danym szeregu alleli. Wartość zawiera sie w przedziale od 0 do 100%. Mozna obliczyc wspolczynnik heterozygotycznosci dla danego locus korzystajac ze wzoru HET= 1 - SUMAqi2, gdzie HEt- wspolczynnik hetrerozygotycznosci dla danego locus , qi- frekwencja i -tego allelu w badanym locus]

Ideks stopnia polimorfizmu ( PIC): jest to prawdopodobienstwo, ze na podstawie genotypu w locus danego osobnika bedzie mozna wskazac ktory allel pochodzi od matki a ktory od ojca. Jest to parametr charakteryzujący stopien zmiennosci (polimorfizmu) danego locus. Wartosc zawiera sie w przedziale od 0 do 1 lub od 0 do 100%. Najczesciej zluzy do okreslenia przydatnosci danego markera do analizy sprzezen z innymi loci

PIC= 1- (sumapi2)- suma suma 2pi2xpj2, gdzie pi-b czestosc i-tego allelu w populacji, pj- czestosc j-tego allelu w populacji

Im bardziej parametry HET i PIC zblizaja sie do jednosci tym dany marker jest bardziej uzyteczny w poirzadzaniuy map genetycznych. Przyjmuje sie ze markery o PIC.0,7 najlepiej nadaja sie do badania sprzezen i moga byc wykorzystywane do analizy pochodzenia.

Wspolczynnik wykluczenia PE
PE= sumaqi(1-qi)2-suma(qiqj)2[4-3(qi+qj)]

gdzie qi i qj to czestosci allelu i-tego i j-tego w populacji;dla poijhedynczych locus (przy posiadanych informacjach o obojf=gui rodzicach)

Wspolczynnik wykluczenia jest to prawdopodobinstwo z jakiom moizwemy okreslic prawdziwych rodzicow przy kontroli pochodzenia np jesli wspolczynnik wynosi 95% oznacvza to ze w 5 przypoadkach na 100 mozemy popelnbic blad przy okreslaniu genotypow rodzicow, im wspolczynnik PE wyzszy, tym mjniejsze prawdopodobinestwo ze popelnimy błąd przy wykluczaniu rodzicow

Kontrola pochodzenia- przebieg doswiadczenia z uzyciem automnatycznego sekwentora

1. Izolacja DNA

2. reakcja PCR (najczesciej PCR-multipleks) z zastopsowaniem starterow znakowanych fluorochromem np Cy5

3. Przygotowanie zelu poliakryalamidowego zawierajacego czynnjik denaturujący - mocznik. W warunkach denaturujących rozdzial zachodzi jedynie na podstawie dlugosci czasteczki DNA. Mozliwe jest precyzyjne okjreslenie długości rozdzielanych fragmnentow DNA, aby zidentyfikowac poszczegolne allele

4. Przygotowanie prób - produkty PCR += bufor denaturujący, zawierajacy formamid

5. denaturacja termiczna prób

6. Nałożenie prób na żel w automatycznym sekwentorze i rozdzial elektroforetyczny. Czas trwania rozdzialu to kilka godzin

Automatyczny sekwentator pozwala na rozdział i analizę fragmentow DNA roznicaych się długością o 1 nukleotyd

Sekwentory plytowe i kapilarne

sekwenator plytowy- rozdizl w stalym zelu poliaktylamidowym pomiedzy szkalnymi płytami

sekwenator kapilarny- rozidzial w plynnym polimerze w kapilarach o srednicy 50-100 mikrometrow i dlugosci kilkudziesieciu cm

7. Analiza wyników - wyniki w formie pików

Zastosowanie markerow wielkosci pozwala na dokladne okreslenie dlugosci rozdzielanych fragmentow DNA

Marker wielkosci zewnetzrny i wewnetrzny

Przesłanki do wykonania badan:

-werfyikacja zapisow rodowodowych

-pomoc w ustaleniu ojca w przypadku podwojnych kryć

- podkladanie szczeniat pochodzacych z innych miotów

- identyfikacja znalezionych zwierzat (np pochodzacych z kradziezy lub zaginionych)

- podejrzenia o fałszerstwa w dokumentacji hodowlanej

Aktualne trendy w badanich kontroli pochodzenia zwierzat: idejscie od sekwenatorow plytowych i proiwadzenie analiz sekwenatorowych kapilarnych, analizy wykorzystujace polimorfizmy typu SNP (mikromacierze SNP)